VALORACIN DE LA CALIDAD HIGINICA DE LA LECHE CRUDA EN LA ASOCIACIN DE PRODUCTORES DE LECHE DE SOTAR ASPROLESO, MEDIANTE LAS PRUEBAS INDIRECTAS DE RESAzURINA

A Y AzUL DE METILENO RAW MILK HYGIENIC QUALITY ASSESSMENT IN THE MILK PRODUCERS ASOCIATION OF SOTAR ASPROLESO, THROUGH INDIRECT TESTS OF REzASURIN AND METHYLENE BLUE
jhon jairo zambrano1, Jos FeRnando gRass RaMReZ2

PALABRAS CLAVE:
leche cruda, calidad higinica, resazurina, azul de metileno.

RESUMEN
Esta investigacin permiti encontrar la relacin entre las dos pruebas colorimtricas empleadas como mtodos indirectos en la determinacin de la calidad higinica de la leche cruda, como son la prueba de Resazurina en una hora y el Tiempo de Reduccin del Azul de Metileno. Para ello se analizaron 315 muestras por duplicado, conducentes a la realizacin de ambas pruebas de manera paralela, encontrndose diferencias significativas para los siguientes estadsticos: rangos con signo de Wilcoxon y t-student con P<0,001. Las muestras obtenidas resultaron del seguimiento durante 6 meses del proceso de acopio de leche cruda en la Asociacin de Productores de Leche de Sotar ASPROLESO, ubicada en Paispamba, cabecera municipal de Sotar Departamento del Cauca. Paralelamente a este estudio, se determin el efecto del transporte de la leche cruda en la calidad higinica, mediante un comparativo entre la calidad de la leche entregada en las fincas al carro recolector y la calidad en el momento del recibo en el centro de acopio (planta de enfriamiento) en el municipio de Paispamba. Para esta valoracin se analizaron 280 muestras procedentes de las 4 zonas de produccin y recoleccin de leche cruda (Chapa, Piedra Len, Ullucos y Paispamba). Los datos obtenidos fueron analizados por medias marginales para las cuatro rutas. La investigacin permiti identificar que entre las dos pruebas (Resazurina y Azul de Metileno), result de mayor grado de exactitud para la determinacin de la calidad higinica, la prueba de Tiempo de Reduccin de Azul de Metileno, en buena medida por demandar mayor exigencia en los reportes.

KEY WORDS:
Raw milk, hygienic quality, resazurin, methylene blue.

____________
Recibido para evaluacin: abril 7 de 2008. aprobado para publicacin: Julio 10 de 2008 1 2 estudiante de pregrado de ingeniera agroindustrial. universidad del cauca docente Facultad de ciencias agropecuarias. universidad del cauca

correspondencia: Jos Fernando grass Ramrez : email: jfgrass@unicauca.edu.co

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ABSTRACT
This investigation allowed to find the relation between the two colorimetric tests used as indirect methods in the determination of the hygienic quality of raw milk, as it is, One hour Resazurin test and Methylene blue reduction time. To do that 315 samples in duplicate were analized, leading to the perform of both tests in a parallel way, allowing to find significant diferences for the next statistics: ranges with Wilcoxon signs and t-student with P<0.001. The obtained samples resulted from the pursuit along 6 months of the raw milk storage process in the milk producers Asociation of Sotara (ASPROLESO), located in Paispamba, Sotaras town Department of Cauca. Parallely to this research, raw milk transportation effect in the hygienic quality was determinate, through a comparative between the quality of the delivered milk to gathering vehicles in farms and the quality in the moment of the reception in the storage center (Cooling plant) in the municipality of Paispamba. For this assessment 280 samples coming from the 4 production and recolection zones of raw milk (Chapa, Piedra Len,Ullocos and Paispamba) were analized. The Data obtained were analized by Marginal averages for the fourth routes. The researching allowed to identify that between both tests Resazurin and Methylene blue, Methylene blue reduction time resulted in a wider accuracy degree for the hygienic quality determination particularly because it demands a mayor requirement in the reports

INTRODUCCIN
la calidad de la leche cruda se establece con base a parmetros higinicos, sanitarios y composicionales. la calidad higinica resulta de especial importancia, por tratarse del contenido microbiano que est presente en la leche cruda, el cual se transfiere en buena medida a los productos que se elaboran a partir de ella en la industria lctea y que inciden de manera representativa en la vida til tanto de la materia prima como del producto terminado. la vigilancia y control del estndar microbiano es necesario en cada punto de la cadena lctea, en la obtencin de la leche cruda en los hatos lecheros, en el trans-porte y manipulacin, en el acopio y almacenamiento e incluso en las lneas de proceso [1]. las herramientas para la determinacin de este parmetro, actualmente, son muy sofisticadas y costosas, y slo estn al alcance de las grandes industrias procesadoras de alimentos, sin la posibilidad de que pequeos centros de acopio puedan acceder a esta tecnologa. pero industrias y organizaciones con bajos recursos han retomado las tcnicas convencionales de colorimetra para la determinacin de la calidad higinica de la leche cruda. las pruebas colorimtricas en cuestin, son tcnicas de anlisis verstiles y convencionales, que evidencian indirectamente la calidad higinica de la leche cruda y su capacidad de conservacin, por medio de cambios en la tonalidad de color. su versatilidad radica en que

se requieren equipos de laboratorio y reactivos no muy cotosos, y se puede aplicar a gran nmero de muestras [1,6]. en colombia el sistema de pago al productor por la calidad de la leche cruda suministrada a la industria, adopt inicialmente la Reductasa o tiempo de Reduccin de azul de Metileno (tRaM) mediante la Resolucin 0321 de 1999 del Ministerio de agricultura y desarrollo Rural, sin embargo posteriormente fue derogada por la Resolucin 0012 de 2007 del mismo Ministerio, donde se cambian los Mtodos indirectos de evaluacin higinica de la leche (tRaM) por el Mtodo directo de recuento total de bacterias mediante el Recuento en placa (ufc/ml). las pruebas han estado sujetas a muchos estudios de comparacin entre s con otros anlisis de referencia como el Recuento en placa, el conteo de bacterias y leucocitos al microscopio; cada investigacin se ha encaminado a presentar variantes de las pruebas con el fin de aproximarse a la calidad bacteriolgica real de la leche cruda [2,3]. entre las variantes encontradas en la literatura, estudios especializados establecen para la prueba de azul de Metileno, que las muestras sometidas a evaluacin se dejan almacenadas por 18 horas antes de incubarlas; para la Resazurina el uso de una escala de coloracin con incubacin a una hora, o prolongar el tiempo de incubacin por tres horas teniendo como refe-rencia una tonalidad particular de la Resazurina, o tener en cuenta el tiempo de reduccin y la coloracin

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rosa como punto final para determinar el parmetro de calificacin.

Figura 1. curvas de tiempo potencial de muestras de leche con azul de Metileno

ESTADO DEL ARTE

las pruebas colorimtricas de azul de Metileno y Resazurina, indican la variacin del potencial de oxidoreduccin en la leche por cambios en la tonalidad del colorante en solucin, dependiendo de la actividad reductora de los microorganismos y de las sustancias reductoras presentes en la leche. como indicadores redox, la Resazurina y el azul de Metileno tienen un rango de potencial cerca de 100mv en el cual suceden los cambios de color a formas decoloradas, estos cambios tambin se pueden determinar por potenciometra directa [4,5]. en la reduccin de azul de Metileno en solucin, se conocen cuatro sistemas de reduccin: un sistema bajo condiciones estrictamente anaerbicas que es capaz de reducir el azul de Metileno en la leche cruda. un sistema tambin presente en la leche cruda el cual es capaz de reducir el azul de Metileno anaerbicamente en presencia de formaldehdo. un sistema de reduccin presente en leche pasteurizada el cual es revelado bajo condiciones anaerobias. un sistema de reduccin formado por leche cruda y leche pasteurizada anaerbicamente en presencia de luz.

Fuente: adaptado de thornton, H y Hastings, e. 1929

Figura 2. curvas de tiempo potencial de muestras de leche con azul de Metileno y Resazurina

Fuente: adaptado de Johns, c y Howson, R. 1940

el azul de Metileno evala la cantidad aproximada de bacterias en la leche y, por tanto, la capacidad de conservacin. el mecanismo del azul de Metileno para valorar la calidad microbiolgica est relacionado con la actividad reductora de las bacterias que en el proceso de respiracin eliminan el oxgeno disuelto en la leche y el colorante se reduce hasta que se elimina totalmente [6]. cuando no implica un cambio de oxgeno en la reduccin, dos tomos de Hidrgeno estn involucrados en la reaccin. es importante identificar el origen del Hidrgeno y qu sustancias lo forman para descartar que los sistemas de reduccin no estn influenciados por bacterias [7].

Figura 3. Mecanismo de reduccin del azul de Metileno

Fuente:thornton, H y Hastings, e. 1929

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Componentes de la leche que inciden en la reduccin del Azul de Metileno. la lactosa, la cual est presente en la leche en una cantidad del 5%, es un azcar reductor y podra recibir alguna consideracin como agente que contribuye en la reduccin de los colorantes que se utilizan para evaluar la calidad en la leche. pero se le ha dado especial importancia a un grupo de componentes, que han sido llamados metabolitos. algunos autores han estudiado el efecto de la cistena (metabolito) proveniente del glutation, sobre la reduccin del azul de Metileno. al adicionar una parte de cistena a 1000 partes de leche los resultados encontrados establecen cadas sbitas del potencial redox en la leche, alcanzado una decoloracin completa del azul de Metileno antes de una hora de incubacin [7]. Sistema de reduccin en leche masttica. nilsson, establece en sus estudios a partir del mtodo de potenciometra directa, que muestras obtenidas aspticamente de cuartos individuales en los cuales se diagnostic mastitis, condujeron a una cada del potencial notablemente, en comparacin con leche de ubres sanas. este sistema es lo bastante fuerte para producir una cada en la variacin del potencial entre 50 a 400 mv. Papel de las enzimas y sustancias donadoras de hidrgeno. la leche est constituida por diversos sistemas biolgicos de reduccin propios de ella como las enzimas, y otros, influenciados por el crecimi-ento de los microorganismos. ambos contribuyen al descenso del potencial, debido a formacin de iones H+ por la presencia de sustratos donadores de Hidrgeno para las enzimas y metabolitos secundarios en la descomposicin de los constituyentes de la leche por la accin de las bacterias. el potencial redox en sistemas biolgicos es denotado por eo. el valor de eo es determinado en casos de sistemas de reduccin que implican iones H+. en un estudio llevado a cabo por nilsson llamado rol de la xantino oxidasa, investig los cambios de potencial redox que ocurren en leche normal y leche masttica adicionando diferentes donadores de hidrgeno; estas sustancias son capaces de activar los sistemas enzimticos de la leche como es el de la Xantino oxidasa, el cual genera marcadas cadas en el potencial en la leche para ambos casos [8]. los sistemas de reduccin que no estn afectados por la presencia de bacterias pueden contribuir a la

cada del potencial en la leche, segn su valor de eo (ver cuadro 1). se ha demostrado la existencia de una alta concentracin de la enzima Xantino oxidasa en leche masttica que en leche normal, cuando se hizo la prueba de la solucin de schardinger, la cual fue reducida ms rpidamente que la leche normal. la solucin de schardinger est constituda por azul de Metileno y formaldehdo, siendo este ltimo el donador para la Xantino oxidasa [8]. Influencia del contenido de grasa y leucocitos sobre la capacidad de reduccin de la leche. en investigaciones se encontr que un contenido alto de grasa fue asociado con una mayor rapidez en la cada del potencial en leche masttica, esto se debe evidentemente a los siguientes factores: la xantino oxidasa est ligada a la grasa y sta por lo tanto, presente en mayor concentracin en muestras con un alto contenido de la misma y; la superficie sobre la cual la reaccin puede ocurrir es mayor en leche rica en grasa que en leche con poca grasa. por consiguiente el sistema Xantn oxidasa, est concentrado principalmente en la superficie de la membrana de los glbulos grasos [8].
Cuadro 1. sistemas de xido reduccin y sustancias que posiblemente influyen en el potencial de la leche cruda.

Enzima

Sustrato alcohol etlico cido lctico

Eo a pH 7 -0,090 0,16 -0,18 -0,10 -0,45 -0,03 0,01 -0,37 -0,37 0,27 0,078-0,05 -0,27 -0,208 -0,233

dehidrogenasas

cido mlico glucosa cido glutmico cido succnico Hipoxantina, aldehdos Xantino

oxidasas Peroxidasas (requieren H2o2)

citrocromo c reducido cido ascrbico aminas aromticas y fenoles en la leche. citocromo reducido glutation

Fuente: nilsson, g. 1959

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en estudios anteriores se crea que las propiedades de reduccin de leche masttica de bajo contenido bacteriano son debidas al alto contenido de leucocitos en la leche. se demostr que los leucocitos no son directamente responsables del fenmeno de reduccin, como se crea anteriormente. se practic un ensayo en el cual se extrajeron leucocitos de un cuarto afectado y se adicion la muestra a leche obtenida de un cuarto sano; ninguna mostr cada en el potencial. la explicacin est en que la presencia de leucocitos en la leche, produce un aumento cuantitativo de la transferencia de otras sustancias de la sangre a la leche durante su sntesis por parte de los alvolos. [8]. Propiedades de reduccin de los microorganismos de la mastitis. entre los microorganismos que causan la mastitis los ms comunes son los estreptococos, estafilococos y coliformes. los estreptococos son los responsables, por lo menos del 85% de los casos de mastitis crnica. a diferencia de los estreptococos cido lcticos, los estreptococos de la mastitis son por regla general los hemolticos. se demostr que puede ocurrir una cada en el potencial en un cultivo bacterial de estreptococos hemolticos s se adiciona catalasa, aunque estos tienen propiedades de reduccin extremadamente dbiles. puesto que leche con mastitis contiene relativamente gran cantidad de catalasa, es bastante comprensible que los constituyentes de la leche sean un buen medio para el desarrollo de microorganismos hemolticos conforme a lo establecido por Hobbs [9]. con otro tipo de microorganismos se han realizado ensayos para para identificar la capacidad de reduccin de cepas puras de microorganismos como el Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Corynebacterium pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae y Streptococcus uberis, los cuales demostraron que, cerca de 5000 microorganismos por mililitro fueron necesarios para obtener una cada en el potencial. en los casos de microorganismos coliformes causantes de mastitis, mostraron una capacidad de reduccin marcada. as, por ejemplo en los casos de mastitis debido a E. coli y posiblemente a estafilococos, se puede pensar que la capacidad de reduccin de leche masttica a 37 c puede ser en parte de origen bacterial, si los organismos patgenos estn presentes en gran nmero [8].

Estudios de Resazurina. Ha sido establecido por garvie y Rowlands, que uno de los mayores factores que contribuyen a la inexactitud de las pruebas colorimtricas como un significado de la calidad bacterialgica, evaluada en la leche cruda, es la variacin en la capacidad de reduccin de diferentes bacterias y la respuesta que tienen con los test de Resazurina, azul de Metileno y otras pruebas de calidad. el origen de la disimilitud podra estar en la interaccin total de la flora normal de la leche cruda resultando en una aceleracin o retardo de la reduccin de los colorantes [10,11]. para determinar la capacidad de reduccin de la Resazurina frente a determinadas cepas, greene y Jamison aislaron bacterias de una muestra de leche normal utilizando cultivos apropiados, las cepas obtnidas fueron Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis y Streptococcus lactis. las cepas puras se suspendieron en soluciones salinas manejando tres concentraciones diferentes., como resultado se encontr un sinergismo entre los diferentes tipos de bacterias dependiendo de la cantidad del inculo y en algunos casos de la actividad de reduccin de los microorganismos. como sucede con B. subtilis y P fluorescens. algunas veces existe una leve . reduccin como P fluorescens o lo contrario una fuerte . capacidad de reduccin con S. Lactis [11]. Estudios comparativos de Resazurina y Azul de Metileno. los estudios comparativos de Resazurina y azul de Metileno como indicadores de la calidad bacterialgica han sido material de estudio por diferentes investigadores. se ha encontrado que el test de Resazurina en un hora es me nos confiable que el test de azul de Metileno en leche que contiene gran nmero de microorganismos, ya que existe dificultad para distinguir matices de coloracin de la resazurina durante el periodo de reduccin. por consiguiente se ha tomado como referencia el tiempo de reduccin de la Resazurina en la coloracin rosa; Johns y Howson establecen que existe una muy buena correlacin entre los tiempos de reduccin para Resazurina y azul de Metileno, la proporcin es de 3 a 4. consecuentemente el test de Resazurina, usando el color rosa como punto final puede ser considerado tan preciso como el test de azul de Metileno como indicador del contenido bacterial de la leche. adems el tiempo de reduccin de la Resazurina es menor que el del azul de Metileno [3]. segn Barrett y Keenan, el uso de la Resazurina da ms informacin de la calidad de la leche que cualquier otro indicador qumico por presentar una escala de colora-

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cin. el propsito del trabajo de los autores fue presentar datos que indicaran, que el test de Resazurina cuenta con una propiedad adicional como indicador de calidad por encima del azul de Metileno que est relacionado con sus coloraciones. esta prueba tiene a favor que el tiempo de incubacin es ms corto y est asociado a un diagnstico al microscopio en la rutina del control de calidad de la leche cruda. en un ensayo con 220 muestras para comparar la reduccin de la Resazurina y el azul de Metileno se encontr que en muchos casos no se afect el tiempo de reduccin del azul de Metileno. esto puede ocurrir por el hecho de que los estafilococos tienen una particular aptitud para reducir la Resazurina en comparacin con otros tipos de bacteria encontrados en la leche [4]. igualmente, el test de Resazurina es comparado con el de azul de Metileno con respecto al conteo en placa. de los resultados obtenidos, establecen los autores que los datos como la calidad bacterial de la leche obtenida en una hora de incubacin con Resazurina, son completamente confiables como el test de azul de Metileno en 7 horas de incubacin (ver cuadros 2, 3). adems la Resazurina es ms sensible a leches patolgicas y fisiologas anormales de la ubre que el azul de Metileno [4].

MATERIALES Y MTODOS.
Lugares a muestrear dentro de la asociacin de productores de leche de sotar aspRoleso, existen cuatro rutas de acopio de leche, la ruta paispamba, ullucos, chapa y piedra de len; el nmero de productores son: 10, 13, 50 y 43 respectivamente. Toma de muestras las muestras de leche cruda se tomaron en recipientes esterilizados de vidrio mbar de capacidad de 100 ml. las muestras fueron transportadas en caja de embalaje refrigerada que permiti conservarlas para su anlisis en el laboratorio. las muestras de leche se tomaron en el momento de la entrega de leche al transportador (en ruta de recoleccin), en la recepcin en el centro de acopio (planta de enfriamiento) y posteriormente en el tanque de almacenamiento, de una mezcla homognea y representativa.

Cuadro 2. comparacin del color de Resazurina en una hora con el conteo estndar en placa

N de muestras 220 30 32 14 7 2

Color de resazurina azul Rosado prpura Rosado claro Rosado Rosado oscuro Blanco

< 25.000 160 7 17 8 4 1

Conteo estndar en placa UFC/mL 25.00050.000100.00050.000 100.000 200.000 32 14 9 12 3 3 10 2 2 2 1 -

>200.000 5 5 2 2 2 1

Fuente: Barrett, W y Keenan, J. 1938

Cuadro 3. comparacin del tiempo de reduccin del azul de Metileno con el conteo estndar en placa

N de muestras 253 19 7 23

T.R.A.M 7 horas 6 horas 5 horas < 5 horas

< 25.000 174 6 2 4

Conteo estndar en placa UFC/mL 25.00050.000100.00050.000 100.000 200.000 48 13 12 5 3 3 1 2 5 2 3

>200.000 6 2 2 8

Fuente: Barrett, W y Keenan, J. 1938

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Equipos incubadora o bao de mara a 37 c 1 c con control y uso de termmetro calibrado peridicamente, autoclave para la esterilizacin de materiales, y balanza analtica. Materiales y reactivos tubos de vidrio de tapa rosca estriles, pipetas de 10 ml estriles y secos, pipeta de 1 ml estril y seco, propipetas, matraces aforado de 1000ml y de 100 ml estriles, frascos de vidrio mbar con tapa, gradillas y neveras de icopor. para la prueba de Reductasa (tRaM) y Resazurina, se us una concentracin de 50 g/ml de agente activo. las cantidades fueron pesadas en balanza analtica con precisin de 0.1 mg. Anlisis de laboratorio las muestra recogidas se analizaron en el laboratorio de control de calidad de aspRoleso, siguiendo los cuidados del protocolo operativo estndar de muestreo para la prueba de Reductasa (t.R.a.M) y la prueba de Resazurina en una hora [6,12]. Anlisis de datos. Relacin entre las pruebas de Resazurina y tiempo de reduccin del Azul de Metileno. para el objeto de este estudio y los estadsticos a desarrollar, se elabor una escala comn a ambas pruebas (ver cuadro 4), para facilitar la aplicacin de las pruebas pareadas de la t-student y rangos con signo de Wilcoxon. para establecer la relacin entre las dos pruebas se tiene en cuenta estudios realizados por Barrett y Keenan donde se establecen 6 escalas de valoracin para la prueba de Resazurina y adems se hace una comparacin del tiempo de reduccin del azul de Metileno con las diferentes coloraciones de la Resazurina. Planteamiento de la hiptesis. la relacin de las pruebas se determin mediante el anlisis estadstico de los datos con el fin de probar la hiptesis: las dos pruebas colorimtricas se relacionan al medir la calidad higinica de la leche cruda. Ho : 1 = 2 H1 : 1 2 ec. (1) ec. (2)

Cuadro 4. escala de valoracin nica que relaciona la prueba de azul de Metileno y la de Resazurina.

Escala nica 7 6 5 4 3 2 1 0,5

Fuente: los autores

Azul metileno (Tram) 7-8 6 5 4 3 2 1 0,5

Resazurina 6 5.5 5 4,5 3,5 4 2,5 3 1,5 2 0-1

donde 1 y 2 corresponden a las medias pareadas para las pruebas de azul de Metileno y Resazurina en una hora. Incidencia del transporte en la calidad higinica de leche cruda. para determinar el efecto causado por el transporte en la calidad higinica de la leche cruda acopiada por aspRoleso, se tomaron muestras de leche en ruta de recoleccin y en planta de enfriamiento; a la vez se eligieron al azar los proveedores a los cuales se les realizara seguimiento en el proceso de acopio. para evaluar la incidencia del transporte en los dos sitios de muestreo, se aplic el anlisis estadstico de medias marginales, donde la variable observada fue la calidad higinica de la leche cruda, medida con el tiempo de reduccin del azul de Metileno (t.R.a.M).

RESULTADOS Y DISCUSIN
los resultados obtenidos del anlisis de calidad de las pruebas conjuntas de Resazurina en 1 hora y tiempo de reduccin de azul de Metileno aparecen en los siguientes histogramas de frecuencias con medias 6, 5,4 y desviaciones estndar de 1,13, 1,45 para las dos pruebas respectivamente. como se observa en los grficos, la desviacin para la prueba de azul de Metileno es superior, lo cual sugiere que este parmetro es de mayor exigencia para evaluar la calidad higinica de la leche cruda.

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Figura 4. Histograma para la prueba de Resazurina en una hora

de oxido-reduccin por la presencia de bacterias. (ver cuadro 5 y 6). tambin es sabido que la leche tiene la capacidad de auto conservarse durante un tiempo cercano a las dos horas despus de ser obtenida en el ordeo, y que est asociada a la accin bactericida del sistema lactoferrina - lacto-peroxidasa. como lo afirma Johns [2] en su estudio, el test de Resazurina en una hora es menos confiable que el test de azul de metileno y se dificulta comparar los cambios en las tonalidades de coloracin para la Resazurina, el autor prefiri hacer un cambio en la prueba usando como parmetro el tiempo de reduccin de la Resazurina hasta el estado de coloracin rosa encontrando una buena correlacin entre el test de Resazurina y azul de metileno. incluso en estudios que comparan variantes del test de Resazurina prolongando el tiempo de reduccin por 3 horas, y tomando como referencia una tonalidad intermedia entre el color azul y el color rosa, establecen un mejor resultado y aproximacin de la prueba modificada con el conteo en placa [13]. otros estudios relacionados con la prueba de Resazurina, le confieren una propiedad adicional que no la tiene el azul de metileno, relacionando los cambios en la coloracin de sta como una prueba diagnstica para establecer las posibles fuentes de contaminacin microbiana de la leche cruda [3]. esta ltima propiedad se debe considerar cuando se pretenda identificar el problema de calidad higinica en los hatos lecheros. observando las figuras 6 y 7 donde se resume la informacin de las cuatro zonas de acopio, en ruta y planta; se puede concluir que las muestras tomadas en ruta reflejan una calidad de buena a excelente utilizando ambas pruebas, en la planta de acopio la calidad disminuye, siendo la prueba de azul de metileno ms selectiva en este rango. el cambio de valoracin es marcado pasando de ruta a planta, fenmeno debido al almacenamiento de la leche cruda, factores ambientales y de malas prcticas en el ordeo, que en conjunto desmejoran notablemente la calidad higinica de la leche durante su transporte. el azul de metileno es capaz de identificar leches de mala calidad desde el ordeo, mientras que la Resazurina slo la detecta en planta, esto debido a que el tiempo de incubacin es superior para la prueba de reductasa.

Fuente: los autores Figura 5. Histograma para la prueba de azul de Metileno

Fuente: los autores

los datos fueron corregidos a la escala de valoracin en los que se evala las pruebas estadsticas para determinar la diferencia o semejanza entre las pruebas como sigue. al evaluar las dos pruebas de calidad higinica con los estadsticos de la t-student y con el de rangos de signo de Wilcoxon, se obtuvo p< 0.001 para los estadsticos de prueba, lo cual sugiere que la hiptesis establecida las dos pruebas colorimtricas se relacionan al medir la calidad higinica de la leche cruda es rechazada en este estudio, esto se debe a que el tiempo utilizado en la prueba de Resazurina (una hora), no es el suficiente para que sufra un cambio considerable en el potencial

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Cuadro 5. estadsticos para muestras relacionadas t-student

Diferencias relacionadas Relacin azul de metileno-Resazurina

Fuente: los autores int. conf. dif.= intervalo de confianza para la diferencia

media 0,616

Desv. 1,433

Error 0,081

95% Int. Conf. Dif. inferior superior 0,457 0,775

Valor T 7,629

Grados de libertad 314

Significancia < 0,001

Cuadro 6. prueba de los rangos con signo de Wilcoxon

Relacin azul de metilenoResazurina

Fuente: los autores azul de metileno < resazurina Azul de metileno > resazurina azul de metileno = resazurina

Rangos negativos positivos empates total

N 154a 62b 99c 315

Rango promedio 117,27 86,73

Suma de rangos 18059,00 5377,00

Valor z

Sign

-7,062

< 0.001

Figura 6. calificaciones de Resazurina para ruta y planta de acopio en las cuatro zonas de recoleccin de Febrero a Junio de 2007.

Figura 7. calificaciones de azul de Metileno para ruta y planta de acopio en las cuatro zonas de recoleccin de Febrero a Junio de 2007.

Fuente: los autores

Fuente: los autores

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en vista de que se encontr una diferencia entre las pruebas y considerando que la prueba de azul de metileno presenta un rango ms amplio de evaluacin, nicamente se le dio importancia a la prueba de azul de metileno para realizar el anlisis estadstico entres zonas y sitios de muestreo. se clasificaron las muestras pareadas, es decir, muestras de un mismo productor tomadas en sitio de entrega y planta de acopio resultando 70 muestras para anlisis entre ambos sitios de muestreo por cada zona. como se puede observar en la figura 8 y en los datos del el cuadro 7 existe una tendencia de las medias marginales evaluadas para la calidad higinica de la leche cruda por sitios de muestreo, con un comportamiento decreciente para todas las zonas, aunque es
Figura 8. Medias marginales estimadas por sitios de muestreo para cada zona

ms marcado para las zonas chapa, piedra len y paispamba. la zona de ullucos tiene en promedio la mejor calificacin de calidad de leche entregada en la ruta, adems presenta menos variacin entre muestras tomadas en ruta y en planta de acopio, esto indica que existe una mejor conservacin de la leche. tambin tiene un comportamiento independiente a las dems zonas por presentar unas condiciones climticas de bajas temperatura de 8c en promedio y el tiempo de transporte se aproxima a 3 horas. en la zona de chapa la calidad higinica de la leche est por debajo de las otras zonas iniciando con una calificacin inicial promedio de 5,85 y una calificacin final de 4,3; este cambio puede comprometer la calidad higinica de la leche de las dems zonas que se almacenan en el tanque de enfriamiento.

CONCLUSIONES
la comparacin de las dos pruebas permiti encontrar diferencias significativas entre las pruebas de resazurina y azul de metileno que llev a ajustar la calidad de la leche acopiada en la asociacin, mediante la identificacin de nuevos casos de baja calidad higinica en la leche que no se haban detectado con la prueba de resazurina en productores que se encontraban prximos a la planta de acopio o productores en los que se hacia el muestreo de leche recin ordeada.

Fuente: los autores

Cuadro 7. interaccin entre los datos por zonas y sitios de muestreo mediante medias marginales estudiadas

zona paispamba n=70 ullucos n=70 piedra de len n=70 chapa n=70
Fuente: los autores 1 ruta de recoleccin 2 planta de acopio

Sitios 1 2 1 2 1 2 1 2

Media 6,343 4,829 7,029 6,143 6,343 4,843 5,857 4,271

Error tp. 0,191 0,246 0,191 0,246 0,191 0,246 0,191 0,246

Intervalo de . conf. al 95% Lmite inferior Lmite superior 5,966 6,720 4,342 5,315 6,656 7,406 5,656 6,630 5,966 6,720 4,356 5,330 5,480 6,234 3,785 4,758

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Facultad de ciencias agropecuarias vol 6 no. 2 diciembre 2008

el patrn del tiempo de reduccin de azul de metileno permite evaluar la calidad higinica de la leche en un rango ms amplio diferencindose los cambios de calidad y no se presta para sesgar una calificacin especfica como si lo hace la prueba de resazurina en una hora usando como referencia los cambios en la tonalidad del colorante. es preciso considerar si la modificacin de la prueba de resazurina, tomando como parmetro el tiempo de decoloracin de la misma y no los cambios en los estados de coloracin, mejore los resultados como parmetro en la evaluacin de calidad higinica de la leche cruda. REFERENCIAS [1] KEaTING, Patrick y rODrGUEZ, Homero. Introduccin a la lactologa. Mxico : Limusa Noriega Editores, 2004. p. 75-77 [2] JoHns, c y HoWson, R. potentiometric studies with Resazurin and Methylene Blue in Milk. en : Journal dairy science. vol.23 (1940); p. 295302 [3] BaRRett, W.; Rutan, H. y Keenan, J. the resazurin test-its use and practicability as applied to the quality control of raw milk. en : Journal dairy science. vol.20 (1937); p. 705-709. [4] tHoRnton, H y Hastings, e. studies on oxidation-reduction in milk. oxidation-reduction potentials and the mechanism of reduction. en : Journal of Bacteriology, vol. 18 no 5 (1929); p 293-317 [5] univeRsidad del Zulia. introduccin al control de la calidad de la leche cruda gua prctica. [artculos en lnea]. Maracaibo. 2007. [citado el 15 de agosto de 2007]. disponible en internet: // members.tripod.com.ve/tecnologa/ introduccin. htm. [6] KiRK, Ronald. egan, Harol. composicin y anlisis de los alimentos de pearson. 2ed. Mxico : compaa editorial continental, 1996. p. 607609 [7] tHoRnton, H y Hastings, e. studies on oxidation-reduction in milk. oxidation-reduction potentials and the mechanism of reduction. en : Journal of Bacteriology, vol. 18 no 5 (1929); p 293-317

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