Mcanismes biochimiques

Le stress oxydant
Intrt conceptuel et exprimental dans la comprhension des mcanismes des maladies et potentiel thrapeutique
Alain Favier

Abstract

Mots-cls Key-words

The oxidative stress: concept and experimental interest to understand diseases mechanisms and therapeutic approaches Free radicals and their precursors are members of a reactive chemical family named reactive oxygen species. Living beings use their beneficial reactivity in a lot of processes, as weapon in defence mechanisms or as signal inside or inter cells. So a useful level of beneficial reactive species is maintained inside cell by an equilibrium between the generating system producing free radicals such as mitochondrial respiration, phagocytosis, redox cycle or radiations, and the antioxidant systems such as scavenger molecules absorbed from the diet (vitamin C, E, carotenoids, polyphenols) or produced endogenously (glutathione, thioredoxin) or such as antioxidant enzymes (superoxide dismutases, glutathione peroxidases). Unfortunately an oxidative stress may occur, resulting from a desequilibrium between prooxidant sources of radicals and antioxidant systems. Oxidative stress will damage intracellular macromolecules, oxidizing lipids, DNA or proteins. Many cellular dysfunctions result from these biochemical damages, variable according to the level of stress: excess in cell proliferation, cell death by apoptosis, lipid deposition, mutagenesis. By creating such disorders, oxidative stress is partly responsible from a great number of age-related diseases as cancer, cardiovascular disorders, neurodegenerative diseases as Alzheimer disease. So many therapeutical strategies have been tested in animal and human to prevent the occurrence of these oxidative diseases. They use nutritional improvement of antioxidant capacities, plant or chemical antioxidants. Chemists designed various new molecules chelating iron, scavenging free radicals or catalysing destruction by miming the activity of antioxidant enzymes. But new ways of research have to be now explored to create more specific and tissue targeted molecules able to regulate the intracellular level and not only to destroy oxygen radicals. Antioxydant, stress oxydant, radicaux libres, maladies. Antioxidant, stress, free radicals, diseases.

Depuis quelques annes, le monde des sciences biologiques et mdicales est envahi par un nouveau concept, celui du stress oxydant , c'est--dire d'une situation o la cellule ne contrle plus la prsence excessive de radicaux oxygns toxiques, situation que les chercheurs impliquent dans la plupart des maladies humaines. Qu'en est-il exactement ? Est-ce une mode ou une ralit, et dans ce cas, pouvons-nous trouver de nouvelles armes mdicamenteuses pour lutter contre ce phnomne ?

que la balance antioxydants/prooxydants est en quilibre. Si tel n'est pas le cas, que ce soit par dficit en antioxydants ou par suite d'une surproduction norme de radicaux, l'excs de ces radicaux est appel stress oxydant . Cette rupture d'quilibre, lourde de consquence, peut avoir de multiples origines. L'organisme peut avoir faire face

Glossaire
Adduit Fixation dune molcule sur une des bases de lADN par une liaison covalente pouvant parfois former un pont intra-catnaire entre les deux chanes de lADN. Cytosol Liquide contenu lintrieur des cellules. Facteur de transcription Protine permettant la lecture dun gne lorsquelle se fixe sur son promoteur. Radical libre Espce chimique possdant un lectron non appari. Rgulon Chez les bactries, ensemble contigu de gnes codant pour des protines et de gnes codant pour des protines rgulatrices. Sites abasiques Partie de lADN dpourvue dune base purique ou pyrimidique et ayant perdu linformation gntique par rupture de la liaison entre une base et le dsoxyribose. Xnobiotique Molcule trangre, susceptible de pntrer dans le corps humain.

Origine du stress oxydant

La dcouverte d'espces chimiques radicalaires prsentes normalement dans l'organisme a boulevers notre comprhension des mcanismes biologiques. Ces radicaux libres sont produits par divers mcanismes physiologiques car ils sont utiles pour l'organisme dose raisonnable ; mais la production peut devenir excessive ou rsulter de phnomnes toxiques exognes et l'organisme va devoir se protger de ces excs par diffrents systmes antioxydants. Dans les circonstances quotidiennes normales, des radicaux libres sont produits en permanence en faible quantit comme les mdiateurs tissulaires ou les rsidus des ractions nergtiques ou de dfense, et cette production physiologique est parfaitement matrise par des systmes de dfense, d'ailleurs adaptatifs par rapport au niveau de radicaux prsents. Dans ces circonstances normales, on dit

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une production beaucoup trop forte pour tre matrise, qui sera observe dans les intoxications aux mtaux lourds, dans l'irradiation, dans les ischmies/reperfusions suivant des thromboses. La rupture d'quilibre peut provenir d'une dfaillance nutritionnelle ou de la carence en un ou plusieurs des antioxydants apports par la nutrition comme les vitamines ou les oligo-lments, prsents en quantit limite dans l'alimentation franaise. Enfin, la mauvaise adaptation peut rsulter d'anomalies gntiques responsables d'un mauvais codage d'une protine soit enzymatiquement antioxydante, soit synthtisant un antioxydant (comme la gamma glutamyl synthtase produisant le glutathion), soit rgnrant un antioxydant, soit couplant la dfense l'nergie (comme la G6PD), soit d'un promoteur de ces mmes gnes que la mutation rendra incapable de ragir un excs de radicaux. Gnralement, le stress oxydant sera la rsultante de plusieurs de ces facteurs et se produira dans un tissu et un type cellulaire bien prcis, objet de la dfaillance et non pas dans tout l'organisme.

Les radicaux libres de la biologie

Parmi toutes les espces radicalaires susceptibles de se former dans les cellules, il convient de distinguer un ensemble restreint de composs radicalaires qui jouent un rle particulier en physiologie et que nous appellerons radicaux primaires. Les autres radicaux libres, dits radicaux secondaires, se forment par raction de ces radicaux primaires sur les composs biochimiques de la cellule. Ces radicaux primaires drivent de l'oxygne par des rductions un lectron tels l'anion superoxyde O2- et le radical hydroxyle OH, ou de l'azote tel le monoxyde d'azote NO [1]. D'autres espces drives de l'oxygne dites espces actives de l'oxygne, comme l'oxygne singulet 1O2, le peroxyde d'hydrogne (H2O2) ou le nitroperoxyde (ONOOH), ne sont pas des radicaux libres, mais sont aussi ractives et peuvent tre des prcurseurs de radicaux. L'ensemble des radicaux libres et de leurs prcurseurs est souvent appel espces ractives de l'oxygne (figure 1). Il ne faut pas penser que tous les radicaux de l'oxygne sont extrmement ractifs, cette ractivit tant trs variable selon la nature du radical. Ainsi parmi les radicaux forms chez les tres vivants, l'anion radicalaire superoxyde (O2) comme le monoxyde d'azote (NO) ne sont pas trs ractifs, mais constituent des prcurseurs d'autres espces plus ractives. La faible ractivit de ces deux radicaux permet d'ailleurs leur utilisation par l'organisme comme mdiateurs rgulant des fonctions biologiques telles la vasodilatation capillaire, la prolifration ou le message de neurones. En revanche, des radicaux comme les radicaux peroxyles (ROO) ou surtout le radical hydroxyle (HO) sont extrmement ractifs, et ce avec la plupart des molcules des tissus vivants. Ces radicaux libres de l'oxygne ou de l'azote, mme ractifs, ne sont pas uniquement toxiques ; au contraire, ils sont produits par divers mcanismes physiologiques afin de dtruire des bactries au sein des cellules phagocytaires (macrophages, polynuclaires) ou pour rguler des fonctions cellulaires ltales telle la mort cellulaire programme ou apoptose. Les tres vivants trouvent leur nergie dans la respiration mitochondriale dont la dernire tape rduit par quatre lectrons la molcule d'oxygne sans librer d'espces radicalaires. Toutefois, au contact entre l'oxygne et certaines protines du systme de la respiration, une production d'anions superoxydes se produit lors du

Figure 1 - Origine des diffrents radicaux libres oxygns et espces ractives de loxygne impliqus en biologie.

fonctionnement de la chane respiratoire mitochondriale, production que l'on peut comparer aux invitables dchets des centrales industrielles d'nergie. Si usuellement cette production de radicaux superoxydes reste faible et ne concerne qu'un faible pourcentage de l'oxygne utilis par la respiration (environ 2 %), elle peut s'amplifier lorsque la respiration devient plus intense (effort physique, hyperoxie), ou lorsque interviennent des dsordres inflammatoires (effet du TNF ) ou nutritionnels (carence en ubiquinone), qui augmentent avec lge. L'inflammation est par ailleurs une source importante de radicaux oxygns produits directement par les cellules phagocytaires actives qui sont le sige d'un phnomne appel explosion oxydative consistant en l'activation du complexe de la NADPH oxydase, enzyme capable d'utiliser l'oxygne molculaire pour produire de grandes quantits d'anions superoxydes au niveau de la membrane cellulaire. Ce mcanisme, lorsqu'il est contrl, est capital dans la lutte anti-infectieuse car il permet la phagocytose des bactries et des corps trangers. Une autre espce radicalaire, le monoxyde d'azote, est elle aussi produite par les systmes enzymatiques que sont les diffrentes NO synthases (ou NOS), des fins de mdiation par les neurones, les cellules endothliales ou les macrophages. Rappelons que la production concomitante dans un mme lieu de NO et de superoxyde s'avre trs dommageable en donnant naissance au peroxynitrite. Des sources importantes de radicaux libres sont les mcanismes de cycles redox que produit dans lorganisme l'oxydation de molcules comme les quinones. Ce cycle redox a lieu soit spontanment, soit surtout lors de l'oxydation de ces composs au niveau du cytochrome P450. Ce mcanisme est souvent incrimin pour expliquer la toxicit de l'alcool, des rsidus de la fume de cigarette, ou de nombreux mdicaments ; mais il se produit aussi avec des composs endognes comme l'acide lvulinique et surtout les catcholamines. Les mtaux toxiques (chrome, cuivre, vanadium), mais aussi le cuivre et le fer libres (existant lors de surcharges gnrales ou localises) gnrent des radicaux hydroxyles, trs ractifs, partir de l'espce peu ractive H2O2, par une raction appele raction de

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Fenton. Les particules inhales (amiante, silice) sont aussi des sources de radicaux libres, d'une part parce qu'elles exacerbent la phagocytose, d'autre part parce que leur surface est tapisse de sels de fer. Les rayonnements sont capables de gnrer des radicaux libres, soit en scindant la molcule d'eau lorsqu'il s'agit des rayons ionisants X ou , soit en activant des molcules photosensibilisantes lorsqu'il s'agit des rayons ultraviolets qui vont par ce mcanisme produire des anions superoxydes et de l'oxygne singulet.

Un paradoxe : les radicaux libres sont-ils indispensables la vie ?

Le paradoxe des radicaux libres en biologie est quils constituent des espces extrmement dangereuses, susceptibles d'engendrer un nombre considrable de maladies, tout en tant des espces indispensables la vie. Ils remplissent en effet de trs nombreuses fonctions utiles qui, part la phagocytose, ont t dcouvertes rcemment. Les radicaux libres participent au fonctionnement de certaines enzymes, la transduction de signaux cellulaires, la dfense immunitaire contre les agents pathognes, la destruction par apoptose des cellules tumorales, au cycle cellulaire, la diffrentiation cellulaire, la rgulation de la dilatation capillaire, au fonctionnement de certains neurones et notamment ceux de la mmoire, la fcondation de l'ovule, la rgulation des gnes, phnomne appel contrle redox des gnes. La phagocytose des bactries et parasites par les macrophages ou les polynuclaires s'accompagne d'une production d'espces ractives de l'oxygne si brutale et intense qu'elle est connue, depuis les travaux de Baldridge sur le polynuclaire en 1933, sous le nom de burst oxydatif , c'est--dire explosion respiratoire. Au sein du phagosome, l'activation de la NADPH oxydase et l'action des superoxydes dismutases (SOD) et NOS aboutissent un mlange trs corrosif de O2, H2O2, HO, ONOOH, avec en plus dans le polynuclaire HOCl et 1O2. Ce mlange ractionnel, que l'Homme a imit en utilisant comme dsinfectant l'eau de javel ou l'eau oxygne, dtruit par oxydation l'ensemble des composants bactriens. Les radicaux libres constituent aussi un systme de transmission de signaux, sans doute apparu trs tt dans l'volution de la vie. Ce systme est prsent dans les tres unicellulaires qui ragissent l'oxygne du milieu ambiant en adaptant leurs systmes de dfense, et il s'est conserv chez les tres volus, y compris les mammifres, qui se sont dots de systmes cellulaires de production de radicaux libres et de systmes de dtection et de transduction du signal. Les radicaux oxygns peuvent donc tre considrs comme des messagers intra et extracellulaires. Ils permettent d'induire la rponse cellulaire de nombreux stress, thermiques, ultraviolets, xnobiotiques, permettant l'expression de gnes de dfense. Chez les bactries, les gnes de dfense contre le stress oxydant sont organiss en rgulon : un gne exprime un premier facteur de transcription qui, aprs activation par un driv oxygn, va activer le gne d'un deuxime facteur de transcription ubiquitaire pour un ensemble de systmes antioxydants. Ainsi, il existe plusieurs ensembles de gnes mis en jeu lors des stress oxydants chez E. coli : le rgulon oxyR-oxyS dont l'expression aboutit la synthse de 9 protines en une vingtaine de minutes aprs activation par H2O2, le rgulon soxR-soxS dont l'expression aboutit la synthse de nombreuses enzymes antioxydants (la

SOD-Mn, l'endonuclase IV, la glucose 6 phosphate dshydrognase qui fournira le NADPH ncessaire la glutathion rductase, une paraquat rductase qui paradoxalement produit O2, la protine ribosomiale S6, et la porine membranaire OmpF). Chez l'Homme, les gnes antioxydants les plus inductibles par un stress oxydant sont ceux de la superoxyde dismutase manganse, de la catalase, de la ferritine, de l'hme oxygnase, de la glutamyl-cystine synthase, de la iNO synthase, de la thioredoxine, de l'HSP 70, des mtallothionines, alors que ceux de la superoxyde dismutase Cu-Zn et de la glutathion peroxydase sont peu inductibles [2]. Cette inductibilit des gnes antioxydants explique le phnomne d'adaptation au stress oxydant des cellules et des animaux qui exposs rgulirement de faibles doses deviennent rsistants de fortes doses de radicaux oxygns. Mais les espces actives de l'oxygne peuvent aussi activer des gnes de fonctions cellulaires autres que ceux de la lutte contre les radicaux libres, ceci par l'intermdiaire de facteurs redox sensibles comme AP1, HIF-1 ou NF-KB [3]. Ainsi, les gnes des cytokines TNF, IL1, IL6, de la lipoprotine lipase, de la collagnase, de l'aldose rductase, des oncognes c-jun et c-fos, de GADD153, de p21(waf1/cip1), de ELAM 1 et ICAM 1, de la tyrosine protine phosphatase, de la actine ou de l'ornithine dcarboxylase sont activs par les espces oxygnes, alors que ceux de la PEPCK et de l'activateur du plasminogne sont inversement inhibs par les espces actives de l'oxygne. Les radicaux libres peuvent aussi servir de relais physiologiques entre cellules diffrentes, dans la stimulation de certains rcepteurs membranaires et rgulent de nombreuses fonctions comme la vasodilatation des vaisseaux, la prolifration cellulaire. Dans des circonstances dramatiques, ils seront des signaux de mort cellulaire lorsque les capacits de rparation seront dpasses. L'effet du stress oxydant sur la transduction du signal a dj fait l'objet de plusieurs revues montrant que ce concept est dsormais accept en nutrition, immunologie, diabtologie ou cancrologie [4]. Les radicaux oxygns pourraient mme tre les premiers responsables de l'activation des kinases en cas de rponse des agressions comme l'irradiation, les cytokines inflammatoires ou les carcinognes chimiques. Ayant besoin d'une certaine quantit d'espces ractives de l'oxygne, l'organisme ne cherche donc pas les dtruire mais contrler leur niveau pour viter le stress oxydant. Ceci explique la rgulation trs fine du gnome antioxydant et de ses mcanismes d'adaptation. La thrapeutique antioxydante ne doit pas oublier ces activits utiles des radicaux libres sous peine d'chec, voir d'effets toxiques paradoxaux, tel l'effet procarcinogne observ dans certaines tudes de supplmentation par des doses trs leves de carotne.

Le contrle des radicaux libres par la cellule

Les cellules utilisent de nombreuses stratgies antioxydantes et consomment beaucoup d'nergie pour contrler leur niveau d'espces ractives de l'oxygne. Certains composs antioxydants comme les vitamines E (tocophrol), C (ascorbate), Q (ubiquinone), ou les carotnodes apports par les aliments, agissent en pigeant les radicaux et en captant l'lectron clibataire, les transformant en molcules ou ions stables [5]. La vitamine pigeuse va devenir un radical, puis sera soit dtruite, soit rgnre par un autre systme. Ainsi, la vitamine E est rgnre par la vitamine C qui est

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elle-mme rgnre par des enzymes, les ascorbates rductases [6]. Ce type d'antioxydant est appel pigeur ou boueur ( scavenger pour les Anglo-saxons). De trs nombreux composs alimentaires peuvent aussi avoir ce comportement : polyphnols, alcalodes, phytates [7]. Il existe de plus des composs endognes synthtiss par les cellules et jouant le mme rle ; le plus important est le glutathion rduit qui protge non seulement contre les radicaux oxygns, mais aussi contre les peroxydes ou le NO. D'autres composs endognes jouent un rle sans doute important mais encore mal valu : les thioredoxines, les glutaredoxines, les mtallothionines, l'acide lipoque ou les polyamines. La plupart des composs biologiques ragissant avec (donc pigeant) le radical hydroxyle, il conviendra de rserver le terme d'antioxydant des composs dont la teneur dans les tissus diminue lors d'un stress oxydant in vivo et qui ne donnent pas de drivs toxiques. L'autre stratgie utilise est de nature enzymatique, visant dtruire les superoxydes et peroxydes. Ainsi, les superoxydes dismutases sont capables dliminer lanion superoxyde par une raction de dismutation, formant avec deux superoxydes une molcule d'oxygne et une molcule de peroxyde d'hydrogne. Les superoxydes dismutases existent sous plusieurs isoformes dont la structure densemble est trs bien conserve lors de lvolution, formant un puits hydrophobe au centre de la protine dans lequel se glisse lanion superoxyde [8]. Le mcanisme ractionnel est catalys par un mtal situ au cur de lenzyme dont la nature permettra de distinguer les superoxydes dismutases manganse (MnSOD) protgeant la mitochondrie, des superoxydes dismutases cuivre-zinc protgeant le cytosol (cCu-ZnSOD), la face externe de la membrane des cellules endothliales (ecCu-ZnSOD) ou le plasma sanguin (pCu-ZnSOD). Les principales enzymes capables de dtruire le peroxyde d'hydrogne sont les catalases cofacteur fer, prsentes dans les hmaties et les peroxysomes hpatiques, et les glutathions peroxydases cofacteur slnium [9]. Des glutathions peroxydases slnium existent dans le cytosol (cGPX) dans le plasma (pGPx), au niveau de la membrane cellulaire (HPGPx), et une isoenzyme est spcifique des cellules digestives (GIGPx). Ces enzymes sont sans doute le principal systme de protection car elles dtruisent non seulement H2O2, mais aussi les peroxydes organiques toxiques forms par oxydation des acides gras ou du cholestrol. L'activit de ces enzymes est trs dpendante de l'apport nutritionnel en slnium. Le rle des SOD et des peroxydases est complmentaire car une bonne protection ne peut tre obtenue par les superoxydes dismutases seules (figure 2). Il existe de nombreuses autres enzymes antioxydantes comme les peroxyredoxines, l'hme oxygnase, la glutathion transfrase, les thioredoxines rductases ou les thioredoxines peroxydases. La plupart des enzymes dcrites ci-dessus, de mme que les enzymes de rparation des dommages oxydants, vont utiliser un donneur dquivalent rducteur, le NADPH, qui constitue avec le glutathion les plaques tournantes de la dfense antioxydante. La production d'nergie ne semble pas ici en elle mme capitale (la diminution de lATP facilitant mme la formation du NADPH).

Figure 2 - Mode daction des principaux systmes enzymatiques antioxydants et de leurs cofacteurs mtalliques.

l'ADN, des protines, des lipides, des glucides), mais aussi des lsions secondaires dues au caractre cytotoxique et mutagne des mtabolites librs notamment lors de l'oxydation des lipides. L'organisme peut aussi ragir contre ces composs anormaux par production d'anticorps, qui malheureusement peuvent aussi tre des auto-anticorps crant une troisime vague d'attaque chimique.

Consquences biochimiques
Les lipides et principalement leurs acides gras polyinsaturs sont la cible privilgie de l'attaque par le radical hydroxyle capable d'arracher un hydrogne sur les carbones situs entre deux doubles liaisons, pour former un radical dine conjugu, oxyd en radical peroxyle. Cette raction appele peroxydation lipidique forme une raction en chane car le radical peroxyle form se transforme en peroxyde au contact d'un autre acide gras qui forme un nouveau radical dine conjugu [10]. Les hydroperoxydes peuvent subir plusieurs modes d'volution : tre rduits et neutraliss par la glutathion peroxydase ou continuer s'oxyder et se fragmenter en aldhydes acides et en alcanes (thane, thylne, pentane) qui, de par leur volatilit, sont limins par voie pulmonaire. Le radical peroxyle, aprs volution en un peroxyde cyclique et coupure de la molcule, peut librer diffrentes aldhydes toxiques dont le malonaldialdhyde ou l'hydroxynonenal. La transmission en chane de la raction de peroxydation lipidique est stoppe par la vitamine E intercale dans la bicouche lipidique des membranes (figure 3). Cette attaque des lipides peut concerner les lipoprotines circulantes ou les phospholipides membranaires. Les consquences seront diffrentes : l'attaque des lipides circulants aboutissant la formation de LDL (lipoprotines de densit lgre) oxydes qui, captes par des macrophages, formeront le dpt lipidique de la plaque d'athrome des maladies cardiovasculaires, l'attaque des phospholipides membranaires modifiant la fluidit de la membrane et donc le fonctionnement de nombreux rcepteurs et transporteurs et la transduction des signaux. Bien que l'ADN soit la mmoire de toute la composition biochimique des tres vivants, il s'agit d'une molcule trs sensible l'attaque par les radicaux de l'oxygne. Au bas mot, cinq classes principales de dommages oxydatifs mdis par

Les consquences du stress oxydant

La production excessive de radicaux libres provoque des lsions directes de molcules biologiques (oxydation de

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Figure 3 - Mcanisme en chane de la peroxydation des acides gras polyinsaturs et nature des produits terminaux forms.

OH peuvent tre gnres. Parmi elles, les bases oxydes, les sites abasiques, des adduits intra-catnaires, des cassures de brins et des pontages ADN-protines [11]. Les bases qui composent l'ADN, et particulirement la guanine, sont sensibles l'oxydation. L'attaque radicalaire peut tre directe et entraner l'oxydation des bases, engendrant un grand nombre de bases modifies : 8 oxo guanine, 8 nitro guanine, formamidopyrimidine, 8 oxo adnine, formimido uracile, 5 hydroxy cytosine, 5 hydroxy mthyl uracile, thymine diol, oxazolone. Un trs grand nombre de ces composs et de leurs mcanismes de formation ont t identifis dans notre laboratoire. Mais le stress oxydant peut aussi attaquer la liaison entre la base et le dsoxyribose, crant un site abasique, ou attaquer le sucre lui-mme, crant une coupure de chane simple brin. Des dommages indirects peuvent rsulter de l'attaque des lipides dont la peroxydation gnre des aldhydes mutagnes, formant des adduits sur les bases de l'ADN de type MDA-guanine ou thnodrivs. L'attaque radicalaire des protines qui sont trs nombreuses entrer en contact avec l'ADN pour le protger (histones) ou pour le lire (enzymes et facteurs de la rplication ou de la transcription), entrane des pontages des protines ou des adduits sur des bases de type lysinoguanine. Le rle des nombreux mtaux fixs l'ADN, qui est un polyanion (Fe, Mg, Zn, Cu, Ni, Cd...), est crucial pour amplifier ou orienter le profil de ces lsions. Cette attaque de l'ADN est quotidienne puisque le nombre de lsions se formant chaque jour dans une cellule est estim 104. Heureusement, la fidlit de la squence des 4.109 paires de bases de notre ADN cellulaire est maintenue depuis des milliers d'annes et dans des milliards de cellules grce des systmes de rparation perfectionns, dont les principaux sont la rparation par excision de base (BER) ou par excision de nuclotide (NER), couples ou non la transcription, le systme de rparation des misappariements et la rparation par recombinaison (figure 4). Malheureusement, ce beau mcanisme peut se drgler soit par une surcharge de lsions en cas de stress

massif, soit par un mauvais fonctionnement de ces systmes de rparation chez des sujets dficients en cofacteurs (thioredoxines, zinc) ou atteints d'une anomalie gntique. Dans ce cas, les lsions non rpares vont perturber les mcanismes de rplication de l'ADN et entraner soit des erreurs de lecture et de synthse par des ADN polymrases translsionelles infidles aboutissant une mutation ponctuelle dans le gnome, soit une impossibilit de copie de l'ADN qui aboutira la mise en route du suicide programm des cellules par un mcanisme appel apoptose. In fine, cette modification de l'ADN induit des mutations par transversions GC (guanine/cytosine) vers TA (thymine/adnine) souvent observes spontanment dans les cellules cancreuses. Ces sont les premires tapes de la carcinogense et ce n'est pas une concidence si les agents carcinognes sont tous des gnrateurs puissants de radicaux libres (radiations ionisantes et UV, fume, alcool, fibres d'amiante, mtaux carcinognes, hydrocarbures polycycliques). Si la chimie de l'attaque radicalaire des polysaccharides a t beaucoup moins tudie que celle des autres macromolcules, il n'en demeure pas moins que les espces ractives de l'oxygne attaquent les mucopolysaccharides et notamment les protoglycanes du cartilage. Par ailleurs, le glucose peut s'oxyder dans des conditions physiologiques, en prsence de traces mtalliques, en librant des ctoaldhydes, H2O2 et OH, qui entraneront la coupure de protines ou leur glycation par attachement du ctoaldhyde, formant un driv AGE. Ce phnomne de glycosoxydation est trs important chez les diabtiques et contribue la fragilit de leurs parois vasculaires et de leur rtine. Les protines les plus sensibles aux attaques radicalaires sont surtout celles qui comportent un groupement sulfhydryle (SH). Cest le cas de nombreuses enzymes cellulaires et protines de transport qui vont ainsi tre oxydes et inactives. Dautres lsions irrversibles conduisent la formation d'un intermdiaire radicalaire. Les protines peuvent alors soit subir des rticulations par formation notamment de ponts bi-tyrosine dtectables par leur fluorescence, soit subir des coupures en cas d'agression forte, soit des modifications de certains acides amins en cas d'agressions modres. Les protines modifies par oxydation perdent leurs proprits biologiques

Figure 4 - Lsions de lADN formes par attaque radicalaire du patrimoine gntique des cellules.

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(enzyme, anti-enzyme, rcepteur...) et deviennent beaucoup plus sensibles l'action des protases et notamment du protasome. Les protines oxydes deviennent aussi trs hydrophobes, soit par suppression de groupements amines ionisables, soit par extriorisation de zones hydrophobes centrales. Elles vont alors former des amas anormaux dans ou autour des cellules. Ces amas, associs aux lipides, forment les dpts de lipofuschines caractristiques des tissus des sujets gs. Les consquences biologiques du stress oxydant seront extrmement variables selon la dose et le type cellulaire. De lgers stress augmenteront la prolifration cellulaire et l'expression de protines d'adhsion, des stress moyens faciliteront l'apoptose, alors que de forts stress provoqueront une ncrose et des stress violents dsorganiseront la membrane cellulaire, entranant des lyses immdiates. De nombreuses autres anomalies biologiques sont induites par le stress oxydant : mutation, carcinogense, malformation des ftus, dpt de protines anormales, fibrose, formation d'auto-anticorps, dpt de lipides oxyds, immunosupression.

Les maladies lies au stress oxydant

Le stress oxydant est impliqu dans de trs nombreuses maladies comme facteur dclenchant ou associ des complications de l'volution. La multiplicit des consquences mdicales de ce stress n'a rien de surprenant car, selon les maladies, celui-ci se localisera un tissu et des types cellulaires particuliers, mettra en jeu des espces radicalaires diffrentes et sera associ d'autres facteurs variables et des anomalies gntiques spcifiques chaque individu. La plupart des maladies induites par le stress oxydant apparaissent avec l'ge car le vieillissement diminue les dfenses antioxydantes et augmente la production mitochondriale de radicaux [13]. En faisant apparatre des molcules biologiques anormales et en surexprimant certains gnes, le stress oxydant sera la principale cause initiale de plusieurs maladies : cancer, cataracte, sclrose latrale amyotrophique, syndrome de dtresse respiratoire aigu, oedme pulmonaire, vieillissement acclr. Ainsi, les relations entre stress oxydant et cancer s'avrent trs troites, les radicaux libres intervenant dans l'activation des pro-carcinognes en carcinognes, crant les lsions de l'ADN, amplifiant les signaux de prolifration et inhibant des gnes suppresseurs de tumeur comme p53. Le stress oxydant est aussi un des facteurs potentialisant l'apparition de maladies plurifactorielles tels le diabte, la maladie d'Alzheimer, les rhumatismes et les maladies cardiovasculaires [14]. Dans la gense de la plaque d'athrome, l'oxydation des LDL est un des phnomnes clefs transformant les monocytes en cellules spumeuses. Le stress oxydant joue galement un rle dans l'apparition des autres facteurs athrognes : augmentation de la rsistance l'insuline, activation des cellules endothliales librant des mdiateurs prooxydants (prostacycline, cytokine, facteur de fibrinolyse, superoxyde, NO), augmentation de la prolifration des fibres lisses. Un facteur de risque dcouvert rcemment, l'homocystine, voit son action lie en partie la gnration de radicaux libres au cours de son mtabolisme. Les causes essentielles de ce stress oxydant sont soit d'origine nutritionnelle dans les cas de carences en vitamines et oligo-lments, ou inversement de surcharges en facteurs prooxydants (fer, acides gras), soit d'origine accidentelle (inflammation, exposition des xnobiotiques prooxydants...), soit d'origine gntique. Le plus souvent, l'association de ces diffrents facteurs aboutira au mcanisme pathogne. La responsabilit la plus nette des radicaux libres est mise en vidence dans les maladies directement induites par des anomalies d'un gne antioxydant. Plusieurs mutations de la CuZn superoxyde dismutase ont t observes dans les formes familiales d'une maladie neurologique de la sclrose latrale amyotrophique (SLA). Le transfert du gne de malade chez la souris recre d'ailleurs une maladie analogue la maladie humaine. La dgnrescence maculaire lie l'ge est fortement associe avec la forme valine/alanine du polymorphisme du gne de la superoxyde dismutase.

Figure 5 - Nature de quelques modifications des chanes latrales dacides amins des protines aprs attaque radicalaire.

Comment mettre en vidence un stress oxydant chez un malade ?

Un grand nombre de techniques actuellement utilisables pour valuer le stress oxydant ont fait l'objet d'ouvrages ou de revues [12]. Toutefois, ce domaine de la biologie n'a pas encore t tudi avec la rigueur et le souci de standardisation et d'optimisation des mthodes, habituels en biologie clinique. Une grande disparit de techniques et de rsultats complique donc l'interprtation des rsultats et alimente polmiques et dsarroi de celui qui est dsireux d'aborder ces techniques. Par ailleurs, il existe des difficults inhrentes cette exploration, lies la rapide fugacit des espces radicalaires, l'oxydabilit des paramtres redox, ainsi qu' la localisation de ce stress dans un type donn et d'un nombre rduit de cellules dans un tissu sain. L'exploration du statut radicalaire peut se faire par trois abords : la mesure de la production de radicaux (statut prooxydant), la mesure des capacits de dfenses (statut antioxydant) et la mesure de l'tendue des dsordres biochimiques spcifiques rsultant d'un dsquilibre entre la balance antioxydants/prooxydants.

Comment lutter contre le stress oxydant ?

Le stress oxydant tant l'origine de nombreuses maladies, il semble logique de chercher le supprimer. Toutefois, il faut bien se garder d'tre simpliste sur un sujet aussi complexe et ambigu. Tout d'abord, le stress oxydant est

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souvent l'origine des premires anomalies responsables de modifications irrversibles de molcules et de cellules, et ces anomalies se produisent plusieurs annes avant l'apparition des signes de la maladie qui sont irrversibles. Ainsi dans une maladie auto-immune, les antioxydants ne pourront rverser le phnomne lorsque les lignes de lymphocytes auront t slectionnes et actives, mme si les radicaux libres ont particip modifier les protines cellulaires plusieurs annes auparavant, pour les rendre antigniques. On peut envisager sous le titre d' antioxydants au sens large, l'ensemble des molcules susceptibles d'inhiber directement la production, de limiter la propagation ou de dtruire les espces actives de l'oxygne [15]. Ils peuvent agir en rduisant ou en dismutant ces espces, en les pigeant pour former un compos stable, en squestrant le fer libre ou en gnrant du glutathion (figure 6).

renforcement global des dfenses par un apport simultan d'un ensemble d'antioxydants activit complmentaire, plutt que l'apport massif d'un seul d'entre eux. Cet apport prventif d'antioxydants nutritionnels a montr ses limites avec plusieurs essais de grande envergure qui se sont avrs ngatifs, sans doute cause d'un apport des doses excessives de carotne chez des sujets dj fort risque de lsions prcancreuses [16]. Par contre, plusieurs autres tudes utilisant du slnium (tude Precise) ou un mlange vitamines C et E et slnium (tude du Linxian) ont permis une rduction du risque de cancers. Nous venons d'obtenir les rsultats d'une tude similaire ralise en France, l'tude Suvimax. La prise d'un mlange au sein d'une cohorte de 15 000 volontaires a entran au bout de 8 ans une rduction de 30 % des cas de cancers chez les sujets masculins, alors que le supplment n'a pas entran de bnfice chez les sujets de sexe fminin. Il faut dire que ces dernires possdaient au dbut de l'tude un statut antioxydant en carotne nettement suprieur, d leurs meilleures habitudes alimentaires et notamment une plus grande consommation de fruits et lgumes.

Les antioxydants naturels et de synthse

Les antioxydants non nutritionnels comprennent des produits naturels extraits de plantes, utiliss tels quels ou aprs modifications chimiques, des produits extraits d'animaux terrestres ou marins (enzymes ou protines antioxydantes), des produits de synthse imitant les enzymes, chlatant le fer ou pigeant les radicaux. Ce dernier groupe de pigeurs de radicaux de synthse comprend d'anciens mdicaments utiliss Figure 6 - Stratgie de conception de systmes antioxydants susceptibles de depuis longtemps comme fluidifiants bronchiques, prvenir la formation de radicaux libres oxygns ou de permettre leur destruction. anti-inflammatoires ou anti-hypertenseurs et redcouverts rcemment comme tant antioxydants, et de La prvention nutritionnelle nouvelles molcules dessines finalit d'tre antioxydantes. Toutefois, les molcules historiques ont l'avantage de Laugmentation de lapport nutritionnel en antioxydants possder une autorisation de mise sur le march (AMM) visera donc essentiellement prvenir ces maladies. Or comme mdicaments, alors que bien peu de nouvelles molnous ne savons pas toujours quels sont les antioxydants cules ont russi obtenir cette coteuse et difficile autorisaresponsables des effets bnfiques observs en tion. pidmiologie avec les aliments riches en antioxydants Les drivs vgtaux sont extrmement nombreux tre comme les fruits et les lgumes. L'alimentation contient un utiliss principalement dans le domaine des supplments grand nombre d'antioxydants, non seulement les vitamines et des produits cosmtologiques anti-vieillissement, qu'il (E, C, Q, carotne) et les oligo-lments (slnium, cuivre, s'agisse de principes extraits de lgumes, d'pices, de zinc, manganse), mais aussi 600 sortes de carotnodes, fruits ou de plantes mdicinales. Ils appartiennent de 4 000 polyphnols et flavonodes (trouvs dans les choux, le nombreuses familles chimiques, alcalodes, glucosides, th, le vin, les crales, les fruits), des alcalodes, des acides drivs indoliques, mais celle des polyphnols a donn le organiques, des phytates, des drivs soufrs de l'ail et de plus de molcules. Les plus utiliss sont la querctine (chef l'oignon, des drivs indoliques du choux... de file des flavonodes), le resvratrol, extrait de l'corce du En dehors de la prvention primaire, l'apport d'antioxydants raisin rouge et la curcumine, extraite de la racine de pourra tre utile pour viter les rcidives. Il permettra aussi curcuma. de stabiliser la tolrance l'insuline, d'amliorer l'immunit. Les chlateurs du fer ont t trs tudis, mais peu de Enfin, les antioxydants pourront tre utiliss pour diminuer la molcules ont russi dtrner la desferrioxamine qui est toxicit des mdicaments, souvent gnrateurs de radicaux un sidrophore naturel extrait de la bactrie Nocardia. oxygns dans leur mtabolisme. Toutefois, il faudra Toutefois, cette molcule doit tre administre par voie se mfier des effets paradoxaux de fortes doses parentrale. La Dexrazoxane est un chlateur de cations d'antioxydants, car tous deviennent prooxydants s'ils sont divalents bidentate qui, en pr-traitement avant la administrs en excs. De plus, il ne faut pas supprimer le doxorubicine, permet de diminuer l'incidence et la svrit bruit de fond physiologique des radicaux libres. Nous avons de la toxicit cardiaque. Toutefois, sa faible dure de vie, vu leur utilit dans la dfense anti-infectieuse. N'oublions pas compare celle du mdicament, diminue son efficacit. que l'apoptose est aussi un phnomne utile qui supprime L'utilisation des enzymes a t trs limite par leur peu les cellules infectes par des virus ou les cellules d'efficacit clinique et par le risque de contamination cancreuses. accrue depuis l'apparition de l'encphalopathie bovine Dans tous les cas, l'apport d'antioxydants devra se faire spongiforme. Par contre, les chimistes ont fabriqu un grand dans la limite des apports recommands et en prfrant un

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nombre de molcules proprits superoxydes dismutases, dits SOD likes , bases sur des complexes de cuivre, de fer ou de manganse. Mais pour tre efficace in vivo, une molcule montrant une activit SOD in vitro doit tre non toxique, stable, avoir une longue demi-vie, ne pas former de complexes ternaires avec les composants cellulaires, ragir lentement avec l'oxygne molculaire sous sa forme rduite, tre capable de traverser des membranes cellulaires et de gagner un site hydrophile ou lipophile. De mme, des drivs du slnium prsentent des proprits peroxydasiques. Parmi eux, l'Ebselen [2-phnyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)one] est maintenant commercialis dans de nombreux pays europens comme anti-inflammatoire. Les pigeurs chimiques appartiennent de nombreuses familles : drivs phnoliques (butyl hydoxy tolune, probucol ou 4,4'[(1-mthylthylidne) bis(thio)]bis-[2,6-bis(1,1dimthyl) phnol]), drivs strodiens (lazarodes), drivs soufrs (N-actyle cystine, DMSO, pnicillamine), drivs de la mthyl xanthine (cafine, thobromine, thophylline, pentoxifylline, allopurinol, trimtazidine), drivs hydroxyls (mannitol, dipyrimadol).

toxiques) ou hydroxyles (difficiles atteindre car ragissant instantanment). Il est donc capital de trouver de nouvelles molcules efficaces pour neutraliser le peroxyde d'hydrogne, l'oxygne singulet, le monoxyde d'azote et surtout le peroxynitrite. Toutefois, l'idal serait d'aboutir des mdicaments cibls un tissu et permettant un contrle de l'tat redox des cellules ou la prvention du stress, plutt qu' un effet global antioxydant qui ferait perdre la cellule le bnfice potentiel qu'elle tire paradoxalement des radicaux libres de l'oxygne. Pour cela, les chimistes pourraient fabriquer des molcules modulant l'expression des gnes antioxydants. L'industrie cosmtologique dveloppe ainsi beaucoup de recherches sur les inducteurs de ces protines au niveau cutan. Un autre abord est la synthse de mimtiques d'enzymes autorguls par le niveau redox de la cellule. Mais l'industrie chimique peut aussi chercher, comme notre organisme, utiliser les radicaux libres pour activer par voie redox des prodrogues, permettant une action cible aux cellules actives produisant ces radicaux, soit pour rduire l'inflammation, soit pour stopper l'infection virale, soit pour dclencher l'apoptose de cellules cancreuses.

Lapproche biologique Rfrences

L'utilisation en thrapeutique des enzymes antioxydantes s'est avre dcevante, sans doute parce que la quasitotalit des essais thrapeutiques ont port sur la superoxyde dismutase cuivre-zinc cytosolique, enzyme ambigu quant son rle strictement antioxydant puisque sa surexpression fait produire la cellule du peroxyde d'hydrogne plus dangereux que le superoxyde, car tant neutre, il traverse les membranes et peut gnrer OH par la raction de Fenton. Les enzymes slnium comme les protines soufres (mtallothionines, thioredoxines) seraient thoriquement beaucoup plus intressantes mais doivent tre produites en grande quantit par gnie gntique et testes chez l'animal. Deux autres approches semblent prometteuses : la thrapie gnique et le transfert de protines cibles. La thrapie gnique par transfert de gnes antioxydants a donn des rsultats encourageants chez l'animal : diminution des consquences de l'ischmie du myocarde par les gnes de la catalase ou des SOD, suppression des mtastases de cancer du poumon par le gne de la SOD extracellulaire, suppression des tumeurs gliales par la SOD. Le transfert de protines tagues permet de les faire pntrer dans les cellules, grce une petite squence peptidique cationique, le PTD (ou protein transduction domain ), qui par un rcepteur membranaire et de l'nergie, permet la protine fusionne de traverser la membrane plasmique et mme la barrire hmatomninge. Nous avons rcemment montr qu'il tait ainsi possible de faire entrer des protines antioxydantes dans des lots de Langerhans (cellules scrtant l'insuline au sein du pancras) et de les protger des stress oxydants trs importants chez le diabtique.
[1] Yoshikawa T., Yamamoto Y., Naito Y., Free radicals in chemistry, Biology and Medicine, Ed. Oica International, Londres, 2000. [2] Dalton T.P., Shertzer H.G., Puga A., Regulation of gene expression by reactive oxygen, Signalling, 2002, 14, p. 879. [3] Haddad John J., Antioxidant and prooxidant mechanisms in the regulation of redox(y)-sensitive transcription factors, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1999, 39, p. 67. [4] Droge W., Free radicals in the physiological control of cell function, Cellular Physiol. Rev., 2002, 82, p. 47. [5] Kinsky N., Antioxydants function of carotenoides, Free Rad. Biol. Med., 1989, 7, p. 617. [6] Packer L., Protective role of vitamin E in biological systems, Am. J. Clin. Nutr.,1991, 53, p. 1050S. [7] Bors W., Heller W., Michel C., Satan M., Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging-efficiencies, Methods in Enzymology, 1990, 186, p. 343. [8] Zelko I.N., Mariani T.J., Folz R.J., Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression, Free Rad. Biol. Med., 2002, 33(3), p. 337. [9] Ganther H.E., Selenium metabolism, selenoproteins and mechanisms of cancer prevention: complexities with thioredoxin reductase, Carcinogenesis, 1999, 20(9), p. 1657. [10] Esterbauer H., Gebicki J., Puhl H., Jurgens G., The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL, Free Rad. Biol. Med., 1992, 13, p. 341. [11] Cadet J., Bellon S., Berger M., Bourdat A.G., Douki T., Duarte V., Frelon S., Gasparutto D., Muller E., Ravanat J.L., Sauvaigo S., Recent aspects of oxidative DNA damage: guanine lesions, measurement and substrate specificity of DNA repair glycosylases, Biol. Chem., 2002, 383(6), p. 93. [12] Favier A., Cadet J., Kalaryanaman R., Fontecave M., Pierre J.-L., Analysis of Free Radicals in Biological Systems, Birkhauser, New-York, 1995. [13] Sohal R.S., Mockett R.J., Orr W.C., Mechanisms of aging: an appraisal of the oxidative stress hypothesis, Free Rad. Biol. Med., 2002, 33(5), p. 575. [14] Montagnier L., Olivier R., Pasquier C., Oxidative stress in cancer, AIDS and neurodegenerative diseases, Marcel Dekker, New York, 1998. [15] Sies H., Antioxidant in disease mechanisms and therapy, Advances in Pharmacology, Academic Press, New York, 1997, 38. [16] The Alpha-tocopherol Beta Carotene Cancer Prevention Group. The effect of vitamin E and beta carotene on the incidence of lung cancer and other cancer in male smokers, New. Engl. J. Med., 1994, 330, p. 1029.

Avenir
Le stress oxydant est devenu une notion incontournable en biologie mdicale et porteuse d'espoir thrapeutique, mais une notion plus complexe et plus riche que ce que nous en percevions initialement. De nombreuses lacunes demeurent dans l'arsenal thrapeutique contre le stress oxydant. Nous ne disposons d'antioxydants efficaces et utilisables en mdecine que contre les radicaux superoxydes (peu

Alain Favier est professeur de biochimie, directeur du Laboratoire de recherche Lsions des acides nucliques du CEA de Grenoble*, et directeur du Dpartement de biologie intgre au CHU de Grenoble.
* Laboratoire Lsions des acides nucliques, Centre dtude Nuclaire de Grenoble, rue des Martyrs, 38054 Grenoble. Tl. : 04 76 76 54 84. Fax : 04 76 76 56 64. Courriel : favier@drfmc.ceng.cea.fr

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