Estructura y funcin de las protenas

Protenas, clasificacin. Estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. Mtodos para la determinacin de protenas

CONCEPTO DE PROTENA Las protenas son biomolculas formadas bsicamente por carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno. Pueden adems contener azufre y en algunos tipos de protenas, fsforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos. Pueden considerarse polmeros de aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos. La unin de un bajo nmero de aminocidos da lugar a un pptido; si el nmero de aa. que forma la molcula no es mayor de 10, se denomina oligopptido, si es superior a 10 se llama polipptido y si el n: es superior a 50 aa. se habla ya de protena.

Las protenas son molculas complejas. Con la posibilidad de que 20 aminocidos diferentes puedan ser ordenados en cualquier orden para conformar polipptidos de cientos de aminocidos, tienen el extraordinario potencial de producir una gran cantidad de variantes en su conformacin. Esta variedad permite a las protenas funciones tan refinadas como las de las enzimas que permiten el metabolismo celular. La bacteria Escherichia coli, uno de los organismos biolgicos ms simples, tiene ms de 1000 protenas diferentes trabajando a diferentes tiempos para catalizar las reacciones que sostienen a su vida.

CLASIFICACIN DE PROTENAS HETEROPROTENAS Glucoprotenas Ribonucleasa Mucoprotenas Anticuerpos Hormona luteinizante Lipoprotenas De alta, baja y muy baja densidad, que transportan lpidos en la sangre. Nucleoprotenas Nucleosomas de la cromatina Ribosomas Cromoprotenas Hemoglobina, hemocianina, mioglobina, que transportan oxgeno Citocromos, que transportan electrones

Globulares

CLASIFICACIN DE PROTENAS HOLOPROTENAS

Prolaminas:Zena (maza),gliadina (trigo), hordena (cebada) Gluteninas:Glutenina (trigo), orizanina (arroz). Albminas:Seroalbmina (sangre), ovoalbmina (huevo), lactoalbmina (leche) Hormonas: Insulina, hormona del crecimiento, prolactina, tirotropina Enzimas: Hidrolasas, Oxidasas, Ligasas, Liasas, Transferasas... etc. Colgenos: en tejidos conjuntivos, cartilaginosos Queratinas: En formaciones epidrmicas: pelos, uas, plumas, cuernos. Elastinas: En tendones y vasos sanguneos Fibronas: En hilos de seda, (araas, insectos)

Fibrosas

Todos los aminocidos se caracterizan por poseer un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2).

carbono alfa cadena lateral

Las otras dos valencias del carbono se saturan con un tomo de H y con un grupo variable denominado radical R. Segn ste se distinguen 20 tipos de aminocidos.

Funciones biolgicas de las protenas

FUNCIN DE TRANSPORTE En los seres vivos son esenciales los fenmenos de transporte, bien para llevar una molcula hidrofbica a travs de un medio acuoso (transporte de oxgeno o lpidos a travs de la sangre) o bien para transportar molculas polares a travs de barreras hidrofbicas (transporte a travs de la membrana plasmtica). Los transportadores biolgicos son siempre protenas.

FUNCIN ESTRUCTURAL

Las clulas poseen un citoesqueleto de naturaleza proteica que constituye un armazn alrededor del cual se organizan todos sus componentes, y que dirige fenmenos tan importantes como el transporte intracelular o la divisin celular.

En los tejidos de sostn (conjuntivo, seo, cartilaginoso) de los vertebrados, las fibras de colgeno forman parte importante de la matriz extracelular (de color claro en la Figura) y son las encargadas de conferir resistencia mecnica tanto a la traccin como a la compresin.

ENZIMTICA

La gran mayora de las reacciones metablicas tienen lugar gracias a la presencia de un catalizador de naturaleza proteica especfico para cada reaccin. Estos biocatalizadores reciben el nombre de enzimas. La gran mayora de las enzimas son protenas.

FUNCIN HORMONAL
Algunas hormonas son de naturaleza proteica, como la insulina y el glucagn (que regulan los niveles de glucosa en sangre) o las hormonas segregadas por la hipfisis como la hormona del crecimiento, o la calcitonina (que regula el metabolismo del calcio).

RECONOCIMIENTO DE SEALES QUMICAS

La superficie celular alberga un gran nmero de protenas encargadas del reconocimiento de seales qumicas de muy diverso tipo

FUNCIN DE DEFENSA

La propiedad fundamental de los mecanismos de defensa es la de discriminar lo propio de lo extrao. En bacterias, una serie de protenas llamadas endonucleasas de restriccin se encargan de identificar y destruir aquellas molculas de ADN que no identifica como propias. En los vertebrados superiores, las inmunoglobulinas se encargan de reconocer molculas u organismos extraos y se unen a ellos para facilitar su destruccin por las clulas del sistema inmunitario

FUNCIN DE MOVIMIENTO
Todas las funciones de motilidad de los seres vivos estn relacionadas con las protenas. As, la contraccin del msculo resulta de la interaccin entre dos protenas, la actina y la miosina.

FUNCIN DE RESERVA La ovoalbmina de la clara de huevo, la lactoalbmina de la leche, la gliadina del grano de trigo y la hordena de la cebada, constituyen una reserva de aminocidos para el futuro desarrollo del embrin

FUNCIN REGULADORA Muchas protenas se unen al ADN y de esta forma controlan la trascripcin gnica. De esta forma el organismo se asegura de que la clula, en todo momento, tenga todas las protenas necesarias para desempear normalmente sus funciones. Las distintas fases del ciclo celular son el resultado de un complejo mecanismo de regulacin desempeado por protenas como la ciclina

Aliphatic side chains (a diverse group - more nonpolar ones, such as VAL, LEU, ILE prefer interior of protein molecule

Acidic Amino Acids and Their Amides (ASP and GLU strongly acid, ASN and GLN polar but not charged , and Basic Amino Acids (Strongly polar)usually prefer exterior of protein)

Aromatic Amino Acids (Strong absorption of light in near UV)

Propiedades de los aminocidos proteicos

Propiedades de los aminocidos proteicos

Punto isoelctrico (pI): pH al cual un aa o una protena tiene carga neta 0

Sabiendo que la glicina posee un pka para su grupo a-COOH de 2.3 y para el a-NH3+ igual a 9.3, la forma predominante de este aminocido en una solucin muy bsica (pH = 12) ser: a) b) c) d) NH2CH2COOH NH2CH2COO NH2CH3+COO NH3+ CH2COOH

All amino acids involved in making proteins, except glycine, have an asymmetric carbon. The two enantiomers are designated Dand LL-Amino acids are the building blocks of proteins.

EL ENLACE PEPTDICO Los pptidos estn formados por la unin de aminocidos mediante un enlace peptdico. Es un enlace covalente que se establece entre el grupo carboxilo de un aa. y el grupo amino del siguiente, dando lugar al desprendimiento de una molcula de agua.

El enlace peptdico tiene un comportamiento similar al de un enlace doble, es decir, presenta una cierta rigidez que inmoviliza en un plano los tomos que lo forman.

La unidad peptdica es rgida y plana.

Contrariamente existe un enorme grado de libertad rotacional en ambos lados de la unidad peptdica rgida

Una cadena polpeptdica extendida u ordenada al azar carece de actividad biolgica.

Estructura Primaria de las protenas

Una cadena polipeptdica natural por lo general contiene entre 50 a 2000 residuos aminocidos. El peso molecular promedio de un residuo aa. es de 110 daltons Dalton (Da) Unidad de masa muy prxima a la de un tomo de hidrgeno. As llamada en honor a Jonh Dalton (19761844) quien desarroll la teora atmica de la materia. kilodalton (kDa) Unidad de masa igual a 1000 daltons 1 Da= 1g/mol

Ejercicio

Considerando que el peso molecular de una protena en solucin 0.068 M es 36 845 Da, calcule la concentracin de la misma expresada en mg de protena/ml.

36 845 Da= 36 845 g

X g X g =

mol
0.068 mol en 1 litro 0.068 mol x 36 845 g 1 mol

X g = 2505.46 g en 1 litro Concentracin de protena = 2.5 x 10 3 mg/ml

The amino acid sequences of sperm whale myoglobin and human myoglobin.

Estructura Secundaria de las protenas

Las cadenas polipeptdicas pueden plegarse en estructuras regulares:

La a Hlice La Lmina b Plegada La Hlice del Colgeno

1.5 A

La a Hlice es una estructura semejante a un cilindro. Todos los CO y NH en una misma hebra quedan enlazados por puentes de hidrgenos en una relacin n+4
Paso de rosca = 5.4 A Producto de la traslacin = 1.5A Nmero de residuos aa. por vuelta = 3.6

Angstrom ( A) Unidad de longitud equivalente a 10

-10

1A = 10 -10 m = 10 -8 cm = 10 -4 microm = 10-1 nm

Nombre propuesto en honor al espectroscopista: Ander J. Angstron (1814-1874)

Representacin de una seccin transversal del alfa helicoide. Las cadenas laterales R quedan fuera de la hlice

El sentido de la hlice puede ser :

Dextrgiro (sentido de las manecillas del reloj) o Levgiro (sentido opuesto) Las hlices alfa que se encuentran en las protenas son dextrgiras Dextrgiro Levgiro

Las a hlices de un solo filamento, son por lo general cilindros cortos de longitud aproximada entre los 40 A.
Algunas a hlices se super enrollan una alrededor de otra, formando una especie de cable cuya longitud puede alcanzar hasta los 1000 A. Aparece en algunas protenas como:

la queratina del cabello la miosina y la tropomiosina del msculo la epidermina de la piel la fibrina de los cogulos de sangre

Superenrollamientos de a hlices en la queratina del cabello

Other possible secondary structures of polypeptides.

Hydrogen bonding patterns for four helices.

La Hoja b plegada es una lmina casi completamente extendida.

A diferencia de la a hlice,la hoja b plegada se estabiliza por enlaces de hidrgeno entre grupos CO y NH de filamentos polipeptdicos diferentes. Las cadenas laterales quedan por encima y por debajo del plano de la hoja. La distancia axial entre los aminocidos adyacentes es de 3.5 A en contraste con la de 1.5 A de la hlice a.

Las cadenas adyacentes en una hoja b plegada pueden orientarse en la misma direccin ( hoja b paralela) o en direcciones opuestas (hoja b antiparalela)

La fibrona de la seda consta casi por entero de haces de hojas b antiparalelas.

Calclese la longitud ( en nm) de una cadena polipeptdica que contiene 105 residuos aas a) si se encuentra totalmente en forma de hlice b) si se encuentra totalmente como lmina beta c) Cuntos kD pesa dicha cadena?

Estructura supersencundaria Hace referencia a los agrupamientos de estructuras secundarias

Estructura terciaria de las protenas

Se refiere al reordenamiento espacial de los residuos de aminocidos alejados en la secuencia lineal. Puede contener mltiples estructuras organizadas en a hlice u hoja b plegada, estailizadas por puentes de hidrgeno, enlaces electrostticos y enlaces de van der Waals.

 Cmo se pliegan las protenas?

La secuencia de aminocidos especifica la estructura tridimensional. Por ejemplo dos residuos de cistena pueden formar puentes disulfuro y generar una cistina H H O - N- C- CH H O CH2 - N- C- CSH CH
2

SH CH2 -N- C - CH H O

S S CH2 -N- C - CH H O Cistina

2 Cistenas

De los 20 aminocidos fundamentales, 11 pueden formar puentes de hidrgeno. Las cadenas laterales de triptfano y arginina pueden servir slamente de dadoras de hidrgeno

Las cadenas laterales de asparragina, glutamina, serina y treonina pueden servir de dadoras y aceptoras de hidrgeno al igual que el grupo peptdico
Las cadenas laterales de Lisina ( y el amino terminal), del asprtico y glutmico ( y el grupo COOH terminal) , la tirosina y la histidina varian con el pH

Modelos de la Mioglobina, protena transportadora de O2 en el msculo. Contiene una nica cadena polipeptdica de 153 aminocidos conformando 8 a hlices. Es una molcula muy compacta. La capacidad de esta protena de enlazar O2 depende de la presencia de un grupo Hemo (color rojo).

Modelo de la Ribonucleasa S, enzima pancretica que hidroliza el RNA. Contiene 124 aminocidos que se doblan en forma de b plegada principalmente, y en 3 a hlices. La estructura queda estabilizada por 4 puentes disulfuro ( amarillo)

Estructura cuaternaria de las protenas

Se refiere al ordenamiento espacial de las subunidades y a la naturaleza de sus contactos mutuos en las protenas polimricas. Las cadenas integrantes de estas protenas pueden ser idnticas o diferentes.

Introduccin a los mtodos de estudio de protenas

CUANTIFICACIN DE PROTENAS: ESPECTROFOTOMETRA UV-VISIBLE Se basa en la ley de LAMBERT-BEER, que relaciona la concentracin de una sustancia con la cantidad de luz que es capaz de absorber dicha sustancia

Se detecta la relacin entre la luz incidente y la luz emergente

C concentracin molar de protena l ancho de la cubeta

log (P0/P) = Abs =

eCl
e

Coeficiente de Extincin Molar (M-1 cm-1) Determinado empricamente

Cte. para un determinado compuesto a una determinada longitud de onda y medido en las mismas condiciones

CUANTIFICACIN DE PROTENAS: ESPECTROFOTOMETRA UV-VISIBLE DETECCIN DIRECTA La mayora de los compuestos absorben radiacin electromagntica a determinada(s) longitud(es) de onda en la regin UV-Visible del espectro LAS PROTENAS TIENEN UN MXIMO DE ABSORBANCIA A:

aprox. 280 nm debido a la presencia de aminocidos aromticos (fundamentalmente Triptfano y Tirosina)

Abs (280 nm)=

exCxl

El coeficiente de extincin molar de una protena depende de su

composicin aminoacdica y constituye la suma de los coeficientes de extincin molar individuales

CUANTIFICACIN DE PROTENAS: ESPECTROFOTOMETRA UV-VISIBLE DETECCIN DIRECTA A 280 nm Lmites de deteccin: 20 g - 3 mg Rpida VENTAJAS

La muestra se puede recuperar til para la estimacin de protena previa al uso de otro mtodo ms exacto Muy conveniente para la deteccin de protena en fracciones Cromatogrficas

Muy susceptible a contaminacin con tampones, material biolgico o sales

INCONVENIENTES

La composicin aminoacdica de la protena es muy importante, por lo que la eleccin de un estndar es muy difcil, en especial para protenas purificadas La absorbancia est muy influenciada por el pH o la fuerza inica de la solucin

CUANTIFICACIN DE PROTENAS: ESPECTROFOTOMETRA UV-VISIBLE LAS PROTENAS TAMBIN ABSORBEN LA LUZ A:

210-225 nm debido al enlace amida (peptdico) de las mismas

La medicin directa de las protenas en esta regin est ms sujeta a interferencia por otros componentes celulares y por constituyentes de los tampones utilizados

CUANTIFICACIN DE PROTENAS: MTODOS COLORIMTRICOS

FUNDAMENTO: REACTIVO (CROMGENO)

PROTENAS
CROMGENO

AL UNIRSE A LAS PROTENAS EL REACTIVO CAMBIA DE COLOR

ESTE CAMBIO ES PROPORCIONAL A LA CANTIDAD DE PROTENA

CUANTIFICACIN DE PROTENAS: MTODOS COLORIMTRICOS

MTODO BIURET REACTIVO Cu2+ l (nm) 540 TIEMPO* 19 min SENSIBILIDAD* > 100 mg

BCA

Cu2+ c. bicinconnico

562

*Diversas casas comerciales poseen mtodos mejorados que disminuyen el tiempo de realizacin del ensayo y mg 32 min 20 2000 4 20 mg aumentan la sensibilidad

LOWRY

Cu2+ fosfomolibdotngstico

750

122 min

2 200 mg

BRADFORD

Azul Coomassie G

595

7 min

20 200 mg 1 2 mg

INFORMACIN MS DETALLADA DE LOS FUNDAMENTOS DE CADA MTODO EN: http://bioquimica.fcien.edu.uy/seccion/distribucion/practicos/1.html

CUANTIFICACIN DE PROTENAS: MTODOS COLORIMTRICOS

LA ELECCIN DE UN DETERMINADO MTODO DEPENDER DE: LA CANTIDAD TOTAL DE PROTENA DISPONIBLE

LA CONCENTRACIN DE LA SOLUCIN
LA NECESIDAD DE CONSERVAR LA MUESTRA INTACTA DESPUS DEL ENSAYO LA PRESENCIA EN LA MUESTRA DE COMPUESTOS QUE INTERFIERAN EN EL ENSAYO LA RAPIDEZ CON LA QUE SE NECESITE EL RESULTADO

Calcule la concentracin molar de una protena rica en Aminocidos aromticos si conoces que su coeficiente de extincin molar es 32 457 M-1 cm-1 y la absorbancia a 280 nm, determinada por espectrofometra en una cubeta de cuarzo de 1 cm, es de 1.433.

Abs (280) = C = Abs (280) /

C = 4.4 x 10
-5

eCl

e l = 1.433 / 32 457 M-1 cm-1 cm

M

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

La acrilamida polimeriza por la accin del TEMED y el persulfato amnico (PSA)
La metilen-bis-acrilamida forma enlaces cruzados entre los polmeros de acrilamida En conjunto se forma una especie de malla cuyo dimetro de poro viene determinado por la concentracin de acrilamida/bis-acrilamida

Metilen-bis-acrilamida

Acrilamida

Neurotxica

Polimerizacin (TEMED, PSA)

Poliacrilamida

(NO neurotxica)

Enlace bis-acrilamida

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

Gel Stacking (Empaquetador)
Gel Stacking Menor concentracin de acrilamida Tamao de poro mayor pH cido-neutro

Gel Separating

Funcin:

acumular las protenas a la entrada del gel separador para que salgan al mismo tiempo (Salida Neutralizada)

Gel Separating (Separador)

Mayor concentracin de acrilamida Tamao de poro menor pH alcalino

Funcin:

separar las protenas

La mezcla de protenas se coloca en un bloque delgado de gel dispuesto verticalmente utilizando una micropipeta, y se aplica una corriente de 100 voltios

La direccin de la electroforesis es vertical descendiente y las protenas se visualizan sobre el gel tindolas con plata o con azul de Coomasie, revelando una serie de bandas.

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA: NO DESNATURALIZANTE LAS PROTENAS SE SEPARAN POR:

CARGA ELCTRICA TAMAO
Puesto que utilizamos unas condiciones de pH alcalinas, la mayora de las protenas van a estar CARGADAS NEGATIVAMENTE

Carga de los aminocidos y protenas con los cambios de pH

Capta

H+

pI

Libera

H+

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA: NO DESNATURALIZANTE

CTODO

QUIN LLEGAR ANTES A LA META?

PREPARADOS..., LISTOS...,

YA!

+
NODO

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA: NO DESNATURALIZANTE

CTODO

A IGUAL TAMAO MIGRA MS LA MS CARGADA

A IGUAL CARGA MIGRA MS LA DE MENOR TAMAO

+
NODO

SEPARACIN DE PROTENAS EN GEL DE POLIACRILAMIDA NO DESNATURALIZANTE

A2
S
S

PROTENA A: DIMRICA DMEROS (A1, A2) UNIDOS POR PUENTES DISULFURO (SS) A1 60 kDa A2 20 kDa

A1

PROTENA B: MONOMRICA 40 kDa

SEPARACIN DE PROTENAS EN GEL DE POLIACRILAMIDA NO DESNATURALIZANTE

CTODO

LAS PROTENAS MULTIMRICAS MIGRAN FORMANDO UNA UNIDAD

B
80 kDa

+
NODO

40 kDa

SEPARACIN DE PROTENAS EN GEL DE POLIACRILAMIDA NO DESNATURALIZANTE VENTAJAS

SEPARA PROTENAS EN ESTADO NATIVO
LAS PROTENAS SIGUEN SIENDO FUNCIONALES

PERMITE SEPARAR COMPLEJOS PROTEICOS O PROTENAS MULTIMRICAS COMO UNA UNIDAD

INCONVENIENTES

MUCHAS PROTENAS NO MIGRAN POR NO TENER CARGA NETA O

POSEER CARGA NETA POSITIVA

EL PROCESO DE SEPARACIN ES MUY LENTO DEBIDO A LA DEBILIDAD DE LA CARGA NETA DE LAS PROTENAS EL PROCESO DE SEPARACIN NO SLO EST AFECTADO POR EL TAMAO SINO TAMBIN POR LA FORMA DE LA PROTENA

Tropomiosina (63kD) Hemoglobina (65 kD)

Igual carga negativa

Migracin en gel no desnaturalizante

Ms lento

Ms rpido

?
Forma de varilla Forma esfrica

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

SE LLEVA A CABO EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES: 1. SE EMPLEA UN AGENTE REDUCTOR DE PUENTES SS

SDS-PAGE

generalmente b-mercaptoetanol o DTT (DiTioTreitol)

2. SE EMPLEA EL DETERGENTE ANINICO SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)

3. GENERALMENTE TAMBIN SE CALIENTA LA MUESTRA

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

El b-mercaptoetanol va a romper los enlaces SS tanto intercomo intramoleculares mediante una reaccin redox (El b-mercaptoetanol reduce los puentes disulfuro)

SDS-PAGE

A2
b-mercaptoetanol

S S

HS

+ A1
A1

SH

A2

El DTT funciona del mismo modo que el b-mercaptoetanol

La mezcla de protenas se disuelve en un medio con detergente (SDS). Los aniones de SDS se unen a la cadena principal a razn de un SDS por cada 2 aas, lo que da al complejo protena- SDS una carga negativa proporcional a la masa de la protena

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

El SDS se va unir a las protenas dotndolas de una alta carga elctrica negativa, la cual por repulsin va a provocar el desplegamiento de las mismas
HS SDS
H 3C O O S
10

SDS-PAGE

OO

Na+

+ A1
HS

SH

A2 A1

SH

A2

La cantidad de SDS unido a la protena es proporcional a su tamao, de tal forma que la relacin carga/tamao entre todas las protenas va a ser aprox. la misma

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

LAS PROTENAS SE SEPARAN POR:
TAMAO
LAS PROTENAS MULTIMRICAS MIGRAN SEPARNDOSE EN SUS RESPECTIVOS MONMEROS

SDS-PAGE

CTODO

B
A1 40 kDa 20 kDa 60 kDa

NODO

A2

CTODO 80 kDa

NO DESNATURALIZANTE

SDS-PAGE (DESNATURALIZANTE)

vs.

A = A1+A2
40 kDa B

A1

60 kDa

40 kDa A2

B 20 kDa

NODO

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

VENTAJAS
SEPARACIN RPIDA DE LAS PROTENAS
LA SEPARACIN NO DEPENDE DE LA FORMA DE LA PROTENA NATIVA SE PUEDE ESTIMAR EL PESO MOLECULAR DE LAS PROTENAS AUNQUE DESNATURALIZADAS, LAS PROTENAS PUEDEN USARSE PARA LA FABRICACIN DE ANTICUERPOS (en la mayora de los casos)

SDS-PAGE

INCONVENIENTES LAS PROTENAS SEPARADAS ESTN DESNATURALIZADAS

NO SON FUNCIONALES

El desplazamiento de las protenas bajo estas condiciones es proporcional al logaritmo de su masa molecular

Tres protenas X,Y y Z que tienen puntos isoelctricos idnticos y menores a 8.0 se separan en una electroforesis en gel de poliacrilamida y en condiciones no desnaturalizantes. Sus pesos moleculares son 50 000, 95 000 y 70 000 daltones respectivamente. El orden en que las protenas migrarn en el gel ser: 1. X migra ms que Y y Y migra ms que Z. 2. Y migra ms que ambas, le sigue Z y luego X. 3. X migra ms que ambas, le sigue Z y luego Y. 4. todas migran igual porque su carga es idntica. 5. no es posible predecir el orden con el que migran, se requiere determinarlo experimentalmente.

ISOELECTROENFOQUE LAS PROTENAS SE SEPARAN POR:

PUNTO ISOELCTRICO

Carga de los aminocidos y protenas con los cambios de pH

Capta

H+

pI

Libera

H+

ISOELECTROENFOQUE

EL GEL DE POLIACRILAMIDA CONTIENE UNAS MOLCULAS DENOMINADAS ANFOLITOS QUE CREAN UN GRADIENTE DE pH

ISOELECTROENFOQUE

ISOELECTROENFOQUE

LAS PROTENAS SE MOVERN DE

ACUERDO CON SU CARGA NETA, HACIA EL NODO O EL CTODO

HASTA QUE ALCANCEN UN VALOR

DE pH = pI DONDE SU CARGA NETA ES NEUTRA (y ya no se mueven)

CTODO

A VECES EN UNA SDS-PAGE PARECE QUE TENEMOS UNA NICA PROTENA

PERO EN REALIDAD SON DOS CON IDNTICO PESO MOLECULAR

NODO

VAYA DILEMA!

2D-ELECTROFORESIS
REALIZAMOS UNA DOBLE ELECTROFORESIS
1. REALIZAMOS UN ISOELECTROENFOQUE

CTODO

9 8

CTODO

7
6 MUY MALA SUERTE TENEMOS 5 QUE TENER PARA ENCONTRARNOS DOS PROTENAS DISTINTAS 4 CON IGUAL pI E IGUAL PESO MOLECULAR pH 2. REALIZAMOS UNA SDS-PAGE

NODO

NODO

2D-ELECTROFORESIS
UNA DE LAS HERRAMIENTAS FUNDAMENTALES EN

PROTEMICA

VISUALIZACIN DE LAS PROTENAS SEPARADAS EN LA ELECTROFORESIS

Tincin con COOMASSIE BLUE Tincin de PLATA

Tincin con otros metales (COBRE, ZINC)

Tincin con FLUOROCROMOS WESTERN-BLOTTING e INMUNOTINCIN

Coomassie Blue

Tincin de Zinc

Tincin de Cobre

Tincin de Plata

Tincin con Fluorocromo

(SYPRO Orange)

ESTAS TINCIONES TIENEN LUGAR SOBRE EL PROPIO GEL

COMPARACIN DE TRES MTODOS DE TINCIN

Cromatografa
Permite separar a las protenas de otras molculas

Cromatografa de filtracin por gel (segn su tamao)

Cromatografa de intercambio inico (segn su carga elctrica) Cromatografa de afinidad ( afinidades de enlace)

Cromatografa de filtracin por gel (segn su tamao)

La muestra se aplica a lo alto de una columna rellena de bolitas porosas hechas de un polmero insoluble pero muy hidratado (dextrano, agarosa, poliacrilamida) Las molculas menores pueden entrar a estas esferas, las molculas ms grandes fluyen con ms rapidez y salen antes.

Una mezcla de protenas se hace pasar por una columna de filtracin en gel cuyos lmites de exclusin son 5 000 y 250 000. Se encuentra que la actividad de la protena de inters aparece antes que la de la piruvato cinasa. La piruvato cinasa es una enzima que pesa 45 000 daltones, entonces:

1. nuestra protena pesa ms de 45 000 daltones y menos de 250 000.

2. la protena que nos interesa pesa menos de 45 000 daltones y ms de 5 000. 3. la resina no sirve porque las protenas no se pegan a ella. 4. la protena pesa menos de 45 000 y ms de 250 000 D.

Cromatografa de intercambio inico (segn su carga elctrica)

Para separar las protenas aninicas ( con carga - ) se utilizan columnas con relleno cargado positivamente (DEAE- celulosa). Para separar las protenas catinicas ( con carga + ) se utilizan columnas con relleno cargado negativamente (CM-celulosa) La elucin se realiza variando la concentracin de NaCL u otra sal eluyente

Cromatografa de afinidad
G G Protena que se une a la glucosa Adicin de glucosa G

Columna

Utiliza la afinidad de muchas protenas para grupos qumicos especficos. ejemplo: Concanavalina A por glucosa

G
Columna

G G G
Protena liberada