Manual de Bioquimica I

LABORATORIO DE BIOQUMICA
1

MANUAL DE LABORATORIO

DE

BIOQUMICA I

ING. ELOISA GUADALUPE CHVEZ CAMPOS

1

CONTENIDO
Pgina
Introduccin.......................................................................................................

Objetivos de las prcticas...................................................................................

Reglamento de laboratorio.............................................................................

PRCTICA No. 1 SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

PRCTICA No. 2 PROPIEDADES FISICO-QUIMICAS DE LOS A.A.

PRCTICA No. 3 CUANTIFICACIN DE LAS PROTENAS

PRCTICA No. 4 CINTICA ENZIMTICA..

PRCTICA No. 5 FOSFORILACIN OXIDATIVA..

PRCTICA No. 6 ACOPLAMIENTO DE LA FOSFORILACIN OXIDATIVA
Y CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES.

APENDICE

I. PREPARACIN DE SOLUCIONES ESPECIALES

BIBLIOGRAFA

2

3

4

10

14

26

31

41

47

51

53

2

INTRODUCCIN

Este curso trata se despertar el inters del estudiante por la investigacin, que constituye
una parte muy importante de la bioqumica moderna. Para alcanzar este objetivo se
precisa plantear, controlar y ejecutar buenos experimentos.

Se espera, en especial, que el estudiante se familiarice antes con la teora y los detalles
opeativos de cada experimento, por lo cual es de suma importancia que el alumno
consulte frecuentemente la bibliografa de Bioqumica. Por lo tanto, el presente manual
de prcticas, pretende ser un apoyo didctico para los estudiantes que cursan la material
de Bioqumica I.

Los experimentos seleccionados tienen como objetivo la integracin de los
conocimientos adquiridos en el aula, as mismo al final de cada una de las prcticas se
orienta la realizacin de un informe. Por esta razn, en el presente manual se han
incorporado cuadros y esquemas en los cuales el alumno puede ir plasmando sus
observaciones, dibujos, conclusiones, clculos, resultados, interpretaciones, etc., con el
objetivo de facilitar la elaboracin del reporte.

El nivel de complejidad va en incremento de forma tal que los experimentos precedentes
van preparando al estudiante para el desarrollo de los posteriores y las habilidades
prcticas se van sistematizando a lo largo de los diferentes laboratorios.

En la siguiente seccin del presente manual se describe las normas de seguridad para el
laboratorio de bioqumica y ah se mencionan algunas de las acciones que debe realizar el
alumno antes y durante la sesin de laboratorio. Por lo tanto antes de empezar cualquier
trabajo en laboratorio ser indispensable leer el documento antes citado. De una forma
general algunos de los aspectos relacionados son:

- Lectura previa de la prctica en el manual.
- Lectura de material adicional relacionado con el experimento y vinculacin con la
teora explicada en clase.
- Formular hiptesis en le desarrollo experimental.
- Explicacin y/o discusin durante la realizacin de la prctica.
- Informe de resultados personal o grupal.
- Investigar la naturaleza de los reactivos a utilizar.


3
OBJETIVOS DE LAS PRCTICAS

- Que el alumno comprenda en cada prctica lo expuesto en las clases tericas

- Mediante la observacin y la experimentacin el alumno comprender a trabajar
con seguridad y precisin, lo mismo que interpreter y discutir los resultados
logrados, basndose en el trabajo experimental.

- Desarrollar criterios y habilidades para el diseno de nuevos experimentos.

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REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA
LABORATORIOS DE LA CARRERA DE ING. BIOQUMICA

Este documento forma parte del Manual de Seguridad para laboratorios de la Carrera de
Ing. Bioqumica en el ITESI.

R1. El presente reglamento es aplicable en todos los trabajos experimentales, ya sea de
docencia o investigacin que se realicen en los laboratorios de la carrera de Ing.
Bioqumica dentro del ITESI.

R2. Cualquier actividad que se realice en tales laboratorios debe estar supervisada por un
responsable, el profesor de la materia o el encargado del laboratorio.

R3. Es necesario que el personal que trabaje en cada laboratorio conozca el sistema de
alertamiento, zonas de seguridad, rutas de evacuacin, el equipo para combatir incendios
y las medidas de seguridad establecidas.

R4. Los laboratorios debern estar acondicionados, como mnimo con:

a) Control maestro para energa elctrica
b) Un botiqun de primeros auxilios
c) Extintores
d) Un sistema de ventilacin adecuado
e) Agua corriente
f) Drenaje
g) Un control maestro para suministro de gas
h) Estacin de regaderas y lavaojos
i) Sealamientos de Proteccin Civil
j) Guantes y lentes de seguridad
k) Mascarillas de seguridad

R5. Al realizar actividades experimentales, nunca deber estar una persona sola en los
laboratorios. El mnimo de personas deber ser, invariablemente de dos. En el caso de
que uno de ellos sea alumno, deber estar siempre un profesor o encargado.

R6. Al realizar una prctica, los usuarios no deben dejar sus cosas o tiles escolares sobre
el lugar o mesa de trabajo, estas deben colocarse en algn lugar indicado por el
encargado, donde no obstruyan la labor experimental. Si el alumno utiliza cajones,
gavetas o archiveros para guardar material o cosas de valor debe cerrarlo, el laboratorio
no se hace responsable de cualquier prdida.

R7. El equipo de proteccin personal que ser usado en los laboratorios.

Alumnos :


5
1) Bata de algodn 100%
2) Lentes de seguridad. En caso de lentes graduados, solicitar a los alumnos que
sean de vidrio endurecido e inastillables, y uso de protectores laterales

3) El pelo recogido
4) Guantes en caso de que el experimento lo exija a criterio del profesor
5) Franela de algodn
6) Usar zapato cerrado de piel o de seguridad
7) No traer anillos, aretes ni pulseras

Profesor:

3) El pelo recogido
4) Usar zapato industrial o cerrado de piel

Encargado o Laboratorista

3) Guantes, cuando se encuentre en contacto con los reactivos
4) Pelo recogido
5) Usar zapato industrial o cerrado de piel

Ninguna persona podr permanecer en el laboratorio si le falta alguno de los implementos
anteriormente descritos.

R8. En los laboratorios y anexos donde se realicen experimentos queda prohibido
fumar, consumir alimentos o bebidas, el uso de lentes de contacto y el uso de zapatos
abiertos (tipo guarache o tenis).

R9. Las puertas de acceso y salidas de emergencia debern estar siempre libres de
obstculos, accesibles y en posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. El
responsable del laboratorio deber verificar lo anterior al menos una vez cada semana.

R10. Las regaderas debern contar con el drenaje correspondiente, funcionar
correctamente, al igual que la estacin de lavaojos, estar lo ms alejadas posibles de
instalaciones o controles elctricos y libres de todo obstculo que impida su correcto uso.
El responsable deber verificar esto, al menos una vez cada semana.


6
R11. Los controles maestros de energa elctrica y suministro de gas, agua, vapor y
vaco, para cada laboratorio, debern estar sealados adecuadamente, de manera tal que
sean identificados fcilmente.

R12. En cada laboratorio, deber existir al alcance de todas las personas que en l
laboren, un botiqun de primeros auxilios. El responsable del rea deber verificar el
contenido del botiqun, para proceder a reponer los faltantes y o enriquecerlos a criterio
de los jefes de laboratorio.

R13. Los extintores contra incendio debern ser de CO
2
o de polvo qumico seco y
debern revisarse como mnimo una vez al semestre, debern recargarse cuando sea
necesario de conformidad con los resultados de la revisin o por haber sido utilizados.
Durante el tiempo que el extintor est vaco, deber ser removido de su lugar para evitar
confusiones en caso de necesitarlo.

R14. Las campanas o sistemas de extraccin de gases debern mantenerse siempre sin
obstculos que impidan cumplir con su funcin. Asimismo debern ser accionadas al
inicio del trabajo experimental, para verificar su buen funcionamiento; en caso contrario,
el responsable deber avisar a mantenimiento y servicios tcnicos para que efecten el
mantenimiento preventivo o correctivo.

R15. Los sistemas de suministro de agua corriente y drenaje debern verificarse a fin de
que estn en buen estado; en caso contrario, los responsables de cada rea darn aviso a la
coordinacin de mantenimiento y servicios tcnicos para recibir el mantenimiento
preventivo o correctivo que se requiera.

R16. Los lugares en los que se almacenan reactivos, disolventes, equipos, materiales,
medios de cultivo y todo aquellos relacionado o necesario para que el trabajo en los
laboratorios se lleve a cabo, estarn sujetos a este reglamento en su totalidad.

R17. Queda prohibido arrojar desechos de sustancias al drenaje o por cualquier otro
medio, sin autorizacin del responsable del rea. El manual de seguridad o los manuales
de prcticas correspondientes debern incluir la forma correcta de desechar los residuos.

R18. Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del rea, profesor o jefe
de laboratorio ( el ltimo en salir del laboratorio ), deber verificar que queden cerradas
las llaves del gas, agua, vaco, vapor, circuitos elctricos, luces, etc. En caso de requerir
que algn equipo trabaje de manera continua, deber dejarse en forma claramente visible
y legible, la informacin acerca del tipo de experimento, proceso o reaccin en
desarrollo, las posibles fuentes de problema, la manera de controlar los eventuales
accidentes y la forma de localizar al responsable del equipo.


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Del Manejo de Sustancias y Material
R19. Con respecto al manejo de sustancias, material y equipo en el laboratorio se deben
de atender a los siguientes aspectos:
- Para transferir lquidos con pipetas, deber utilizarse la propipeta correspondiente.
Queda prohibido pipetear con la boca
- Proceda siempre con precaucin al transferir sustancias de sus recipientes. Si algo
se derrama notifique al profesor o encargado, de manera que pueda aplicarse los
procedimientos de limpieza adecuados.
- Cuando se trabaje con tubos de ensayo, no debe mirarse al interior del mismo
mientras se calienta , ni tampoco debe apuntar la boca del tubo en direccin hacia
el compaero.
- Cuando se calientan tubos de ensayo debe hacerse partiendo de las porciones
superiores hacia abajo. De otra manera el vapor que asciende, al encontrarse con
la capa de lquido situada por encima de l, puede causar proyecciones del
contenido.
- Cuando se est manejando lquidos inflamables, hay que tener cuidado que no
haya llamas cerca.
- Cualquier recipiente donde se encuentren grandes volmenes de sustancias
qumicas peligrosas como cidos y lcalis, deben ser manipulados por el profesor
o encargado de laboratorio.
- Nunca agregue agua sobre un cido concentrado. Si es necesario preparar un
cido diluido, debe agregarse siempre el cido concentrado, en pequeas
cantidades, sobre el agua y agitar.
- Cuando est manipulando (acodando) vidrio permita que se enfre antes de
cualquier manejo posterior. Al cortar tubos de ensaye, cuide de no dejar
superficies cortantes, alise al fuego. Al introducir tubos de vidrio a tapones no
apoyarse sobre la palma de la mano.
- Nunca fuerce dentro o fuera los tapones y anexos de goma, de los tubos de vidrio,
termmetros o cualquier otro material que se pueda quebrar. La glicerina o el
detergente facilita la tarea de quitar dichos tapones o anexos.
- Nunca calentar los sistemas totalmente cerrados
- Usar soportes que apoyen bien en la mesa, para evitar la cada de equipos con
centros de gravedad altos.

R20. Cuando se trabaje con sustancias txicas, deber identificarse plenamente el rea
correspondiente, nunca debern tomarse frascos por la tapa o el asa lateral, siempre
debern tomarse con ambas manos, una en la base y la otra en la parte media. Adems se
deber trabajar en el rea con sistemas de extraccin y equipo de proteccin personal.

R21. En cada laboratorio deber existir de manera clara, visible y legible, la informacin
acerca de los telfonos de emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo:
Cruz Roja
Bomberos
Antirrbico
Centro Mdico


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Proteccin Civil

R22. Cualquier alteracin a las condiciones de seguridad o en el cumplimiento del
presente reglamento, deber ser reportado al responsable correspondiente.

R23. Las personas a quienes se les sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales,
instalaciones, etc; propias de los laboratorios. De todo aquello mencionado en los
reglamentos R3 y R4 o de las sealizaciones instaladas, sern sancionadas conforme lo
dicte la academia y jefatura correspondiente.
De La Disposicin de Material y equipo

R24. Todas la sustancias, equipos, materiales, etc; debern ser manejadas con el mximo
cuidado, siguiendo las condiciones de los manuales de uso o manuales de seguridad,
segn sea el caso.

R25. El equipo necesario para la realizacin de las prcticas ser proporcionado en
condiciones normales de funcionamiento, cualquier desperfecto que resulte, el estudiante
lo har saber al profesor o encargado, sin que intente llevar a cabo la reparacin
correspondiente.

R26. El material de consumo para cada prctica, lo proporciona el encargado en cantidad
suficiente y adecuada al trabajo a realizar. Si el estudiante hace mal uso de este; tendr
que reponer el material de consumo.

R27. En caso de haber roto material en forma irreparable, colocar los pedazos en una
bolsa adecuada y colocarla en los depsitos para tal propsito.

R28. Para reponer los daos a material o equipo, que por negligencia, mal uso o
cualquier otra causa, el estudiante reponerlo con las mismas especificaciones y entregarlo
con la factura de compra. Se tendrn 15 das naturales para reponer debidamente el
material o equipo, si no cumple no se le permitir trabajar en el laboratorio, reprobar la
materia en curso relacionada con este y no se podr inscribir al siguiente semestre de la
carrera correspondiente.

R29. El material y equipo de los laboratorios, son para ser usados en prcticas o
investigaciones y no se prestarn para fines personales.

Asistencia y Servicio de Material

R30. El Estudiante deber asistir a la sesin de laboratorio que le corresponde con
puntualidad o con una tolerancia de 10 minutos. Despus de estos 10 minutos no se le
entregar material.


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R31. La entrega de material se efectuar exclusivamente, durante la primera media hora
de entrada a cada sesin. Los alumnos no podrn iniciar o terminar una prctica, si no
est el profesor de la materia o el encargado de laboratorio.

R32. El estudiante tiene la obligacin de haber ledo previamente la prctica del
manual y escuchar la explicacin del maestro sobre el experimento a realizar.

R33. Se solicitar al encargado de laboratorio el material, de acuerdo al vale o boleta de
cada sesin y lo revisar cuidadosamente en su presencia, firmar de conformidad, si este
es el caso, cuidando de anotar cualquier desperfecto del material.

R34. Los estudiantes tienen la obligacin de limpiar la mesa de trabajo, el equipo e
instrumentos, de devolver el material limpio y seco y en el mismo estado en que se
recibi y no olvidar la boleta firmada.


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OBJETIVO

- Aplicar la ecuacin de Henderson-Hasselbalch para calcular los components de
una solucin amortiguadora a un determinado pH y apreciar la importancia de
tales soluciones en los organismos vivos.

INTRODUCCIN

La adicin de una sal soluble de un cido dbil a una solucin acuosa de ese cido,
aumentar el Ph (disminuye la [H
+
]) de la solucin.

La sal se ionizar totalmente y el aumento de la concentracin de la base conjugada del
cido dbil por efcto de la ley de accin de masas deslazar el equilibrio hacia la
izquierda y extraer algunos iones hidrgeno.

Debido a o anterior, el ph de una solucin de un cido dbil est determnado no tanto por
la concentracin del cdo, sino por la razn de la concentracin de la sal (base conjugada)
a la concentracin del cido sin disociar. Tales soluciones se llaman soluciones
amortigudoras y pueden resistir el cambio de pH cuando se anade un cido o base fuerte.

+
+ H HPO PO H
2
4 4 2

MATERIAL REACTIVOS

4 Matraces volumtricos de 100 ml Fosfato de potasio monobsicso
Pipetas volumtricas de 1, 2,5 y 10 ml Fosfato de sodiodibsico
7 Frascos de vidrio color mbar Hidrxido de sodio
Potencimetro cido brico
Bureta graduada NaOH 1 N
Vaso de precipitado de 250 ml Agua destilada

DESARROLLO

PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

Haciendo uso de la ecuacin de Hendeson-Hasselbalch, calcular la cantidad de cido y
base conjugada para preparer 100 ml de cada una de la siguientes soluciones
amortiguadoras.
PRCTICA # 1.- Soluciones amortiguadoras.


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A Solucin de fosfatos 0.1 M a un pH de 7.2
B Solucin de fosfatos 0.1 M a un pH de 7.6
C Solucin de fosfatos 0.1 M a un pH de 7.8
D Solucin de boratos 0.1 M a un pH de 8.0
E Solucin de boratos 0.1 M a un pH de 8.4
F Solucin de boratos 0.1 M a un pH de 8.8
G Solucin de boratos 0.1 M a un pH de 9.8

DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD AMORTIGUADORA

La capacidad de amortiguacin, es la cantidad de base fuerte requerida para alterar el pH
de la solucin amortiguadora en una unidad de pH.

Se colocan los 100 ml de solucin amortiguadora en un vaso de precipitado de 250 ml,
posteriormente se introduce el electrodo de medida del potencimetro,

Preparar una bureta con solucin NaOH 1 N y se adiciona 1 ml de esta base al vaso de
precipitado que contiene la solucin amortiguadora.

Registrar el pH resultante despus de agitar perfectamente.

Nuevamente preparer una bureta con NaOH 1 N y adicionar 1 ml de la base al vaso de
precipitados que contiene la solucin amortiguadora, este paso se realize tantas veces,
hasta que el pH de la solucin cambia en una unidad. A continuacin completa el
siguiente cuadro de acuerdo a los resultados obtenidos.

Volumen de base

Incremento de pH

C.A=
PRECAUCIN! Evite golpear el electrodo.


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VOLUMEN DE NaOH
ADICIONADO (ml)
LECTURA DE pH

Capacidad Amortiguadora = _________________

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1. Anotar los calculus realizados para la preparacin de las sluciones
amortiguadoras.
2. Calcular la capacidad de amortiguacin de cada una de las soluciones
amortiguadoras.
3. Mediante la ecuacin de Henderson-Hasselbalch, explicar cuando un
amortiguador presenta su maxima capacidad de amortiguamiento.
4. Utilizando una reaccin qumica, indique lo que sucede al adicionar el NaOH a la
solucin amortiguadora.
5. Utilizando una reaccin qumica, indique lo que sucede al adicionar un cido a la
solucin amortigadora.
6. Explique Por qu los aminocidos tienen capacidad amortiguadora?


13
7. Cules son los sistemas amortiguadores en las clulas vivas?
8. De los sistemas amortiguadore presentes en las clulas vivas cul es el ms
importante? Por qu?
9. Qu es una acidosis respiratoria?
10. De qu manera el organismo compensa las acidosis anteriores?

BIBLIOGRAFA CONSULTADA


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OBJETIVO

- Demostrar la utilidad de la reaccin de la nihidrina para la ietificacin de los
amiocidos
- Realizar la separacin de los aminocidos contenidos en una mezcla por medio de
cromatografa circular en papel
- Comprobar la efectividad de la reaccin de Adamkiewiks para la identificacin de
los grupos indoles e identificar el aminocido que contiene este grupo functional
- Ratificar la utilidad de la reaccin xantoproteica en la deteccin de grupos fenoles
sustituidos e identificar los aminocidos que contienen este grupo funcional
- Demostrar que la reaccin de los tiogrupos identifica a los grupos sulfihidrilos
comprobar su utilidad en la deteccin de aminocidos que posean este grupo
functional

INTRODUCCIN

Los aminocidos contituyen el alfabeto de la estructura proteca y determinan muchas de
las propiedades importantes de las protenas. Desde el punto de vista qumico los
aminocidos pueden definirse como compuestos qumicos orgnicos que poseen al menos
un grupo amino y uno carboxilo. FIG.AA

Los aminocidos tienen propiedades fsico-qumicas comunes que derivan de esta
caracterstica estructural como: ser sustancias plares y por consiguiente presentar un
elevado punto de fusin y ebullicin, as como ser solubles en solventes polares; en
cuanto a las caratersticas qumicas presentarn reacciones propias de los grupos
qumicos que poseen. En ellos tambin existe una cadena lateral o grupo R de estructura
variable que identifica a cada aminocido particular y lo que permtir la difernciacin en
laboratorio por medio de procesimientos tanto fsicos como qumicos.

Los aminocidos son compuestos slidos; incoloros; cristalizables; de elevado punto de
fusin (habitualmente por encima de los 200 C); solubles en agua; con actividad ptica y
con un comportamiento anftero. La actividad ptica se manifiesta por la capacidad de
desviar el plano de luz polarizada que atraviesa una disolucin de aminocidos, y es
debida a la asimetra del carbono , ya que se halla unido (excepto en la glicina) a cuatro
radicales diferentes. Esta propiedad hace clasificar a los aminocidos en Dextrogiros (+)
si desvian el plano de luz polarizada hacia la derecha, y Levgiros (-) si lo desvian hacia
la izquierda.
PRCTICA # 2.- Propiedades fsicco qumicas
de los aminocidos..


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El comportamiento anftero se refiere a que, en disolucin acuosa, los aminocidos son
capaces de ionizarse, dependiendo del pH, como un cido (cuando el pH es bsico), como
una base (cuando el pH es cido) o como un cido y una base a la vez (cuando el pH es
neutro). En este ltimo caso adoptan un estado dipolar inico conocido como zwitterions
(del alemn in hbrido), en este estado es como predominan en el interior de la clula.

Reaccin de la Ninhidrina FIGURA NIHDRINA

En esta prctica se aprovechar la reaccin de los aminocidos con la Nihidrina, en la que
participant tanto el grupo carboxilo como el amino, para la idetificacin de la presencia
de estos compuestos y su utilizacin en el revelado de la cromatografa.

Nihindrina (Hidrato de tricetohidrindreno), en presencia de compuestos que posean al
menos un grupo amino y otro carboxilo reaccionan formando un derivado coloreado,
generalmente azul (excepto prolina e hidroxiprolina generan colracin amarilla) y con
desprendimiento estequiomtrico de dioxido de carbono, lo que permite que esta reaccin
sea a su vez un mtodo general para la estimacin cuantitativA y cualitativa de los
aminocidos.

FIGURA RX NIHIDRINA

Cromatografa de Particin en Soporte de papel

Este mtodo se basa en la propiedad que tienen ciertos compuestos de ser solubles
aunque en magnitudes diferentes, en dos o ms solvenes que son inmiscibles entre s que
se hallan en contacto. Uno de los dos solventes permanence estacionario se le denomina
fase fija, en tanto que el otro se desplaza continuamente, por lo que se le denomina fase
mvi. Despus de un tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio, el compuesto se
encuentra distribuido en las dos fases lquidas en un modo caracterstico. La expression
numrica de esta propiedad es el coeficiente de distibucin (K).

| |
| | B
A
K =

Donde: A: concentracin del sovente A
B: concentracin del solvente B


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Uno de los sistemas de solventes ms sencillos que puede aplicarse es el fenol saturado
en agua.

Desde el punto de vista de su solubilidad todos los aminocidos son soubles en agua
debido a la presencia de su estructura invariante, su solublidad variar de acuerdo con la
polaridad que presente su cadena lateral, de manera que los aminocidos clasificados
como polares inicos sern mucho ms solubles en agua que aquellos que posean grupos
hidrofbicos en su cadena R.

Cromatografa Circular

El papel filtro se coloca horizontalmente sobre una caja Petri que contega el solvente, se
le adiciona un sistema capilar que posibilite que el papel alcance el solvente, se tapa y se
deja que la fase mvil alcance el borde del papel.

Este procedimiento tiene la ventaja de ser muy simple (no necesita equipos especiales) y
rpido, por lo que resulta ideal para que el personal inexpeto obtenga resultados que sean
demostrativos.

En caso de utilizar el mismo tipo de papel, los mismossolventes y las mismas condiciones
ambientales, la movilidad de una mancha correspondiente a una sustancia pura es
constante y por lo tanto es posible identificar esa mancha por comparacin directa con
una mancha patron. En caso de no contar con una mancha patron, es possible identificarlo
a partir de los valores Rf.
Solvente Dist
mancha Dist
Rf
.
.
=

Fig 4. Cromatografa circular

Reacciones qumicas de los aminocidos

Las reacciones que se presentan a continuacin han sido seleccionadas por ser
representatives, stas permitern efectuar la diferenciacin y/o identificacin de algunos de
ellos


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Reaccin de Adamkiewics

La reaccin de Adamkiewics es especfica para los grupos indoles.
Se basa en la propiedad que tiene este grupo qumico de reaccionar con gran nmero de
aldehdos, entre ellos el formaldedo, a travs de una reaccin de condensacin mediada
por la presencia de un agente deshidratante como el cido sulfrico y generando as un
derivado coloreado characterstico. Esta reaccin es propia del triptfano. FIG RX.

Debe se;nalarse que las protenas que contengan a este amincido tamin daran positive
la reaccin, pues el cido sulfrico presente provocara la desnaturalizacin de la protena
con la subsiguiente exposicin al medio de los grupos indlicos existents en las cadenas
laterals de los aminocidos, entre ellas las del triptfano. Adems la reaccin del
sulfrico es tan energtica que provocara la hidrlosis proteca y la liberacin del
susodicho aminocido.

Reaccin Xantoproteica

La reaccin xantoproteca es especfica para grupos fenilos sustituidos.

En ella ocurrir la nitracin del grupo fenilo que posea una molcula orientadora para
posiciones orto del anillo cuando se ponga en contacto con el cido ntrico. La nitracin
de este anillo determinar que el compuesto resultante tenga un color. FIG RX
XANTOPROTEICA

De acuerdo a lo postulado anteriormente, todos los aminocidos que presenten en su
estructura grupos fenilos sustitudos como la tirosina, triptfano, daran positive con la
reaccin xantoproteca.

En esta reaccin el cido ntrico provocar la desnaturalizacin e hidrlisis parcial de las
protenas, por lo tanto las protenas a los aminocidos mencionados anteriormente
ambient daran positive con esa reaccin.

Reaccin de los Tiogrupos

La presencia de los grupos SH (sulfihdrilo o tiol) es un compuesto orgnico que
permite transcurra una reaccin en presencia del acetato de plomo en medio alcalino en el
cual

Entre los tres aminocido azufrados que existen: cistena, cistina y metionina, solo los dos
primeros darn la reaccin de los tiogrupos, mientras la metioina dar negativa al tener
bloqueado su grupo tiol por la presencia del metilo.


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MATERIAL REACTIVOS

10 tubos de ensaye de 15 ml Aminocidos
Mechero de Bunsen Albmina de huevo
Cuba Ninhidrina
Vaso de precipitados de 250 ml Gelatina, Sacarosa
Placa Petri Triptfano
Capilar Formaldehdo
Vidrio de reloj Fenol, Fenialalanina
Pipeta 10 ml Ac. Sulfrico, Ac. Ntrico
Hidrxido de potasio al 40%
Aceato de plomo al 10%
Agua destilada

DESARROLLO

Experimento # 1
Reaccin de la Ninhidrina

Prepare 4 tubos de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente:
TUBO #
REACTIVO
1 2 3 4
Albmina de
huevo
0.5 ml _ _ _
Solucin de
aminocidos
_ 0.5 ml _ _
Scarosa _ _ 0.5 ml _
Agua destilada _ _ 0.5 ml
Ninhidrina 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Agite todos los tubos de ensayo y colquelos en un bano de aua en ebullicin durante 5
minutos.


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OBSERVACIONES

Experimento # 2
Cromatografa circular en papel

.

Despus de colocados los guantes y utilizando un apis y regal, divida el papel filto que
tiene en su puesto de trabajo en 4 cuadrantes simtricos, tal como se muestra en la figura
siguiente y proceda aplicar al orificio ms prximo central y en forma de bandas finas las
soluciones de aminocidos de acuerdo a la distribucin que se orienta en la propia figura.

Fig 7.
Para la realizacin de este experimiento es necesario el uso de guantes
quirrgicos o de laboratorio de latex, ya que en sus manos se encuentran
presentes diveros aminocidos que contaminaran todo el material;
adems el sistema de solventes utilizado contiene una elevada
concentracin de fenol que es altamente castico.
Alanina
Leucina
Mezcla
de a.a.
Acido
glutmico


20

Coloque el capilar que se encuentra en su puesto de trabajo en el centro del papel filtro y
ubique dicho papel sobre la placa Petri que contiene el sistema de solventes.
Inmediatamente tape la placa de Petri y deje corer el solvente hasta alzanzar el borde del
papel.

Al terminar la corrida cromatogrfica extraiga el papel filtro de la placa Petri y djelo
secar mediante su exposicin al calor en contacto directo con una resistencia elctrica.
Debe tener cuidado de no quemar el papel filtro.

Finalizando este procedimiento de secado, se debe sumerjir el papel en un vidrio de reloj
en el que previamente se coloca una suficiente cantidad del reactivo de la ninhdrina. Se
saca de inmediato el papel filtro del reloj y se coloca en el horno a 120C durante 5
minutosno hasta que aparezca en el mismo las manchas azul-violceas caractersticas de
los aminocidos con la reaccin de la ninhidrina.

OBSERVACIONES: Represente en el dibujo siguiente el resultado obtenido calcule el
valor Rf de cada uno de los aminocidos conocidos as como el o los que se encuentran
en la mezcla de aminocidos.

Una vez calculados estos valores de Rf , proceda a identificar las manchas que se
obtuvieron de la corrida cromatogrfica de la mezcla de aminocidos, considerando como
nmero 1 la que se encuentra ms cerca del orificio central del papel.

Explica la razn por la cual se produce esta separacin de los aminocidos.

Aminocidos identificados
1)

2)

3)

4)


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Experimento # 3
Reaccin de Adamkiewics


TUBO #
REACTIVO
1 2 3 4
Gelatina 0.5 ml _ _ _
Albmina de
huevo
_ 0.5 ml _ _
Triptfano _ _ 0.5 ml _
Agua destilada _ _ 0.5 ml
Formaldehdo 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas
Acido sulfrico 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Debe tomar en cuenta dos medidas imprescindibles para que la tcnica funcione
correctamente:
1. Despus de anadir el formaldehdo debe agitar los tubos de ensayo
2. Anadir el cido sulfrido muy lentamente y por las paredes del recipiente y no
agitar el tubo de ensayo

La positividad se expresa.. que se apreciar en la interfase de

OBSERVACIONES

Recuerde que la reaccin de deshidratacin mediada por el cido
sulfrico es altamente exotrmica.y si lo adiciona muy rpido la reaccin
puede ebullir e incluso saltar y producirle quemaduras


22

Precise por qu existen diferencias entre el resultado obtenido con la albmina de huevo
y con la gelatina.

Experimento # 4
Reaccin Xantoproteica


TUBO #
REACTIVO
1 2 3 4 5
Albmina de
huevo
2 ml _ _ _ _
Fenol _ 2 ml _ _ _
Triptfano _ _ 2 ml _ _
Fenilalanina _ _ _ 2 ml _
Agua destiladao _ _ _ _ 2 ml
Acido ntrico 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
CONCLUSIONES (Explique brevemente estos resultados) :


23

Llevar los tubos al bano de agua hirviente y mantenerlos ah durante un minuto, qu
observa?

Enfre los tubos de ensao y andale a todos ellos 5 ml de a solucin de hidrxido de sodio
al 20% Qu observa?

Compare los resultados obtenidos con el triptfano y la fenilalanina. Explique la
diferencia observada.

CONCLUSIONES (Explique brevemente estos resultados) :


24
Experimento # 5
Reaccin de los Tiogrupos

Prepare 3 tubos de ensayo de la siguiente forma:

TUBO #
REACTIVO
1 2 3
Albmina de
huevo
1 ml _ _
Cistena _ 1 ml _
Agua destilada _ _
Hidrxido de
potasio a 40%
1 ml 1 ml 1 ml
Acetato de
plomo al 10%
3 gotas 3 gotas 3 gotas

Llevar los tubos al bano de agua hirviente y mantenerlos ah durante 10 minutos, qu
observa?

Explique por qu la albmina manifiesta este resultado


25
CUESTIONARIO

1. Por qu se utiliza agua destilada en todos los experimentos qumicos de esta
prctica?
2. Por qu la albmina de huevo tiene diferente resultado cuando se realiza la
reaccin de la ninhidrina con relacin al resto de los resultados?
3. De acuerdo con los resultados diga qu amnocidos se encuentran formando parte
de la albmina de huevo?
4. Sobre la base de la estructura qumica de los aminocidos utilizados, explique
por qu se produce diferente migracin en la cromatografa?



26

OBJETIVO

Comparar la tcnica tradicional para cuantificar protenas (mtodo de Biuret), con el
mtodo de Bradford que es muy sensible, rpido y exacto.

INTRODUCCIN

Los laboratorios de investigacin, rquieres de mtodos rpidos y sensibles para
cuantificar potenas. Las tcnicas disponibles cumlen parcialmente los requerimientos de
este tipo de cuantificaciones.

El mtodo de Lowry est sujeto a interferencias como iones K
+
y Mg
++
, EDTA, tris,
TIOES Y CARBOHIDRATOS. El mtodo de Biuret es poco sensible y est sujeto a
interferencias como amonaco, TRIS y glicerol.

Las tcnicas anteriores se han modifiado para eliminar tales interferencias, pero los
procedimientos se han hecho ms elaborados y tardados.

El mtodo que se ensayar (mtodo de Bradford), elimina la mayora de los problemas
antes descritos y se basa en qe el azul de coomassie (blue G-250) existe en dos formas
coloridas (roja y azul), la forma roja es transformada a la forma azul cando se forma un
complejo con la protena. Este complejo tiene un coeficiente de extincin alto, lo cual
hace que el mtodo sea muy sensible (detecta g). La formacin del complejo es rpido
(aprox. 2 minutos) y estable hasta por una hora.

MATERIAL REACTIVOS

13 tubos de ensaye de 12 x 100 Reactivo de Bradford
3 pipetas de 5 ml NaCl 0.15 M.
2 pipetas de 1 ml Reactivo de Biuret
Gradilla Solucin amortiguadora TRIS
Bano Mara Estndar de protena 10 mg/ml
Espectrofotmetro Estndar de protena 100 mg/100 ml
Papel milimtrico

PRCTICA # 3.- Cuantificacin de las protenas.


27
DESARROLLO

Mtodo de Biuret

Esta tcnica est fundamentada en la produccin de un quelato soluble de color azul
intesno a voleta, formado por pptidos y protenas en un medio alcalino en presencia del
in Cu
++
.

Se preparan seis tubos de ensaye de acuerdo a la siguiete tabla de distribusin de
reactivos.

Tubo
No.
Estndar de protena
(mg/ml)
NaCl 0.15 M
(ml)
Muestra
problema (ml)
Reactivo de
Biuret (ml)
1 0 2.00 1.00 3.00
2 2.5 2.75 0 3.00
3 5.0 2.50 0 3.00
4 7.5 2.25 0 3.00
5 10 2.00 0 3.00
6 0 3.00 0 3.00

Se colocan los tubos de ensaye en un bano Mara a 37C durante 1 min, posteriormente
se enfran los tubos de ensaye con agua de la llave.

Hacer un barrido en el espectofotmetro, para determinar la longitud de onda a la cual se
obtiene la mxima absorbencia. Se pUede utilizar cualquier tubo (por ejemplo el 3),
calirando con el tuo No. 6 (blanco).

Determinar laabsorbencia de cada una de las soluciones (1 a la 5), utilizando el valor de
longitud de onda determinado en la experiencia anterior.

Fig 8. Espectgrafos


28
Registra los datos y elabora una grfica (en papel milimtrico) de absorbencia contra
concentracin (mg/ml), tomado solo los valores de los tubos del 2 al 5.

A partir de sta grfica, interpola el valor de la absorbencia de la muestra problema y
determina su concentracin.

Mtodo de Bradford

Esta tcnica se basa en la formacin de un ligando de color azul, que se obtiene por la
unin del azul de coomassie a las protenas.

Del estndar de protena empleado en el mtodo de Biuret (10 mg/ml), se hace una
dilucin adecuada para obtener una concentracin de 100 g/100 l. Esta solucin
resultante, se utilizar como estdar en el mtodo de Bradford.

A continuacin se preparan 7 tubos de ensaye, de acuerdo a la siguiente tabla de
distribucin de reactivos.

Tubo
No.
Estndar de protena
(l)
Solucin
amrtiguadora
TRIS (l)
Muestra
problema (l)
Reactivo de
Bradford (ml)
1 0 100 0 5
2 20 80 0 5
3 40 60 0 5
4 60 40 0 5
5 80 20 0 5
6 100 0 0 5
7 0 50 50 5

Se mezclan perfectamente cada uno de los tubos de ensaye y se determina la absorbencia
a una longitud de onda de 595 nm. Se calibra el espectrofotmetro con el tubo No. 1
(blanco).

OBSERVACIONES :

Tubo No.
2
3
4
5


29
Al igual que el mtodo anterior se registran los datos y se elabora una grfica (en papel
milimtrico) de absorbencia contra concentracin (g/ml), tomando slo los valores de
los tubos del 2 al 6.

Utilizando la grfica anterior, interpolar el valor de la absorbancia de la muestra
problema y determina su concentracin.

Realiza los siguientes clculos para expresar la concentracin de protena en mg/ml

( )( )( )
1000
20 lucin factordedi gprotena
ml
mgprotena

=

Se multiplica por 20, por haber tomado 50 l de muestra problema. De esta forma se
logra obtener el valor por ml (50 l x 20 = 1000 l =1 ml.

El factor de dilucin, es el numero correspondiente a la dilucin utilizada para ograr que
la muestra original tenga una concentracin del orden de g. Por ejemplo, si la dilucin
ser de 10, se divide entre 1000 para convertir los g a mg.

CUESTIONARIO

1. Cul es el fundamento del mtodo de Lowry para cuantificar protenas?
2. Cul es la estructura qumica del quelato que se forma en el mtodo de Biuret?
3. Calcula el porcentaje de error, entre los valores obtenidos (mg/ml) para la muestra
problema por el mtodo de Biuret y por el mtodo de Bradford (considerar el
mtodo de Bradford como 100% efectivo)
4. Cul es el criterio que se utiliza para determinar a que logitud de onda se debe de
leer la absorbencia de una muestra problema?
5. Qu es elcoeficiente de extincin molar de un compuesto?
6. Qu nos dice la ley de Lambert-Beer, en cuanto a la absorbencia y concentracin
de una solucin coloreada?
7. Qu funciones desempenan las protenas en los organismos vivos?
OBSERVACIONES :

Tubo No.
2
3
4
5
6


30
8. Cul es la razn por la cual, se utiliza la albmina de huevo como antdoto en
intoxicaciones con metales?
9. Cules son los tipos de protenas presentes en el suero sanguneo?

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFA CONSULTADA.


31

OBJETIVOS
- Demostrar que en la saliva existe actividad de la enzima -amilasa.
- Comprobar el efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de la
reaccin.
- Determinar el pH ptimo de la enzima -amilasa salival.
- Comprobar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzitica.
- Identificar un inhibidor de la enzima -amilasa.

INTRODUCCIN

La cintica qumica es la rama de la qumica que se encarga de estudiar la velocidad y los
mecanismos de las reacciones. Al aplicar esta rama general a la accin de las enzimas, se
habla entoces de la cintica enzimtica.

Se considera a la velocidad de la reaccin como una expresin de la rapidez con que
transcurre la misma y se puede calcular, bien como la cantidad de sustancias
reaccionantes que desaparecen en la unidad de tiempo o como la cantidad de productos
que se forman en la unidad de tiempo. Para los efectos de la presente prctica se van
utilizar para expresar la desaparicin del producto.

Entre los diferentes factores que modifican la velocidad de la reaccin enzimtica
tenemos:
1. Concentracin de la enzima
2. Concentracin de sustrato
3. Concentracin de coenzimas
4. pH
5. Temperatura
6. Inhibicin enzimtica.

De todos los anteriores, los que tendrn gran repercusin en la regulacin del
metabolismo celular son el 1, 2 y 6; en tanto que los otros estarn directamente
vinculados con el preceso de salud y enfermedad.

La -amilasa salival es una enzima del grupo de las hidrolasas y especficamente de las
endohidrolasas, antiguamente denominadna ptialina, se encuentra directamente
suspendida en una solucin de muy fcil obtencin, y es prcticamente la nica enzima
existente en la saliva.
PRCTICA # 4.- Cintica enzimtica


32

Uno de los aspectos en el que se debe tener especial atencin es el garantizar que durante
todo el tiempo en el que se est trabajando, no se vaya a producir inactivacin de estas
protenas. Existen mltiples factores que pueden inactivar a una enzima mediante su
desnatralizacin, que incluyen desde material de laboratorio sucio y por consiguiente
contaminado con otras sustancias que puedan ser agentes desnaturalizantes o inhibidores
de la enzima, hasta el poco control de la temperatura y el pH. Otra gran ventaja en la
utilizacin de la -amilasa salival es que la misma es relativamente termoestable y no se
desnaturaliza sino a temperauras elevadas.

La -amilasa va catalizar la hidrlisis de un enlace que se encuentra situado interiormente
en una macromolcula y no afecta en lo asoluto a los enlaces que se encuentran en los
extremos del sustrato. Ms especficamente esta enzima se cataloga como una -
endoglicosilasa porque cataliza la hidrlisis de los enlaces glicosdicos.

En la figura que aparece a continuacin aparece la estrucutra de la glucosa

O

Fig 9. Estructura de la Glucosa

En el almidn las unidades de -D-glucosa que lo componen, se unen entre s mediante el
establecimiento de enlaces -1-6-O-glicosdicos. En el almidn existen dos tipos de
cadenas diferente, una que no se encuentra ramificada llamada amilosa y otra que se
encuentra muy ramificada denominada amilopectina.

Fig 10. Esquema de la estrucutra helicoidal de la
Amilosa en el grano de almidn.

OH
OH
OH
OH
OH
Glucosa


33
Ambas molculas se imbrican entre s para dar lugar a la aparicin del grnulo de
almidn que constituye la reserva de combustible biolico en los vegetales.

La glucosa que forma el almidn tiene la propiedad de ser un monosacrido reductor
deido a la presencia en su estrucutra del denominado carbono anomrico; sin embargo el
almidn pierde esta caracterstica de ser un agente reductor, porque en su estrucutra todos
los carbonos anomricos de sus glucosas constituyentes se encuentran comprometidos en
la formacin de los enlaces glicosdicos, excepto unos pocos que forman los escasos
extremos reductores de la molcula; sin embargo la mayor parte de los extremos de esta
molcula son no reductores.

La propia estructura de la milosa permiti disenar una reaccin para la identificacin del
almidn que se puede hacer fcil y rpidamente en el laboratorio mediante la adicin del
yodo, el cual formara con la hlice del polisacrido un coplejo de inclusin de color azul,
tal como se muestraen el siguiente esquema.

Fig 11. Formacin del complejo de
Inclusin con el yodo.

La fragmentacin sucesiva del almidn determina que vayan apareciendo compuestos
que presentan diferente coloracin con el reactivo del lugol, lo cual constituye un
exelente indicador que permiteseguir el curso de la reaccin. Cabe destacar que los
productos finales obtenidos en este proceso son los disacridos maltosa e isomaltosa y el
trisacrido isomaltotriosa, sin que pueda alcanzarse la formacin de la glusoca, pues el
enlace glicosdico existente en estos disacridos es un enlace externo y la enzima no es
especfica para l.

MATERIAL REACTIVOS

Beaker 50 ml Acido tricloroactico
10 Tubos de ensayo 12 x 100 Agua destilada
KCl, KBr, KF
Buffer fosfato 4.9, 6.3, 6.9,
7.5 y 8.9
Lugol
Enzima


34

DESARROLLO

Recoleccin de la muestra de la saliva y preparacin de la solucin de la enzima

Lo primero que se debe hacer es recolectar la muestra de la saliva para obtener una
solucin de enzima. Para ello enjuguese la boca varias veces son agua corriente y
proceda a recoger en un beaker de 50 ml limpio aproximadamnete 2 ml de saliva.
Adicinele a la saliva recogida 10 ml de agua destilada y mzclela bien. Filtre esta
solucin de saliva y rotule a este tubo de ensayo como solucin de enzima.

Experimento # 1
Demostracin de la Actividad de la -amilsica en la saliva

Prepare 5 tuos de ensayo con 0.5 ml de cido Tricloroactico (TCA) cada uno y rotlelos
del 0 al 4. Prepare adems un tubo de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente. A
este tubo de ensayo le llamaremos tubo de reaccin.

REACTIVOS CANTIDAD
Almidn 1.0 ml
Agua destilada 4.9 ml
Cloruro de potasio 1.0 ml
Buffer fosfato pH 6.9 0.1 ml

Agite bien este tubo de ensayo y proceda a adicionarle 1 ml de solucin de enzima e
inmediatamente, sin perder el tiempo proceda a gitar y a extraer 1 ml de ese tubo y
adicionarlo rpidamente al tubo rotulado 0 y al mismo tiempo comience a medir el
tiempo. Cada minuto subsiguiente usted debe repetir el paso anterior, es decir extraer una
porcin alcuota de 1 ml del tubo de reaccin e irla adicionando a los tubos que contienen
el (TCA) hasta alcanzar el tubo marcado 4 minutos.

De inmediato adicinele a cada uno de los tubos de ensayo 2 gotas de reactivo de lugol.
A continuacin dibuje en los espacios correspondientes los resultados obtenidos con cada
uno de los tubos de ensayo despus de haber anadido el lugol.

Recuerde agitar el tubo de ensayo cada vez que anada la porcin de
alcuota


35
Explique los resultados obtenidos

Experimento # 2
Efecto de la concentracin de la enzima
sobre la velocidad de la reaccin.

Prepara 4 tubos de ensayo de la forma siguiente:

TUBO #
REACTIVO
1 2 3 4
Buffer pH 6.9 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml_
KCl 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml
Almidn 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Agua destiladao 1.2 ml 1.1 ml 1.0 ml 0.9 ml
Enzima 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml 0.4 ml


36

Para detener la reaccin anada 0.2 ml de TCA a cada tubo de ensayo despus de haber
transcurridos 4 miutos de reaccin. Es decir se proceder de la misma forma secuencial
con que se anadi la enzima, de esta manera a los 4 minutos de haber adicionado la
enzima al tubo # 1 ser que debe agregar el TCA a ese tubo y a los restantes se les
adicionar el cido en intervalos de 30 segundos.

Despus de haber retenido la reaccin en todos los tubos de ensayo, proceda a agregarle a
todos los tubos 2 gotas del reactivo de lugol y observe los resultados obtenidos
reflejndolos en el dibujo que debe pintar a continuacin

Explique los resultados obtenidos

Recuerde que el tiempo de reaccin es necesario controlarlo
cuidadosamente de manera que la enzima acte en todos los grupos de
ensayo de igual manera; para ella no adicione la enzima hasta no haber
preparado los todos los tubos de ensayo y haberlos agitado. Comience el
trabajo aadiendo al tubo # 1 la solucin de enzima y agite nuevamente,
mida el tiempo en ese momento, transcurridos 30 segundos anada la
enzima al tubo # 2, al cabo de otros 30 segundos se le adiciona al tubo # 3
y al tubo # 4 se le adicionar la enzima despus de otros 30 segundos.
Recuerde que siempre debe agitar los tubos de ensayo.


37

Experimento # 3
Determinacin del pH ptimo de la
-Amilasa salival

Prepara 5 tubos de ensayo de acuerdo a las indicaciones siguientes:

TUBO #
REACTIVO
1 2 3 4 5
Buffer pH 4.9 0.1 ml _ _ _ _
Buffer pH 6.3 _ 0.1 ml _ _ _
Buffer pH 6.9 _ _ 0.1 ml _ _
Buffer pH 7.5 _ _ _ 0.1 ml _
Buffer pH 8.9 0.1 ml
KCl 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml
Almidn 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Agua destilada 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Enzima 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Para agregar la enzima debe tener los mismos cuidados que con la reaccin anterior en el
control del tiempo, es decir irla adicionando secuencialmente cada 30 segundos y de igual
forma se debe agregar el TCA para detener la reaccin a los 4 minutos exactos de haber
anadido la enzima.

Una vez concluidos todos los pasos anteriores adicione 2 gotas de lugol a cada uno de los
tubos de ensayo y dibuje los resultados en el espacio siguiente:


38

Escriba el pH ptimo de la enzima y explique cmo llega usted a esa conclusin.

Experimento # 4
Efecto de la temperatura sobre la velocidad
de la reaccin enzimtica.

Prepare 3 tubos de ensaye de acuerdo con las indicaciones siguientes:

TUBO #
REACTIVO
1 2 3
Agua destilada 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Buffer pH 6.9 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml
KCl 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml
Almidn 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Enzima 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Despus de preparados los tubos de ensayo; PERO ANTES DE ADICIONAR LA
ENZIMA, coloque eltubo # 1 durante 5 minutos en el bano de hielo y el tubo # 3 en el
ano de agua en ebullicin. Transcurridos estos 5 minutos y sin sacar los tubos de sus
respectivos banos de incubacin, anada la solucin de enzima y controle que el tiempo de
reaccin sea de 4 minutos, adicionando el TCA en el momento apropiado.

Agrguele acada tubo de ensayo 2 gotas de lugol, observe los resultados y dibjelo en el
espacio siguiente:


39

Qu explicacin le da usted a los hallazgos encontrados?

Experimento # 5
Identificador del Cofactor y de un Inhibidor
De la enzima -Amilasa salival

La enzima -Amilasa salival requiere como cofactor de la presencia de iones cloruro; sin
embargo los iones fluoruro constituyen un inhibidor de la enzima y los bromuros no
afectan la velocidad de la reaccin. Sobre esta base se han preparado 3 soluciones en las
que en cada una de ellas se ecuentra uno de los iones mencionados, en forma de su sal de
potasio. Siguiendo las intrucciones que se brindan en el cuadro siguiente prepare 3 tubos
de ensayo.

TUBO #
REACTIVO
1 2 3
Solucin KCl 0.2 ml _ _
Solucin KBr _ 0.2 ml _
Solucin KF _ _ 0.2 ml
Buffer pH 6.9 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml
Almidn 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Agua destilada 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Enzima 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml


40

Recuerde adicionar la enzima de forma secuencial para controlar el tiempo y detener la
reaccin con el TCA a los 4 minutos exactos despus de haberse inicado la misma.

Anada a cada tubo de ensayo 2 gotas de lugol y observe los resultados.Exprselos
mediante un dibujo en el espacio siguiente:

Cul es la solucin que se comporta como inhibidora, cul la activadora y cul la inerte,
y cmo pudo diferencarlas?

CUESTIONARIO

1. Por qu se utiliza la saliva como material biolgico en esta prctica?
2. Qu funcin desempena el TCA?
3. Cmo detect la actividad enzimtica de la saliva?
4. Qu factores estudiados afectaron la velocidad de la reaccin enzimrica?. Por
qu?
5. Cul es el pH ptimo de la enzima y cmo lo determin?
6. Cul fue la susancia activadora y cul la inhibidora? Cmo la pudo determinar?

CONCLUSIONES



41

OBJETIVO

- Relacionar el consume de glucose con los cambios de pH producidos por las
levaduras
- Describir las vas por las cuales la glucose genera los cambios de pH.
- Interpretar el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre la salida de
protones.

INTRODUCCIN

La degradacin oxidativa de los alimentos a dixido de carbono y agua es exergnica (la
oxidacin de la glucosa de la reaccin 1)
mol kcal F
O H CO O a Glu
o
/ 686
6 6 6 cos
2 2 2
= A
+ +
(1)

Esta energa se libera en las clulas al pasar los substratos a travs de varias rutas
bioqumicas. La energa liberada en las diversas rutas es variable. Al oxidarse totalmente
la glucosa en el sistema glicoltico, ciclo de Krebs y sistema transportador de electrones
(unos -590 kcal/mol de glucosa). Este hecho se pone de manifiesto al considerar el
transporte de electrones por molcula de glucosa y la energa liberada durante la
oxidacin de los tranportadores de electrones iniciales (por ejemplo, oxidacin de DPNH,
reaccin 2).
mol Kcal F
O H DPN O DPNH H
/ ' 52
2
1
0
2 2
= A
+ + + +
+
(2)

Parte de esta energa, liberada por los alimentos durante su degradacin es retenida por
las clulas como una forma especial de energa qumica (reactividad qumica), que se
almacena en los enlaces fosfato anhidro del ATP. Las fosforilaciones del ADP que
resultan en formaciones de ATP o almacenamiento de energa, se clasifican en dos tipos:
- Fosforilaciones a nivel substrato y
- Fosforilaciones de transporte de electrones.

PRCTICA # 5.- Fosforilacin Oxidativa


42
En la fosforilacin a nivel del substrato, el ATP se forma como consecuencia de la
interconversin de un substrato que no es un transportador de electrones.

El segundo tipo de fosforilacin, la oxidacin del substrato se acompana de la reduccin
de un primer aceptor de electrones como DPN+, TPN+ o una flavina (FAD o FMN) y que
durante la subsiguiente transferencia de estos electrones al O
2
tienen lugar fosforilaciones
del ADP.

El mecanismo molecular de la fosforilacin oxidativa ha constituido durante mucho
tiempo, un interesante problema a resolver. Se han realizado muchos intentos
experimentales para aclarar las etapas intermedias. Uno de los mtodos ha sido el empleo
de inibidores especficos para efectuar la diseccin del proceso global en reacciones
individuales.

La fosforilacin oxidativa resulta influida por cierto nmero de agentes qumicos entre
los que se encuentran los desacoplantes y los inhibidores.

Los agentes desacoplantes permiten la continuacin del transporte electrnico, pero
impiden la fosforilacin del ADP a ATP; es decir desacoplan a las reacciones que
producen energa de las que la conservan.

Su caracterstica es que estimulan la velocidad de consumo de oxgeno de las
mitocondrias intactas en ausencia de ADP. Adems, provocan que las mitocondrias
aumenen su actividad hidroltica sobre el ATP, mientras que en ausencia de agentes
desacoplantes, la actividad ATPsica de la mitocondria es muy dbil. Los agentes
desacoplantes pueden promover el paso de H
+
a travs de la membrane mitocondrial, que
normalmente es impermeable a dichos iones.

Los inhibidores de la fosforilacin oxidativa, impiden tanto la estimulacin del consumo
de oxgeno por el ADP, como la fosforilacin del ADP a ATP. Impiden el mecanismo de
formacin de ATP que utilice el intermediario de energa elevada, o sea el estado
producido por el transporte de electrones.

A consecuencia de ello, el transporte de electrones no puede continuar, a menos que se
utilice y consuma el intermediario o el estado de energa elevado.


43

Fig. 12 Ruta que siguen los protones en la levadura.

MATERIAL REACTIVOS

2 vasos de precipitados de 100 ml Susp. de levaduras 200 mg/ml
2 pipetas de 5 ml Glucosa al 10%
Pipeta de 10 ml Dinitrofenol 40mM en etanol
Potencimetro NaN
3
400 mM
Papel milimtrico Agua destilada

Preparacin del Control

Si las levaduras consumen glucosa, con el tiempo se observar una disminucin
progresiva de su concentracin en el medio de cultivo y cambios en el pH extracelular.

Glucosa
Etanol
Glucosa
H
+
ADP
ATP
H
+
ADP ATP
H
+
H
+
Acetaldehdo
Mitocondri
a
H
+
ADP
P
ATP
P
ADP ATP
P
NA
D
NADH


44
Diluir 5 ml de la suspension de levaduras con 40 ml de agua destilada. A partir de esta
solucin se debe determiner el pH cada 5 minutos durante 10 minutos, para as obtener la
lnea basal.

Adicionar 5 ml de glucosa al 10%, posteriormente determiner el pH de la solucin cada 5
minutos durante 20 minutos, y luego cada 10 minutos hasta completer 30 minutos.

DETERMINACIN Tiempo(min) pH
1.
Levaduras
5
10
2
Levadura + Glucosa
5
10
15
20
3
Levadura + Glucosa
10
20
30

Efecto de un Desacoplante

Diluir 5 ml de la suspensin de levaduras con 40 ml de agua destilada. Anadir 0.2 ml de
la solucin de Dinitrofenol 40 mM (concentracin final de 200 mM). Se repiten las
operaciones que se realizaron en la seccin anterior para determinar el pH cada 5 minutos
durante 10 minutos; adicionar la glucosa y nuevamente determinar el pH hasta completar
30 minutos.

1.
Levaduras
5
10
2
Levadura + Glucosa
5
10
15
20
3
Levadura + Glucosa
10
20
30


45
Efecto de un Inhibidor

Diluir 5 ml de la suspensin de levaduras con 40 ml de agua destilada. Agregar 0.5 ml de
la solucin de azida de sodio 400 mM (concentracin final de 5 mM). Nuevamente
repetir las experiencias como las secciones anteriores para determinar pH.

1.
Levaduras
5
10
2
Levadura + Glucosa
5
10
15
20
3
Levadura + Glucosa
10
20
30

CUESTIONARIO

1. Hacer una grfica de cada uno de los experimentos, utilizando los valores de las
lecturas de pH contra tiempo.
2. Cul es el significado de los cambios de pH con desacomplante y con inhibidor?
Comparer con el control.
3. Hacer una relacin de las vas que producen estos cambios, tomando en cuenta
que: las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitochondrial
que se encarga de sintetizar ATP; y que tiene otra ATPasa de protones en la
membrane plasmtica cuya function es similar a la bomba de Na
+
/K
+
de las
clulas de los mamferos. (Ver figura 12).

CONCLUSIONES

Cuidado al manejar dinitrofenol y la azida de sodio ya que son muy
txicos. Lavarse las manos despus de su manejo.


46


47

OBJETIVO

- Utilizando la tcnica de polarografa (electrodo de oxgeno), medir los cambios en
la velocidad de consumo de O
2
en mitocondrias de hgado de rata; en estado 3, en
estado 4, en presencia de un inhibidor y/o desacoplante.

INTRODUCCIN

El acoplamiento estrictamente obligado entre las reacciones de transferencia de
electrones y las reacciones de la fosforilacin oxidativa, puede ser muy bien ilustrado con
el experimeto que se propone a continuacin.

El transporte de electrones en la mitocondria, puede ser monitoreado midiendole la
velocidad en el consumo de oxgeno por una suspensin de mitocondrias de hgado. El
consumo de O
2
puede ocurrir rpidamente despus de la adicin de un sustrato oxidable
(el donador de electrones), de ADP (aceptor de fosfato) y fosfato. El estado activoen
presencia de sustrato y ADP se ha designado como estado 3 y es una situacin en la cual
ocure una rpida transferencia de electrones, consumo de oxgeno y una rpida sntesis de
ATP.

Despus de la conversin de todo el ADP adicionado a ATP, la velocidad de
transferencia de electrones vuelve a ser la misma que se observ antes de la adicin de
ADP. Por lo tanto, la respiracin est acoplada a la sntesis de ATP, esta relacin ha
recibido el nombre de control respiratorio o control de aceptor de fosfato. La razn de la
velocidad de respiracin entre el estado activo (estado3) y el estado de reposo (estado
4), se ha denominado como razn del control respiratorio y es una medida de la
efectividad del acoplamiento entre la transferencia de electrones y la fosforilacin
oxidativa.

Preparaciones de mitocondrias danadas y preparaciones a las cuales se les ha adicionado
un desacoplante, exhiben una baja razn del control respiratorio, indicando que la
integridad de la membrana mitocondrial se requiere para el acoplamiento.

Despus de la adicin de ADP, el cual aumenta la velocidad de respiracin (estado 3), se
puede agregar un unhibidor de la fosforilacin oxidativa como la oligomicina (realmente
un inhibidor de la ATPasa mitocondrial), la oligomicina detiene la sntesis de ATP, y
como el proceso de transporte de electrones y la sntesis de ATP estn acoplados, la
respiracin (transporte de electrones) se inhibe casi completamente.
PRCTICA # 6.- Acoplamiento de la fosforilacin oxidativa
y la cadena de transporte de electrones


48

Si despus de la inhibicin del consumo de oxgeno y la sntesis de ATP, se adiciona un
desacoplante (2,4-Dinitrofenol o FCCP), ste casua un rpido consumo del oxgeno.
Como la respracin o transporte de electrones est ahora desacoplado de la sntesis de
ATP, el transporte de eletrones continua pero la sntesis de ATP podra no ocurrir.

Debe notarse que la regulacin de la velocidad de respiracin de un tejido por el
suministro del aceptor de fosfato (ADP), es una situacin fisiolgica normal. Por
ejemplo, cuando el msculo es ejercitado, el ATP se descompone en ADP y P
i
, y la
creatinina fosfato es convertida a creatinina conforme el enlace fosfato de alta energa es
transferido para formar ATP por medio de la creatinina fosfocinasa.

Conforme se acumula el ADP durante la actividad muscular, la respiracin o consumo de
oxgeno es activado, y la energa generada de esta forma, permite que los niveles de ATP
y creatinida fosfato se normalicen.

MATERIAL REACTIVOS

Rata macho Hielo escarchado
Material de diseccin Medio 1
Pipetas de 1 y 5 ml Medio 2
Homogenizador Medio 3
2 Tubos para centrfuga de 25 ml Reactivo de Bradford
Ultracentfuga refrigerada Reactivo de Biuret
Gasa Estndar de protena
8 Tubos de ensaye Soln. amortiguadora Tris
Oxmetro con graficador Glutamato/malato 2.5 mM
/2.5 mM
Micropipetas ADP 112.5 mM
Microjeringas Antimicina A 1 mg/ml
Espectrofotmetro 2,4-dinitrofenol 40 mM
Bano Mara
Papel milimtrico

DESARROLLO

Aislamiento de Mitocondrias

Sacrificar por decapitacin una rata de peso entre 150 y 250 gr; dejarla desangrar,
extraerle el hgado y colocarlo en un vaso que contenga medio 1 previamente enfriado (a
partir de sta experiencia, es necesario trabajar con todos los recipientes y medios de
aislamiento sumerjidos en hielo escarchado).


49
Se corta el hgado en pequenos trozos y se hacen dos lavados con medio 1, para evitar un
exceso de sangre. Posteriormente se trasvasa el hgadp a un tubo homogenizador fro, se
le adiciona aproximadamente 20 ml de medio 1. Homegenizar con el homogenizador.

Se reparte el homogenizado por partes iguales en dos tubos de centrfuga fros y se
adiciona medio 1 hasta partes del volmen del tubo.

Centrifugar los tubos a 2500 -3000 rpm durante 10 minutos, en una centrfuga refrigerada
a 4C. Se recupera el sobrenadante de los tubos y se adiciona medio 1 hasta partes del
volmen del tubo.

Nuevamente centrifugar los tubos a 7500 rpm durante 10 minutos, en una centrfuga
refrigerada a 4C.

Decantar y resuspender; el sobrenadante se desecha y el precipitado que ya contiene las
mitrocondria se resuspende con la tcnica de dedo fro utilizando aproximadamente 2
ml de medio 1 (limpiar con gasa los lpidos que se depositan alrededor del tubo de
centrfuga).

Adicionar medio 1 a los dos tubos, hasta partes del volmen del tubo y centrifugar los
tubos a 7500 rpm durante 10 minutos, en un centrfuga refrigerada a 4C.

Decantar y resuspender al igual que la experiencia anterior, pero utilizando medio 2 para
resuspender.

Centrifugar los tubos a 9000 rpm durante 10 minutos, en una centrfuga refrigerada a 4C.
Decantar y resuspender en medio 2, utilizando solamente 1 ml para los dos tubos, y reunir
las dos suspensiones en un solo tubo.

Determinacin de Protenas

Se determina la concentracin de protenas de la suspensin mitocondrial resultante en el
primer experimento, empleando el mtodo de Biuret o de Bradford (ver la prctica 2 de
este manual).

Consumo de Oxgeno por la Suspensin Mitocondrial

Colocar 2900 l de medio 3 en la cmara receptora de la muestra del oxmetro.
Equilibrar el medo 3 con aire a 25C y con agitacin continua, para esto se selecciona en
el oxmetro la posicin de aire (AIR) y se calibra a 100%. Se coloca el graficador en
escala total (100% de aire) y se asegura el control de calibracin (CAL).

La muestra mitocondrial (1 a 10 l) se introduce en la cmara, se debe tener cuidado que
la concentracin mitocondrial no debe ser mayor de 2 3 mg/ml.


50
Posterirmente es necesario establecer la lnea base de actividad para la muestra,
adicionando 20 l de glutamato/malato (2.5 mM/2,5 mM) y dejar correr la reaccin 40
50 segundos (estado 4).

Adicionar 8 l de ADP 112.5 mM y dejar que ocurra la reaccin hasta que todo el ADP
sea utilizado (estado 3). Esto ocurre cuando la curva en el graficador regresa a estado 4.

Adicionar 3 l de antimicina A 1mg/ml y dejar correr la reaccin de 40 a 60 segundos.
Adicionar 15 l de 2,4-dinitrofenol 40 mM y dejar correr la reaccin 6 segundos.
Desprender el papeldel graficador para su anlisis.

CUESTIONARIO

1. Cules fueron las concentraciones resultantes en la cmara receptora de la
muestra, para glutamato/malato, ADP, antimicina A y 2,4-diitrofenol?
2. Elaborar un grfico en el cual se senalen los diferentes puntos de adicin a la
muestra mitocondrial y explicar los cambios de pendiente en la misma.
3. Cul es el fundamento del funcionamiento del electrodo de O
2
?
4. Qu parmetro es necesario conocer, para determinar la cantidad de O
2
disuelto
en el medio colocado en la cmara?

CONCLUSIONES



51

REACTIVO DE BRADFORD

Disolver 100 mg de Azul de Coomassie brillante (BLUE-G-250) en 50 ml de etanol al
95%, agregar 100 ml de H
3
PO
4
al 85% (p/v) y diluir con agua hasta 1000 ml. Guardar en
frasco de color mbar.

REACTIVO DE BIURET

Disolver 3 gr de CuSO
4
5H
2
O y 9 gr de tartrato sdico potsico en 500 ml de NaOh 0.2
M, agregar 5 gr de KI y diluir con NaOH 0.2 M hasta 1000 ml. Guardar en frasco mbar.

SOLUCIN AMORTIGUADORA TRIS

Disolver 0.60570 gr de Tris-base (5 mM), 10.43709 gr de KCl (140 mM) y 0.3722 gr de
EDTA (1 mM), en 1000 ml de agua y ajustar el pH a 7.4.

UREASA

Tritura y moler 1.5 gr de semillas de soya o de haba, al polvo resultante se le adicionan
10 ml de un amortiguador de fosfatos 0.1 M a pH 7.01 conteniendo 5 mM de 2-
mercaptoetanol y se agita durante 1 hora. Se centrifuga la suspensin a 2000 rpm por 15
minutos. El sobrenadante se utiliza como solucin stock de enzima. Se guarda a
temperatura de 3-5C.

REACTIVO DE FENOL

Disolver 4.7 gr de fenol grado reactivo en 100 ml de agua desionizada o destilada que
contenga 7.5 ml de un blanqueador comercial (NaOCl al 5%). Burbujear gas Cl
2

(KClO
3
+HCl) en la solucin y almacenar en frasco color mbar a 4C.

APENDICE


52
MEZCLA DE AMINOACIDOS

Disolver 0.12 gr de los aminocidos disponibles (tratar de que sea una cantidad
proporcional de cada uno, pero el peso total debe ser 0.12 gr) y disolverlos en 50 ml de
agua destilada. La concentracin final es de aproximadamente 0.02 M

DINITROFENOL

Disolver 0.0756 gr (40 mM) de 2,4-dinitrofenol en 10 ml de etanol.

AZIDA DE SODIO

Disolver 0.26 gr (400 mM) de Na N
3
en 10 ml de agua destilada.

MEDIO 1

Manitol 40.08 gr (220 mM), sacarosa 23.96 gr (70 mM), MOPS 0.4186 gr (2mM) y
EGTA 0.3804 gr (1 mM), para disolver en 1000 ml de agua desionizada. El EGTA se
disuelve en la mnima cantidad de KHO antes de adicionarse. El pH se ajusta a 7.4.

MEDIO 2

Se prepara igual que el medio 1, pero sin EGTA.

MEDIO 3

KCl 0.3728 gr (100 mM), KH
2
PO
4
0.03402 gr (5 mM), MgCl
2
0.03049 gr (3 mM) y
HEPES 0.11915 gr (10 mM), se disuelven en 50 ml de agua desionizada. Se ajusta el pH
a 7.4.


53

1. Donald Voet / Judith G. Voet, 1992
Bioqumica
Ediciones Omega, Barcelona.

2. J.M. Clark
Bioqumica Experimental
Ediciones Acribia, Zaragoza Espana.

3. Freifelder D.
Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular, 1981
Editorial Revert, Espana.

4. Lehninger, 1995
Principios de Bioqumica
Segunda edicin. Omega

5. Devlin, Thomas M, 2000
Bioqumica con aplicaciones clnicas
Tercera edicin. Ed. Revert.

6. Mathews Van Hold, 2002
Bioqumica
Addison Wesley, Espana.

BIBLIOGRAFA DE
REFERENCIA

Manual de Bioquimica I

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