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ANTICUERPOS MONOCLONALES:

Anticuerpos recombinantes para la deteccin de patgenos y inmunoterapia

FRANCISCO ALVAREZ MARLA MARIN LUIS MENDEZ ALDRIN SALGADO

Presentado al profesor: ALFREDO LAGARES G.

En la asignaturade. BIOTECNOLOGA

UNIVERSIDAD DEL ALTANTICO QUIMICA Y FARMACIA Noviembre de 2010

ANTICUERPOS MONOCLONALES:
Anticuerpos recombinantes para la deteccin de patgenos y inmunoterapia
Las terapias dirigidas se han convertido en la punta de lanza de la innovacin en nuevas tratamientos. Dentro de ellas, los anticuerpos son el ejemplo ms claro y quizs ms revolucionario. Los anticuerpos monoclonales estn cada vez ms instaurados en la farmacopea. Hoy en da, estamos asistiendo a un nuevo paradigma en la produccin y utilizacin clnica de estas terapias, con el desarrollo de los anticuerpos monoclonales totalmente humanos. Esta tecnologa presenta claras ventajas en su utilizacin clnica sobre los anticuerpos monoclonales no totalmente humanos. Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo homogneo producido por una clula hbrida producto de la fusin de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y nica clula madre y una clula plasmtica tumoral. Los anticuerpos monoclonales (Mab, del ingls monoclonal antibody), son anticuerpos idnticos porque son producidos por un solo tipo de clula del sistema inmune, es decir, todos los clones proceden de una sola clula madre. Es posible producir anticuerpos monoclonales que se unan especficamente con cualquier molcula con carcter antignico. Este fenmeno es de gran utilidad en bioqumica, biologa molecular y medicina. Los anticuerpos monoclonales son una herramienta de gran utilidad en el campo de la medicina, la bioqumica y la biologa molecular por su capacidad de reconocer molculas con diferente estructura qumica. Son empleados habitualmente tanto en el diagnstico como en el tratamiento de enfermedades. La inmunizacin de un animal con un determinado antgeno, que puede ser cualquier molcula que sea capaz de estimular al sistema inmune, provoca la proliferacin de aquellos linfocitos que han reconocido la presencia del antgeno y la produccin como respuesta de una amplia variedad de anticuerpos de diferente especificidad y afinidad. Como diferentes linfocitos producen anticuerpos estructuralmente diferentes que reconocen distintas partes del antgeno, lo que se obtiene como resultado de la respuesta inmune es una mezcla fisiolgica natural de anticuerpos conocida como antisuero policlonal. Es necesaria una tcnica efectiva para generar y mantener anticuerpos iguales en estructura que se unan de forma idntica al antgeno.

Descubrimiento de los anticuerpos monoclonales

Los investigadores Niels K. Jerne, Georges Khler y Cesar Milstein, describieron la tcnica que permita el cultivo de hibridomas o clulas hbridas de linfocitos B con clulas plasmticas tumorales de mieloma mltiple. Con esta fusin de dos clulas, una programada para producir un anticuerpo especfico pero que no se multiplica indefinidamente (linfocito) y otra inmortal con gran capacidad de crecimiento pero que no produce inmunoglobulina (clula de mieloma), se combina la informacin gentica necesaria para la sntesis del anticuerpo deseado y una capacidad de sntesis proteica, permitiendo su multiplicacin indefinida tanto in vitro como in vivo. Por esta aportacin a la ciencia Jerne, Klher y Milstein recibieron el premio Nobel de Medicina en 1984. En el ao 2010, los anticuerpos monoclonales han cumplido 30 aos desde su invencin dejando de ser una curiosidad biolgica para ser una forma de tratamiento y diagnstico muy importante en diversas enfermedades. Existen ms de 17 anticuerpos monoclonales aprobados por la FDA, pero el nmero de anticuerpos monoclonales en fase de ensayo clnico es elevado y representan un 30 por ciento de todos los compuestos en investigacin en el 2005. Muy importante para tratamientos de distintas enfermedades como artritis reumatoide, distintos canceres, enfermedad de Crohn...

Produccin de anticuerpos monoclonales


Si una sustancia extraa (antgeno) se inyecta en el cuerpo de un ratn o un humano, alguna de las clulas B de su sistema inmune se transformar en clulas plasmticas y empezarn a producir anticuerpos que se unirn a ese antgeno. Cada clula B produce un solo tipo de anticuerpo, pero diferentes linfocitos B producirn anticuerpos estructuralmente diferentes que se unen a distintas partes del antgeno. Esta mezcla fisiolgica natural de anticuerpos es conocida como 'anticuerpos policlonales'. Para producir anticuerpos monoclonales, primero se extraen clulas B del bazo de un animal que ha sido expuesto al antgeno. Estas clulas B son fusionadas con clulas tumorales de mieloma mltiple (un tipo de cncer) que pueden crecer indefinidamente en cultivo celular. Esta fusin hace a las membranas celulares ms permeables. Estas clulas fusionadas hbridas, llamadas hibridomas pueden multiplicarse rpida e indefinidamente, puesto que son clulas tumorales despus de todo y pueden producir gran cantidad de anticuerpos. Los hibridomas son suficientemente diluidos y cultivados para obtener un nmero diferente de determinadas colonias, las cuales producen slo un tipo de anticuerpo. Los anticuerpos de diferentes colonias son analizados para conocer su capacidad de

unirse a un antgeno determinado, por ejemplo con un tipo de test llamado ELISA, y para seleccionarse y aislarse de la manera ms efectiva.

El proceso de produccin de anticuerpos monoclonales es complejo. Primero se disgrega el bazo del raton inmunizado, donde se acumulan los linfocitos B que tienen una escasa viabilidad en cultivo, y se fusionan con clulas de mieloma deficientes en enzimas implicados en la sntesis del nuevo ADN como la timidina quinasa (TK) o la hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT). Los productos de la fusin celular (hibridomas) son cultivados en medio HAT (de hipoxantina, aminopterina y timidina) donde las clulas mielmicas son eliminadas. Tan slo las clulas producto de la fusin entre un linfocito y una clula de mieloma son capaces de crecer en medio HAT. Las clulas hbridas obtenidas tras el proceso de fusin contienen un nmero elevado de cromosomas (72 del mieloma y 40 del linfocito B) que en las sucesivas divisines celulares se irn perdiendo hasta oscilar entre los 70 y los 80 cromosomas. Como consecuencia de dicho proceso, algunas clulas pierden la capacidad de secrecin de anticuerpos o bien funciones bsicas para la viabilidad celular. Por ello tan pronto como se identifica como positivo un pocillo se somete a un proceso de clonacin para evitar

el crecimiento de clulas no productoras que al ser metablicamente ms eficientes acabaran por dominar el cultivo. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos en cultivos celulares o en animales. Cuando las clulas de un hibridoma son inyectadas en cultivos de tejidos como el peritoneo (cavidad peritoneal), produce tumores que sintetizan un fluido rico en anticuerpos llamado lquido asctico. Se conoce la tecnologa necesaria para la produccin de anticuerpos en ausencia de inmunizacin del animal. Es la denominada tecnologa de los anticuerpos recombinantes. Los avances en la tecnologa gnica han facilitado en gran medida la manipulacin gentica, produccin, identificacin y conjugacin de fragmentos de anticuerpos recombinantes, obtenindose nuevos anticuerpos multivalentes y multiespecficos. Estas tecnologas han permitido desarrollar estrategias de screening de anticuerpos monoclonales fuera del cuerpo humano. Para ello es necesario disponer, en primer lugar de enormes libreras de genes de anticuerpos, habitualmente mediante amplificacin PCR de cADN de linfocitos, o, alternativamente, mediante sntesis in vitro de genes usando cebadores randomizados ("randomized wobble"). El mtodo de 'screening' de estas libreras debe tener una eficiencia comparable a la del sistema inmune, lo que se puede conseguir exponiendo en la superficie de microorganismos los anticuerpos producidos. Ejemplos de los microorganismos empleados son los fagos filamentosos como M13 o bacterias. Esta presentacin en superficie permite establecer un enlace fsico entre la funcin de unin al antgeno y el gen del anticuerpo, de forma que la afinidad al antgeno permite aislar el microorganismo portador del gen del anticuerpo de inters entre millones de otros. Una vez aislado el clon especfico se amplifica para la produccin del anticuerpo de inters por ejemplo en E. coli.

Desarrollo de anticuerpos monoclonales totalmente humanos: Anticuerpos monoclonales quimricos y humanizados


Los anticuerpos son biomolculas de naturaleza proteica que se caracterizan por poseer la capacidad de reconocer y unirse especficamente a un antgeno. En el ao 1975, Kholer y Milstein describieron que si se fusionaban clulas plasmticas productoras de anticuerpos con una clula de un tumor llamado mieloma, se conseguan clulas, las llamadas hibridomas, que tenan las propiedades de los dos tipos celulares iniciales, esto es: eran clulas productoras de anticuerpos, como las clulas plasmticas y que podan mantenerse de manera indefinida en cultivo (como las clulas mielomatosas). La posterior seleccin de la mejor de dichas clulas y su expansin, dando lugar a un clon, permita producir

anticuerpos procedentes de un nico clon y, por lo tanto, homogneos (anticuerpo monoclonales, AcM) en cantidades ilimitadas1. Inicialmente, la inmunizacin con el antgeno para obtener las clulas plasmticas se haca sobre roedores (habitualmente ratones), por lo que los AcM obtenidos eran de ratn. Esto limitaba su utilizacin en la clnica, ya que su inyeccin en humanos generaba una respuesta inmunolgica frente al propio AcM, la denominada HAMA (siglas en ingls de Human anti-murine antibody) que neutralizaba la posterior utilizacin del anticuerpo y limitaba su uso, en muchos casos, a una nica administracin2,3. Por consiguiente, la investigacin en la utilizacin teraputica de los AcM ha ido, en buena medida, dirigida a disminuir dicha capacidad inmunognica (3). se ha obtenido una generacin de anticuerpos monoclonales, basada en la humanizacin de los anticuerpos monoclonales de ratn mediante ingeniera gentica, evitando as el rechazo del sistema inmune al ser introducidos en el organismo. Son los llamados anticuerpos quimricos. Un anticuerpo quimrico es creado de tal manera que incorpora parte animal y parte humana. La parte animal o hipervariable (un 30%) es indispensable para que el anticuerpo reconozca la sustancia extraa (antgeno) y la parte humana (un 70%) es responsable de que el sistema inmunitario pueda contribuir a aadir efectividad a su accin. De este modo es posible modificar los anticuerpos monoclonales, casi de manera infinita para dotarlos de propiedades efectoras y de reconocimiento diferentes a las originales y minimizar la posibilidad de generar respuesta inmune frente al propio anticuerpo teraputico.

El primer intento ha consistido en producir AcM quimricos en los que la regin variable del anticuerpo, que es la que se une al antgeno (aproximadamente un 34% de la protena), sigue siendo de origen murino, mientras que el resto del anticuerpo es de origen humano4-6. Si bien la utilizacin de estos AcM quimricos ha reducido significativamente la inmunigenicidad de los AcM, el desarrollo de anticuerpos humanos frente a la quimera (o respuesta HACA, human anti-chimeric antibody) sigue siendo un problema potencialmente importante, que requiere monitorizacin de los pacientes a los que se les administra, as como, en algunos casos, el tratamiento concomitante con corticosteroides3. Los anticuerpos monoclonales de ratn o murinos, pese a ser perfectamente vlidos para todos los usos teraputicos, no son tiles para su empleo en seres humanos, especialmente en terapias que requieran tratamientos prolongados, ya que el sistema inmune los identifica como cuerpos extraos y reacciona para destruirlos, por lo que su eficacia teraputica se ve claramente disminuida. Adems pueden presentar posibles efectos secundarios como nefrotoxicidad, reacciones anafilcticas, etc. Por ello se debera obtener anticuerpos monoclonales humanos. en la minimizacin de la inmunogenicidad producida por los AcM lo constituye la produccin de AcM 'humanizados', proceso inicialmente llamado reshaping con los que se consigue que los AcM contengan slo un 5 a 10% de protena murina4. Un

anticuerpo monoclonal humanizado significa que contiene un 90% de material humano, lo que reduce la inmunogenicidad de los anticuerpos, es decir, el rechazo del sistema inmunitario. Esta tcnica consiste en utilizar tecnologa de DNA recombinante para insertar las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs- complementary determining regions) de origen murino en un anticuerpo humano7. Con ello se esperaba poder eliminar prcticamente la inmunogenicidad, aunque en realidad todava se sigue observando respuesta inmunognica frente a dichos AcM humanizados, la llamada HAHA (human anti-human antibody)3. Por otra parte, el proceso de humanizacin no es simple, ya que en ocasiones se compromete la afinidad por el antgeno3,7. Se han desarrollado diferentes tcnicas para ofrecer soluciones a la inicial imposibilidad de obtener anticuerpos monoclonales enteramente humanos, entre las que destacan la transformacin de linfocitos B humanos en cultivo mediante el virus de Epstein-Barr, la utilizacin de ratones con inmunodeficiencia severa combinada, el uso de ratones transgnicos, o tcnicas de ADN recombinante. Todas estas tcnicas han presentado distintos inconvenientes que han imposibilitado el desarrollo final de los anticuerpos monoclonales humanos.

Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales


Una vez que se han producido anticuerpos monoclonales que se unen a determinadas sustancias, estos pueden ser usados para detectar la presencia y cantidad de esta sustancia, gracias a la prueba de Western blot, que detecta una sustancia en una solucin o con una prueba de inmunofluorescencia, que detecta una sustancia en una clula entera. Los anticuerpos monoclonales tambin son usados para purificar una sustancia con tcnicas llamadas inmunoprecipitacin y cromatografa. Los anticuerpos monoclonales muestran una serie de ventajas sobre los anticuerpos policlonales como: 1. Mayor homogeneidad. 2. Reproductibilidad de sus efectos, como consecuencia de su homogeneidad. 3. Mayor capacidad potencial de seleccionar los mejores anticuerpos en afinidad, tipo de reconocimiento. Los anticuerpos monoclonales se utilizan en muchos campos como: 1. La investigacin biomdica, como la identificacin y clonacin de genes, la identificacin y aislamiento de protenas, la activacin de enzimas, conocimiento de la estructura molecular y morfognesis.

2. Diagnstico: En medicina, gracias a la gran especificidad y capacidad prcticamente ilimitada de los anticuerpos monoclonales para reconocer cualquier estructura qumica, permite la deteccin de hormonas, vitaminas, citocinas; la monitorizacin de drogas, deteccin de enfermedades infecciosas en microbiologa; la deteccin de alergenos en alergia, hematologa, marcadores tumorales e infartos de miocardio, aplicaciones forenses, inmunoescintografa. En las tnicas diagnsticas se emplean diversas herramientas de biologa molecular como ELISA, EIA, citometra, inmunohistoqumica, inmufluorescencia. Los anticuerpos monoclonales son unas de las sustancias ms utilizadas en los laboratorios de diagnstico. 3. Catlisis: Los anticuerpos monoclonales se han utilizado como catalizadores de mltiples reacciones qumicas. 4. Biosensores: Los anticuerpos monoclonales acoplados a transductores electrnicos pueden detectar tanto molculas orgnicas como inorgnicas como la contaminacin de metales pesados en alimentos y agua, deteccin de gases txicos, etc. Un biosensor es un instrumento analtico formado por un material biolgico inmovilizado como una enzima, anticuerpo, clula entera, orgnulo o combinaciones de los mismos, en ntimo contacto con un sistema transductor adecuado que convierta la seal bioqumica en una seal elctrica cuantificable. 5. Tratamiento: Las aplicaciones teraputicas constituyen el campo ms importante de los anticuerpos monoclonales, ya que son capaces de erradicar ciertas infecciones y destruir clulas, incluidas las tumorales, mediante distintos mecanismos. Por esta razn, son excelentes sustancias para el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, el cncer o en trasplantes para evitar el rechazo. Existen varios anticuerpos monoclonales aprobados para su uso en determinadas enfermedades.

Anticuerpos monoclonales aprobados para uso teraputico


Cada vez son ms los anticuerpos monoclonales que tienen utilidad teraputica en muchas enfermedades como el cncer, el rechazo de trasplantes de rganos, enfermedades autoinmunes y alrgicas.

Anticuerpos monoclonales usados en la clnica Anticuerpo monoclonal Antgeno Mecanismo de accin Indicaciones

Muromomab

CD3

Inmunosupresor; anergia y Tratamiento del rechazo apoptosis de linfocitos T tras agudo en trasplante su activacin

Abciximab

Gpllb/llla

Inhibe la agregacin plaquetaria

Antitrombtico en intervenciones coronarias y angioplsticas

Edrecolomab

EpCAM, ADCC, CDC CD20, ADCC, CDC

Inhibe receptores de factores Cncer colorrectal de crecimiento

Rituximab

Produce apoptosis

Linfoma no Hodgkin, Leucemia linftica crnica Leucemia linftica crnica, Linfoma no Hodgkin folicular, , artritis reumatoide y esclerosis mltiple Prevencin del rechazo agudo en trasplante de rin Prevencin del rechazo agudo en trasplante de rin. Cncer de mama metastsico Profilaxis enfermedad virus sincitial respiratorio en nios Enfermedad de Crohn, Artritis reumatoide, Espondilitis anquilopoytica

Ofatumumab

CD20

Produce apoptosis

Daclizumab

CD25

Inbibe la activacin de linfocitos T mediada por CD25 Inhibe la activacin de linfocitos T mediada por CD25 Inhibe la proliferacin de clulas tumorales mediada por ErbB2 y ADCC Inmunoterapia pasiva

Basiliximab

CD25

Trastuzumab

ErbB2/neu

Palivizumab

VSR protena F

Infliximab

TNF-alfa

Inhibe el efecto proinflamatorio de TNF-alfa

Getuzumab Alemtuzumab Ibritumomab

CD33 CD52 CD20

Efecto citotxico por dao al Leucemia mieloide aguda ADN y apoptosis ADCC, CDC Radioterapia, ADCC, CDC, apoptosis Leucemia linfoide crnica B Linfoma no Hodgkin

Adalimumab

TNF-alfa

Inhibe el efecto proinflamatorio de TNF-alfa Radioterapia, ADCC, CDC, apoptosis

Enfermedad de Crohn, Artritis reumatoide, Espondilitis anquilopoytica Linfoma no Hodgkin

Tositumomab

CD20

Omalizumab

IgE

Disminuye los niveles de IgE en circulacin, bloquea la Asma de origen alrgico unin a sus receptores Inhibe la adhesin de linfocitos T al endotelio y su activacin Bloquea la unin de EGF a su receptor en las clulas tumorales y su proliferacin ADCC, CDC Inhibe el efecto proangiognico del VEGF Inhibe el efecto proangiognico del VEGF

Efalizumab

CD11a

Psoriasis

Cetuximab

EGFR

Cncer colorrectal

Bevacizumab

VEGF

Cncer colorrectal Degeneracin macular asociada a la edad de tipo exudativo

Ranibizumab

VEGF

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