MTODO PARA DETERMINAO DE RESDUOS DE CLORPIRIFS EM ALFACE POR CROMATOGRAFIA A LQUIDO DE ALTA EFICINCIA*

MARILENA FERREIRA PENA *** ELIANE HOOPER AMARAL **** EDUARDO VON SPERLING ***** IVAN CRUZ
**

Este trabalho prope mtodo de anlise de resduos de Clorpirifs em amostras de alface por cromatografia a lquido de alta eficincia (CLAE). A anlise foi realizada em cromatgrafo Shimadzu, com detector de ultravioleta ajustado em 229 nm, Coluna C-18, modelo Zorbax ODS (4,6 mm x 25 cm, 5 m), fluxo de 1 mL/min e temperatura de 35C. Usou-se Metanol:gua (82:18) como fase mvel e volume injetado de 50 L. Amostras de alface (20 g) foram trituradas e homogeneizadas na presena de 50 mL de Diclorometano (DCM). O material foi filtrado a vcuo e evaporado a temperatura de 50C. O resduo foi retomado com fase mvel, agitado, desgaseificado, filtrado em membrana 0,22 m e injetado no cromatgrafo (injetor automtico). Os resultados do teste de repetitividade mostraram recuperao mdia de 101,91%. O mtodo proposto simples e rpido para determinao de resduos de Clorpirifs em amostras de alface.

PALAVRAS-CHAVE: INSETICIDA ORGANOFOSFORADO; CLORPIRIFS; CLAE; ALFACE.

Pesquisa desenvolvida no Laboratrio de Agroqumica da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, Brasil, como parte da Tese de doutoramento do primeiro autor. ** Doutoranda em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hdricos, Escola de Engenharia, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte; Bolsista CAPES (e-mail: marilena@uaimail.com.br). *** Responsvel Tcnica pelo Laboratrio de Resduos de Agrotxicos, Instituto Mineiro de Agropecuria (IMA), Belo Horizonte (e-mail: elianehooper@yahoo.com.br). **** Engenheiro Civil e Sanitarista, Doutor, Professor Titular do Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental (DESA), UFMG, Belo Horizonte (e-mail: eduardo@desa.ufmg.br). ***** Doutor em Entomologia, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo, Belo Horizonte (e-mail: ivancruz@cnpms.embrapa.br).

Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 13, jan./dez. 2003 Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 13, p. 37-44, jan./dez. 2003

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1 INTRODUO Clorpirifs [0,0-dietil-0-(3,5,6-tricloro-piridil)-fsforo-tionato], pertencente ao grupo dos inseticidas organofosforados, apresenta baixa solubilidade em gua (1,39 mg/L) e alto coeficiente de soro no solo (Koc= 8498 mL/g) (21). altamente txico e muito perigoso para o meio ambiente (Classe II), sendo que o limite mximo permitido para resduos de Clorpirifs (em gros, vegetais e pastagens) varia de acordo com a cultura (3). Est registrado para o controle de diversas pragas (moscas, lagartas, caros, pulges e outros), que atacam diversas culturas entre as quais milho, soja, trigo, sorgo, feijo, caf, algodo, citros, ma, banana, batata, cenoura, repolho, tomate, couve e fumo. Clorpirifs encontra-se entre os principais inseticidas comercializados no Brasil (12), sendo indicado (6, 24, 25) para aplicaes via irrigao por asperso (quimigao). Age sobre os insetos por contato, ingesto e fumigao (4). Como inibidor da colinesterase causa sndrome colinrgica, sendo, portanto, neurotxico (1,16,24). Sua toxicidade aguda (DL50) oral em ratos de 135-163 mg/kg e a dermal de 202 mg/kg (15). Os inseticidas organofosforados (geralmente, muito txicos) constituem um dos principais responsveis por intoxicaes ocupacionais no campo. Quimicamente so steres do cido fosfrico ou de cidos derivados desse. Quando comparados com os clorados so considerados mais txicos, entretanto, no se acumulam em tecidos gordurosos. Como organofosforado, face elevada lipossolubilidade que apresenta, Clorpirifs absorvido pelo organismo humano, especialmente pela pele, alm de membranas mucosas e pela via respiratria. O impacto na sade do trabalhador rural est associado exposio no momento de preparo da calda, aplicao na lavoura e durante a colheita. A absoro pelo trato gastrointestinal, normalmente, ocorre em intoxicaes acidentais, suicdios e homicdios. Tambm pode ocorrer pelo consumo de frutas e verduras in natura contaminadas e destinadas ao consumo sem que o perodo de carncia do agrotxico seja observado (16,24). Hortalias e frutas comercializadas de vez e acondicionadas em geladeira podem sofrer alteraes no nvel de resduos (como inativao, degradao ou mesmo acrscimo do referido nvel), conforme observado em caquis (9) e mangas (20). Usando a cromatografia, mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura (7,18), tem sido propostas vrias metodologias para anlise de resduos de agrotxicos em alimentos. Mtodos desenvolvidos nas dcadas de 60 e 70 por diferentes autores (14,17,19 e 23) constituem os mais usados. Tais mtodos so trabalhosos, mas permitem a identificao simultnea de mais de uma centena de princpios ativos a partir da extrao com solventes orgnicos e procedimentos de retirada de impurezas. A presena de interferentes nos alimentos vegetais, co-extrados nas etapas de limpeza (e atribudos a taninos, pigmentos, gorduras, dentre outros) em produtos como batata, tomate e hortalias, comprometem a seletividade dos mtodos e dificultam a obteno de resultados em curto espao de tempo, importante principalmente em anlise de alimentos muito perecveis (11). Conforme GUIMARES (13), separaes difceis so, geralmente, conseguidas mais facilmente pela cromatografia a lquido de Alta Eficincia (CLAE) do que pela Cromatografia em Fase Gasosa (CG). Mesmo apresentando limitaes como alto custo de instrumentao e operao, a CLAE tem sido cada vez mais usada em anlises de resduos de agrotxicos pela versatilidade. Pode ser aplicada para compostos orgnicos e inorgnicos, em amostras lquidas ou slidas, inicas ou covalentes. Anlises de multirresduos de agrotxicos em alimentos, usando a Cromatografia em Fase Gasosa (CG), tm revelado a presena de Clorpirifs em culturas para as quais no est autorizado (incluindo alface). Nveis acima do permitido em culturas autorizadas tambm so verificados, muitas vezes como resultado de contaminao ambiental acidental ou pelo desrespeito s boas prticas agrcolas (2). A alface, hortalia consumida crua e muito popular no Brasil, constitui fonte de vitaminas e sais minerais. comumente cultivada em hortas domsticas e comerciais, juntamente com outras culturas como couve, repolho e tomate, para as quais o Clorpirifs est autorizado. O desenvolvimento de

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novos mtodos cromatogrficos para determinao de resduos de agrotxicos usados em grande nmero de culturas assume importncia, principalmente, pelo uso reduzido de solventes orgnicos resultando em menor exposio do analista e menor volume de descarte de solventes e pela seletividade do mtodo, que favorece a obteno de resultados rpidos e de forma menos onerosa. Este trabalho teve como objetivo propor mtodo rpido e simples de determinao de resduos de Clorpirifs em amostras de alface, usando a Cromatografia a Lquido de Alta Eficincia (CLAE).

2 MATERIAL E MTODOS 2.1 CONDIES CROMATOGRFICAS PARA ANLISE DE CLORPIRIFS Utilizou-se Cromatgrafo a Lquido de Alta Eficincia Shimadzu, modelo Class LC-10, com detector de ultravioleta, modelo SPD 10A: 229 nm. Foram estabelecidas as seguintes condies cromatogrficas: Coluna C-18, modelo Zorbax ODS (4,6 mm x 25 cm x 5 m), SUPELCOSIL LC-18, Pr-Coluna C-18, modelo Zorbax ODS (4,6 mm x 2 cm), SUPELGUARD LC-18, Metanol-gua (MeOH:H2O) na proporo 82:18 como fase mvel, temperatura de 35C, Fluxo de 1 mL/min e volume de injeo de 50 L. Para a calibrao do cromatgrafo foi utilizada a tcnica do padro externo. As curvas de calibrao foram obtidas com duas sries de solues padres de Clorpirifs com concentraes entre 0,0625 e 1,00 g.mL-1 (R2 = 0,99984) e entre 1,00 e 5,00 g.mL-1(R2=0,99976).

2.2 PROCEDIMENTO PARA DETERMINAO DE CLORPIRIFS EM ALFACE Folhas de alface picadas e pesadas (20 g) foram colocadas em bqueres de 500 mL, trituradas e homogeneizadas por aproximadamente 30 segundos, na presena de 50 mL do solvente Diclorometano (DCM). O material foi filtrado a vcuo, sendo usados kitazatos de 500 mL, funis de Bchner, rolhas de silicone e filtros de papel Whatman nmero 1. O filtrado foi submetido evaporao do solvente, em temperatura de banho-maria mxima de 50oC. O resduo foi retomado com 5 mL da fase mvel (MeOH:H2O), agitado, desgaseificado em aparelho de ultra-som, filtrado em filtro de membrana 0,22 m e injetado no CLAE com auxlio de injetor automtico. Durante o preparo das 100 (cem) amostras, cuidado especial foi tomado na limpeza do material no-descartvel. O triturador foi limpo com papel toalha e acetona, aplicada com auxlio de pisseta aps triturao de cada amostra. Toda a vidraria foi lavada com detergente, gua corrente e gua desmineralizada.

3 RESULTADOS E DISCUSSO 3.1 PERFORMANCE ANALTICA Obteve-se limite de deteco (LD) de 0,02 g.mL -1, limite de quantificao (LQ) de 0,03 mg.Kg-1 e percentagem de recuperao de 101,91%. Apesar do tempo de reteno (sada do pico de Clorpirifs no cromatograma) de aproximadamente 12 minutos obtido nas condies cromatogrficas estabelecidas, o tempo de corrida mnimo necessrio para que os compostos da amostra (alface) sejam eludos da coluna de 60 minutos. Sendo assim, cem (100) amostras de alface foram analisadas em corridas programadas para 60 minutos, em grupos de 10, intercaladas por corrida do padro

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Clorpirifs de 5 g.mL-1. Na Figura 1 podem ser observados diversos picos aps o tempo de reteno do Clorpirifs (12 minutos), representando a eluio de diferentes compostos presentes na alface. FIGURA 1 - MULTICROMATOGRAMA APRESENTANDO CORRIDA TOTAL DE EXTRATOS (AMOSTRAS 99, 98, E 97) OBTIDOS DE AMOSTRAS DE ALFACE FORTIFICADAS + PADRO CLORPIRIFS (5 g.mL-1)

O resultado da determinao residual de Clorpirifs por CLAE em duas amostras de campo (plantas de alface expostas aplicao de Clorpirifs) e uma amostra-testemunha (planta de alface no-exposta e livre da presena de Clorpirifs) apresentado na Figura 2.

3.2 TESTE DE REPETITIVIDADE Os resultados encontrados no teste de repetitividade das injees de 50 L das solues (LQ, 2 LQ e 10 LQ) de Clorpirifs, diludas em fase mvel, foram avaliados em funo do tempo de reteno (Tabela 1), da rea (Tabela 2) e da concentrao (Tabela 3). O multicromatograma obtido est apresentado Na Figura 3. TABELA 1 - REPETITIVIDADE DAS INJEES DE CLORPIRIFS (g.mL-1), EM FUNO DO TEMPO DE RETENO (TR)

SOLU O

g.m L

-1

TR1

TR2

TR3

CV

LQ 2 LQ 10 LQ

0,03 0,06 0,30

12,82 12,84 12,81

12,80 12,82 12,81

12,82 12,80 12,81

12,81 12,82 12,81

0,011 0,010 0

0,09 0,08 0

CV = Coeficiente de variao.
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FIGURA 2 - MULTICROMATOGRAMA COMPARANDO PADRO CLORPIRIFS (5 g.mL-1), EXTRATO 70B (AMOSTRA TESTEMUNHA) E EXTRATOS 79 E 80 (AMOSTRAS DE CAMPO)

TABELA 2 - REPETITIVIDADE DAS INJEES DE CLORPIRIFS (g.mL-1) EM FUNO DA REA (A)

SOLU O g.m L
-1

A1

A2

A3

CV

LQ 2 LQ 10 LQ

0,03 0,06 0,30

2685 7878 34438

2533 7824 34516

2991 7801 34494

2736 7834 34483

233,26 39,53 40,22

8,53 0,50 0,12

CV = Coeficiente de variao.

TABELA 3 - REPETITIVIDADE DAS INJEES DE CLORPIRIFS (g.mL-1), EM FUNO DA CONCENTRAO (C)

SOLU O g.m L
-1

C1

C2

C3

CV

LQ 2 LQ 10 LQ

0,03 0,06 0,30

0,0351 0,0884 0,3606

0,0336 0,0878 0,3614

0,0391 0,0876 0,3611

0,0359 0,0879 0,3610

0,0030 0,0004 0,0004

7,92 0,47 0,11

CV = Coeficiente de variao.
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FIGURA 3 - MULTICROMATOGRAMA 3 INJEES (50 L) DE SOLUO-PADRO CLORPIRIFS (2LQ= 0,06 g.mL-1)

3.3 TESTE DE RECUPERAO O mtodo proposto para extrao de Clorpirifs em amostras de alface foi avaliado pelo teste de recuperao, realizado em amostras-testemunha (em triplicata) fortificadas com soluo-padro de Clorpirifs (5 g.mL-1). Aps evaporao do solvente (DCM), o resduo foi retomado com 5 mL de fase mvel (MeOH:H2O) (82:18) e o resultado apresentado na Tabela 4 e na Figura 4. TABELA 4 - RESULTADO DO TESTE DE RECUPERAO DE CLORPIRIFS, EM AMOSTRAS DE ALFACE FORTIFICADAS COM SOLUO PADRO DE CLORPIRIFS (5 g.mL-1)

Amostra N

Tempo de reten o de Clorpirif s (minutos)

concentra o adicionada ( g.mL )

-1

concentra o determinada ( g.mL )

-1

recupera o %

97 98 99

12,33 12,27 12,26

5,00 5,00 5,00

4,9830 5,1638 5,1395

99,66 103,28 102,79

x = 101,91; s = 1,96; CV = 1,92;

CV = Coeficiente de variao.

A recuperao mdia (101,91%) mostrou-se semelhante s encontradas por RACKE et.al. (1996), que analisaram Clorpirifs por CLAE em 37 diferentes solos e obtiveram 101,68% de recuperao. BOGUS et al. (1990) analisaram, por CLAE, 7 agrotxicos em gua e obtiveram recuperao de 93,7% para Clorpirifs. LAABS et. al. (1999), propuseram mtodo para anlise de multirresduos de agrotxicos por CG em solos tropicais. Constataram recuperao de 98% para Clorpirifs.
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FIGURA 4 - MULTICROMATOGRAMA DAS AMOSTRAS AVALIADAS EM TESTE DE RECUPERAO + PADRO CLORPIRIFS

4 CONCLUSO Considerando a performance analtica, o mtodo proposto apresenta-se como ferramenta alternativa para determinao de resduos de Clorpirifs em amostras de alface. A tcnica escolhida (CLAE) possibilitou a determinao de Clorpirifs de forma rpida, simples e com baixo custo.

ABSTRACT
METHOD FOR THE DETERMINATION OF CHLORPIRYFOS RESIDUES IN LETTUCE BY USING HPLC (High Performance Liquid Cromatograph) This paper suggests a method for the residual analysis of chlorpiryfos in lettuce samples by using HPLC (High Performance Liquid Cromatograph). The analysis has been carried out in a Shimadzu cromatograph, with ultraviolet detector adjusted to 229 nm, column C-18, model Zorbax ODS (4.6 mm x 25 cm, 5 m), flux 1mL/min, temperature of 350C. The mobile phase used was methanol:water (82:18) and the injected volume of 50 L. Lettuce samples have been triturated and homogenized in the presence of 50 mL of the solvent Dichlormethan (DCM). The vacuum filtered material was evaporated at the temperature of 500C. The residue has been retaken in a mobile phase, stirred, degasified, filtered in a 0.22 m membrane and automatically injected in the HPLC. Good results were obtained in a repetitivity test, with an average recovery of 101.91%. The proposed test presents simplicity and quickness in the residual determination of Chlorpiryfos in lettuce samples.

KEY-WORDS: ORGANOPHOSPHORUS INSECTICIDES; CHLORPYRIFOS; HPLC; LETTUCE.

REFERNCIAS
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