PLASMIDIOS 2012

PLASMIDIOS
Molculas de cidos nucleicos extracromosmicas que se replican autnomamente (Replicn) No codifican funciones esenciales para la funcin celular Circular o lineal Amplio rango de tamao

Plasmidios
Plasmidios contribuyen a la plasticidad gentica y la evolucin bacteriana Son dispensables Son tiles en la tecnologa del DNA recombinante. Los plasmidios usan factores del husped para las mayora de la funciones de replicacin

Plasmidio

Cromosoma

Transferencia de los plasmidios

Plasmidios auto transferibles o conjugativos
llevan los genes necesarios para su transferencia. Estos plasmidios son generalmente de gran tamao

Plasmidios movilizables
Son aquellos incapaces de autotransferirse, pero pueden ser transferidos a alta frecuencia desde clulas que llevan un plasmidio autotransferible.

Transferencia de los plasmidios

ori T

ori T

autotransferible movilizable
ori T ori T

REPLICACION PLASMIDIAL
1.- Funciones gnicas para la replicacin plasmidial - Origen de replicacin: OriV - Protenas Rep pueden estar codificadas en el plasmidio o en el cromosoma 2.- Regulacin del Nmero de copias - Bajo nmero de copias : 1-2 por clula - Alto nmero de copias: sobre 40 por clula Restringida vs relajada

REPLICACION DE LOS PLASMIDIOS

Dos tipos de replicacin: 1.- Replicacin del tipo ColE1:

Origen RNAI RNAII Rom

2. Plasmidios con iterones:

Origen

Replicn

Regin rica en AT

Iterones

gen rep

DnaA boxes

Sitio Operador

Replicacin del plasmidio ColE1

ColE1 codifica una toxina bacteriana, colicina El replicn ColE1 es la base de muchos vectores de clonacin Nmero de copia es ~15 plasmidios por clula La replicacin de ColE1 es unidireccional

Proteina de Immunidad

Colicina

ColE1 (6646 bp)

Replicn

Origen RNAII Rom/Rop

RNAI

Replicacin del plasmidio ColE1

1. Plasmidio ColE1: la sntesis de la hebra leader se inicia a partir de un largo de RNA (II) (preprimer) en el origen del replicacin. El Clivaje del hbrido RNAII-DNA expone un grupo 3OH en el RNAII a partir del cual se comienza la sntesis de la hebra leader La interaccin RNAI-RNAII (promovida por Rom) controla la frecuencia de iniciacin. La sntesis de la hebra lagging ocurre cuando se ensambla el primosoma.

Origen RNAII Rom

RNAI

Replicacin de ColE1 usa un partidor RNA para la sntesis de la hebra Leader RNAII Origen Primosome Assembly Site promotor (PAS) RNAII RNA Pol
Preprimer RNAII se transcribe desde el promotor P(RNAII) por RNA Polimerasa

"
RNasa H RNAII Leading strand
El terminal 3OH libre sobre el RNA II clivado, actua como sitio de iniciacin para la sntesis de la hebra leading por DNA Polimerasa I

RNasa H cliva el hbrido RNAII-DNA

RNAII

Replicacin de ColE1 usa un partidor RNA para la sntesis de la hebra Leader (cont.)
La separacin del duplex permite la iniciacin de la hebra lagging en el sitio PAS para la sntesis discontinua de los fragmentos de Okasaki

hebra Lagging hebra Leading

RNAII tiene una estructura plegada la cual estabiliza la Formacin de una hebra complementaria con el origen

5 3
555 nucleotidos Expresado constitutivamente del promotor para RNAII No es traducido Plegamiento en una estructura tridimensional la cual interactua con el DNA en el origen de replicacin El clivaje del hbrido RNAII-DNA en el origen por RNasa H proporciona el terminal 3OH para la sntesis de la hebra leading

ColE1 regula su nmero de copia con un corto RNA antisentido. RNAI

3 5
108 nucleotidos Expresado constitutivamente desde el promotor RNAI No traducido Totalmente complementario a RNAII (antisentido) Se pliega en una estructura tridimensional definida la cual interactua con el terminal 5 del RNAII. Interaccion del RNAI con RNAII resulta en una configuracin del RNAII la cual es inactiva para la formacin del duplex DNA-RNA en el origin RNAI tiene una vida media ms corta que el RNAII

RNA I
5 3
PRNA II

PRNA I

origin

Prop

Regulacin de la replicacin de plasmidios derivados de ColE1. RNA II debe ser procesado por la RNasa H para iniciar la replicacin El RNA I se une al RNA II e inhibe el procesamiento regulando el nmero de copias

RNA II Infrequently RNA II Frequently RNA I 5

5 3 RNA II

5 3

RNase H RNA II 5 5 3

RNA I-RNA II duplex

Pol I RNA II primers DNA synthesis

RNA II inactivated for prime function

Replication No replication

REPLICACION DE LOS PLASMIDIOS

Dos tipos de replicacin: 1. Plasmidios con iterones: en el cual una protena codificada por el plasmidio se une a una secuencia repetida cerca del ori y en combinacin con la protena DnaA, codificada por el hospedero, producen desnaturacin de la regin rica en AT que se encuentra en el origen de replicacin.

Replicn

AT-rica

Iterones Sitio Operador

gen rep

DnaA boxes

Organizacin gnica de un replicn Plasmidial con iterones

Origen Replicn

regin rica AT

Iterones DnaA boxes sitio del operador

gen rep

Protena de replicacin (Rep), codificada por el plasmidio, se une a los iterones DnaA boxes : sitios de unin de la protena DnaA del hospedero Regin rica en AT donde ocurre la separacin de hebras Adems de la protena Rep codificada por el plasmidio se require proteinas de replication del hospedero (Ej. DnaA, DNA Pol III, primase [DnaG], helicasa [DnaB], single-stranded binding protein [SSB], etc.)

Protena de replicacin que se une a los iterones es codificada por el Plasmidio

Protena de Replication (Rep) 30-40 kD Diferentes plasmidios codifican diferentes protenas Rep Rep reconoce secuencias especficas (iterons) cerca del ori ( A) y autorregula la expresin del gen rep (B)

Rep

Iterons
Secuencias repetidas directas: 3-7 copies Cada iteron tiene generalmente 17-22 bp en longitud; iterones ms cortos se separan por espaciadores para dar una longitud de 22-bp: 22-bp

La protena Rep se une a los iterones:

Iterons

Rep

Protena DnaA
Protena DnaA (codificada por el husped) se une a los boxes DnaA
Host-encoded DnaA

Rep

RepA-DnaA-DNA forma un complejo nucleoproteco que promueve la separacin de hebras en la regin rica en AT-rich en el origen La separacin permite el acceso de de las protenas de replicacin codificadas por el husped (DnaA, DNA PolIII, primasa [DnaG], helicasa [DnaB], single-stranded binding protein [SSB])

Iniciacin de la Replicacin de plasmidios con iterones

AT-rich DnaA boxes Iterons

Unin de Rep y DnaA

Separacin de las hebras en la regin rica en AT

Unin de helicasa y SSB

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Iniciacin de la Replicacin de plasmidios con iterones

Sntesis de la hebra Leading a partir de partidor (sinteizado por la primasa) y elongacin continua por DNA Pol III

Protena Rep DnaA Helicasa Single-stranded binding protein (SSB)

Regulacin de la replicacin de plasmidios con iterones Modelo handcuffing o coupling para la regulacin de plasmidios con iterones. A baja concentracin del plasmidio, la protena Rep solamente se une a un plasmidio iniciando la replicacin A alta concentracin del plasmidio, la protena Rep une a dos plasmidios, impidiendo la replicacin
Baja concentracin de plasmidios Alta concentracin de plasmidios

Replicacin

No replicacin

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PARTICIN

La distribucin al azar es suficiente para estabilizar plasmidios multicopia

Plasmidio Cromosoma

Crecimiento celular y Cell Growth and replicacin de plasmidio Plasmid Replication

Division celular and Cell Division y distribucin desigual Uneven Plasmid del Distribution plasmidio

Ajustey Num erdejustment Cop del N A copias b d

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La distribucin al azar es insuficiente para estabilizar un plasmidio de bajo nmero de copia

Plasmidio Cromosoma
Crecimiento celular y replicacin de plasmidio

Divisin celular y distribucin desigual del plasmidio

Clula sin plasmidio

Mecanismos que promueven la distribucin estable de plasmidios de bajo nmero de copias

Particin
par funcin que evita que la clula pierda el plasmidio
Plasmidios con bajo nmero de copia necesita un eficiente sistema de particin. Plasmidios con alto nmero de copias generalmente no requieren funcin par par puede estar estrechamente ligado al ori.

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Curacin de un plasmidio sin un sitio par. Cada plasmidio tiene igual probablidad para segregar en las clulas hijas en la divisin celular. Ocasionalmente una de ellas perder el plasmidio con la siguiente probabilidad: P = (1/2)2n x 2

Incompatibilidad
Incapacidad de dos plasmidios para coexistir sin seleccin en una linea clonal de clulas. Plasmidios idnticos o estrechamente relacionados no son distinguidos por el mecanismos de mantencin del nmero de copias.

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Incompatibilidad (Inc)
Los plasmidios del mismo grupo Inc pueden ser incompatibles porque: Comparten el mismo mecanismo de control de la replicacin Comparten las mismas funciones de particin (par)

Distribucin desigual de dos plasmidios

Cada plasmidios regula su nmero de copia

Coexistencia de dos plasmidios de diferentes grupos de Inc

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A B

Distribucin desigual de dos plasmidios

Cada plasmidios regula la replicacin del otro

Distribucin desigual de A y B

Distribucin desigual de A y B

Clula sin plasmidio B

Plasmidios del mismo grupo de Inc resultarn en que la mayora de las clulas portarn slo un tipo de plasmidio

Clula sin plasmidio A

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