Estudio microbiolgico del tracto respiratorio inferior

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Introduccin Patognesis de las infecciones del tracto respiratorio inferior (TRI) Etiologa de las infecciones del TRI Coleccin de muestras del TRI Valor del frotis por Gram en secreciones del TRI Procesamiento de las muestras del TRI Procesamiento de las muestras del TRI Procesamiento de las muestras del TRI Evaluacin del cultivo bacteriano en infecciones del TRI Infecciones del TRI en pacientes inmunocomprometidos

Introduccin El cultivo de especmenes del tracto respiratorio inferior, puede resultar en el mayor esfuerzo innecesario que cualquier otro tipo de muestra Raymond Bartlett, M.D Medical Microbiology : Quality Cost and Clinical Relevance. 1974, Edit. John Wiley & Son, New York. Las palabras del Dr. Bartlett son tan ciertas hoy como hace tres dcadas. Las enormes dificultades de obtener muestras representativas del sitio de la infeccin, los problemas de contaminacin de las muestras, la determinacin segura del agente infeccioso responsable del proceso, el valor de stas muestras en el diagnstico de las enfermedades respiratorias e incluso el valor de la antibioticoterapia en su control, son solo algunos de los aspectos que en mi opinin, hacen del estudio de las muestras del tracto respiratorio inferior ( TRI ), la de mayor dificultad con la que se enfrenta el microbilogo. Las infecciones del TRI son una de las ms importantes causas de morbi-mortalidad, particularmente en nios y ancianos en el mundo. En ste sentido, la pneumona es la principal causa de infecciones en la comunidad y la tercera causa de enfermedades nosocomiales, detrs de las infecciones urinarias y de heridas. Debido a las caractersticas especiales de estos especimenes, se hace obligante una estandarizacin de los procesos diagnsticos, tal que la informacin generada por el laboratorio, constituya un elemento que aporte una utilidad clnica apropiada. Por lo anterior, ofrecemos a la consideracin de los colegas de la microbiologa el presente trabajo que pretende llenar ste cometido. Lic. Eric Caballero J Patognesis de las infecciones del tracto respiratorio inferior (TRI) Las dificultades en el aislamiento del agente etiolgico de las infecciones del TRI, son un reflejo de la extraordinariamente abundante y variada flora normal de la cavidad orofarngea. Esta cavidad puede tener un conteo de 10 a 10 UFC/ml. Son stos microorganismos precisamente los principales responsables de la mayora de las infecciones del TRI. Es por ello que los protocolos teraputicos deben estar dirigidos a combatir la infeccin y no la colonizacin o la contaminacin. Para muchos de los agentes de las neumonas purulentas, la colonizacin del tracto respiratorio superior es seguida por la migracin de los microorganismos a travs de la capa mucociliar de los bronquios hacia los pulmones. La aspiracin del contenido orofarngeo, desempea un papel importante en la patogenia de diversos tipos de neumona. Ayudados por la gravedad y con frecuencia por la prdida por parte del husped de algn mecanismo protector no especfico, los microorganismos alcanzan el tejido pulmonar donde se multiplican y atraen a las clulas efectoras. El conjunto de restos celulares y lquido contribuye a la prdida de la funcin pulmonar y en consecuencia a la patologa. Los agentes con cpsulas formadas por polisacridos como Pneumococos, Klebsiella, Haemophilus, ciertos S. aureus y Criptococos , parecen ser ms capaces de evadir la fagocitosis y, por lo tanto, de causar neumona en pacientes sin una inmunidad humoral adecuada que se manifieste a travs de anticuerpos especficos. La aspiracin de la flora colonizante dentro de los alveolos, es el principal mecanismo que inicia el proceso de la infeccin neumnica. Por lo general, antes de la aspiracin, se observan cambios en la flora bacteriana menos benigna, a especies ms invasivas o resistentes a los antibiticos, como ocurre con el S. pneumoniae o las Enterobactericeas. Hay consenso en afirmar que cualquiera invasin del rbol pulmonar, depende del balance entre los factores de virulencia, el tamao del inculo, de la especie aspirada, el estado del sistema inmune y la funcin respiratoria del paciente. Otros mecanismos de importancia en la patognesis lo constituyen en su orden el aspirado de aerosoles y la transferencia va hematgena de microorganismos a partir de un foco distante. Sin embargo, al igual que en otros procesos infecciosos, en la cadena de la infeccin neumnica se requiere un agente infeccioso, un nmero suficiente de ste, una puerta de entrada adecuada y un husped susceptible.

La colonizacin orofarngea se caracteriza por factores de riesgo entre los cuales estn: a) Acidosis b) Alcoholismo c) Antibioterapia d) Coma e) Diabetes f) Intubacin g) Sonda nasogstrica h) Leucopenia Una de las patologas que ha adquirido importancia a nivel del TRI, lo constituye la Fibrosis qustica, una enfermedad hereditaria caracterizada por una anomala de las glndulas que producen sudor y el moco. Es crnica, progresiva y generalmente mortal, que afecta principalmente al aparato respiratorio, el digestivo y reproductor. En stos casos, los agentes etiolgicos mayormente involucrados son el S .aureus, H. influenzae y la Pseudomona aeruginosa, sin dejar de mencionar a la B. cepacia complex y la S. maltophilia. Es interesante mencionar que las cepas de Ps. Aeruginosa, son en su mayora fenotipos altamente mucosos, los cuales en algunos casos son sugestivos de la enfermedad. La patognesis de las infecciones del TRI se caracterizan por los diversos mecanismos del agente invasor para burlar las defensas del husped, entre ellas : Mecanismos para Evitar la Fagocitosis : -- Produccin de Cpsula ( S .pnumoniae, H. capsulatum, K.pneumoniae, N. meningitidis ). -- Produccin de Toxinas ( Leucocidinas y Citotoxinas por S. aureus. ). -- Parsitos y Hongos son ms grandes que los Fagocitos. -- Replicacin dentro de la clula ( Virus y Chlamydias son intracelulares obligados ). Mecanismos para Sobrevivir dentro del Fagocito : -- Inhibicin de la fusin del Lisosoma con el Fagosoma. ( Ej. T. Gondii, Aspergillus sp ). -- Escape del Fagosoma. (M. leprae, T. cruzi). -- Resistencia a la muerte en el Fagolisosoma. ( Ej. M. tuberculosis, Nocardias ). -- Crecimiento en la Clula Fagoctica. (M. tuberculosis, Legionella, Citomegalovirus). 2.1 Mecanismos de defensa del husped Paralelo al inicio del proceso infeccioso, el husped lleva a cabo una serie de medidas de defensa, entre las cuales se puede anotar: Filtracin: Vello nasal, barreras anatmicas. Saliva Complemento Tos Reflejo epigltico Interferencia bacteriana Flora normal Sistema Mucociliar Macrfagos Alveolares Complementos Fluidos Alveolares - Defensinas, Lisosimas. Inmunidad Celular - Clulas B y T

Etiologa de las infecciones del TRI Las infecciones del tracto respiratorio inferior constituyen la mayor causa de muerte en el mundo y son las infecciones ms frecuentes tanto en la Medicina extrahospitalaria como intrahospitalaria. Constituyen tambin, especialmente la neumona, las infecciones que con mayor frecuencia son derivadas desde la atencin primaria al medio hospitalario. Hay tres microorganismos responsables del 75 % de las reagudizaciones: H. influenzae, S. pneumoniae y M. catarrhalis. El ms frecuente es H. influenzae (alrededor del 50 por ciento de los casos). Las Enterobacterias y Ps. aeruginosa son menos importantes en nmero, aunque suelen producir cuadros ms graves. Los principales procesos infecciosos del TRI incluyen: a) Pneumona (Pneumonitis) Inflamacin del espacio y del parnquima pulmonar. (Ej. S. pneumoniae y S. aureus). b) Bronquitis Inflamacin de las vas areas medias. (Ej. S .pneumoniae, H .influenzae, M. catarrhalis, Enterobacterias). c) Bronquiestasia Dilatacin excesiva y dao en los bronquios. (Ej. Fibrosis qustica). d) Bronquiolitis Proceso infeccioso que provoca inflamacin de los bronquios.

Las dificultades en el diagnstico de la infecciones del TRI se ven comprometidas entre otras causas por : El gran nmero de microorganismos capaces de causar enfermedad neumnica. Espectro clnico asociado con varios de estos agentes. Los procedimientos menos invasivos para el diagnstico definitivo, son comnmente contaminados con flora normal o no hay crecimiento del agente etiolgico. Los procedimientos invasivos (aspirado transtraqueal, biopsia pulmonar) son poco utilizados. En muchos casos, la edad del paciente puede ayudar a establecer los potenciales agentes etiolgicos como se describe: EDAD Neonatos (0-1 mes) Infantes (1-6 meses) Nios (6 meses-5 aos) Nios (5-15 aos) Adultos jvenes (16-30) Adultos mayores POSIBLE MICROORGANISMO Escherichia coli, Group B Streptococcus Chlamydia trachomatis , Virus sincytial Respiratorio Virus sincytial respiratorio, Virus Parainfluenza Mycoplasma pneumoniae , Influenza Virus Typo A Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae

Los potenciales agentes etiolgicos segn los procesos infecciosos son : PNEUMONIA AGUDA S. pneumoniae H. influenzae S. aureus M. catarrhalis L. pneumophila M. pneumoniae Pseudomona sp H. capsulatum C. neoformans

Ch. pneumoniae BRONQUITIS H. influenzae H. parainfluenzae S. pneumoniae M. catarrhalis Klebsiella sp C. pneumoniae B. pertussis M. pneumoniae Pneumonia por Aspiracin Peptoestreptococos sp Fusobacterium sp Enterobacteriaceas Pseudomona sp Bacterias relacionadas a pneumonia por aspiracin intrahospitalaria. Acinetobacter sp / S. maltophilia Abscesos Pulmonares Peptoestreptococos sp Fusobacterium sp Bacteroides fragilis S. aureus E. coli K. pneumoniae Ps. aeruginosa S. pneumoniae. Neumona nosocomial S. aureus ( MRSA ) S. pneumoniae Pseudomona aeruginosa Serratia marcescens Acinetobacter baumannii . 3.1 Neumona adquirida en la comunidad: La neumona adquirida en la comunidad constituye una causa muy importante de morbilidad y mortalidad. En los pases industrializados, la neumona adquirida en la comunidad es la primera causa infecciosa de muerte y la sexta de mortalidad general. El nmero de personas que fallecen cada ao en el mundo como consecuencia de esta infeccin se cifra en aproximadamente 5 millones.Streptococcus pneumonae es el agente causal ms frecuente de la neumona adquirida en la comunidad , mientras que la frecuencia relativa de los dems agentes causales es variable, dependiendo del rea geogrfica, la poblacin estudiada y la metodologa diagnstica aplicada. En lneas generales Mycoplasma pneumoniae y los virus respiratorios son ms prevalentes en las personas jvenes, mientras que la neumona aspirativa es ms frecuente entre la poblacin anciana. Por su parte, Legonella pneumophila suele afectar a pacientes adultos y Haemopliflus influenzae a adultos y ancianos con enfermedad pulmonar obstructiva crnica. 3.2 Infecciones del TRI en nios : Las infecciones del TRI son tambin de gran importancia en nios. Cada ao la neumona causa entre 750,000 1.2 millones de muertes en neonatos en el mundo. La Organizacin Mundial de la Salud estima que las infecciones del TRI en nios ( 60% dividido entre S. pneumoniae/H. influenzae ) causa 4.3 millones de nios muertos en el mundo. Los microorganismos involucrados son : Virus Virus de la influenza A Virus Syncytial Respiratorio (RSV) Human Metapneumovirus Varicella-Zoster Virus (VZV - chicken pox) Bacterias S. Pneumoniae H. Influenzae S. Aureus Klebsiella Pneumoniae Enterobacterias ( E. Coli ) Anaerobios Organismos atpicos como Mycoplasma, Legionella Pneumophila, Chlamydia sp., Coxiella Burnetii 3.3 Neumona intrahospitalaria:

La mayora de los estudios consideran la neumona nosocomial como la segunda causa de las infecciones adquiridas en el hospital. Corresponde a un 10-20% de stas y a 5-10 casos/1000 admisiones/ao. La neumona nosocomial se adquiere a travs de tres mecanismos: La aspiracin, la inhalacin de aerosoles y la diseminacin hematgena a partir de otro foco de sepsis. Sin embargo, la microaspiracin de bacterias que colonizan la orofaringe y/o estn presentes en el estmago se considera el mecanismo ms importante. La flora orofarngea normal est formada principalmente por cocos grampositivos, sin embargo, la colonizacin de la orofaringe por bacilos gramnegativos se observa en menos del 10% de los individuos sanos, aumenta con hospitalizaciones prolongadas y alcanza el 60-75% en enfermos crticos ingresados en unidades especiales. Se define como neumona intrahospitalaria a la infeccin de las vas respiratorias bajas que es adquirida por un paciente, y no exista ni estaba incubndose a su ingreso al hospital. Para su inclusin se requiere de 72 horas desde el ingreso al hospital. Hay distintos criterios diagnsticos para la definicin de neumonas: pacientes mayores de 12 meses, menores de 12 meses y neumonas asociadas a la utilizacin de recursos mecnicos. Las neumonas asociadas a la utilizacin de recursos mecnicos se dividen en tempranas y tardas. La Neumona Temprana es la que se produce despus de las 48 a 72 hs. posteriores a la intubacin de la trquea y generalmente es el resultado de la aspiracin producida en el proceso de intubacin. La Neumona Tarda es la que ocurre despus de las 72 horas post-intubacin endotraqueal y es generalmente causada por grmenes resistentes tales como el Staphylococcus aureus meticilina resistente, Acinetobacter complex y Pseudomona sp, aunque los agentes etiolgicos pueden ser diferentes segn la institucin y la poblacin . En gran parte las infecciones del TRI en pacientes hospitalizados son debidas especialmente a mtodos invasivos: Intubacin de la trquea o nasogstrica. Inhalacin de aerosoles en respiradores o anestsicos. Nebulizadores contaminados 3.4 Infecciones crnicas del TRI: El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiolgico ms frecuente de infecciones crnicas del tracto respiratorio inferior, pero las micosis y las infecciones pleuropulmonares por anaerobios tambin pueden seguir un curso subagudo o crnico. Adems del M. tuberculosis, otras mycobacterias pueden causar esta enfermedad, particularmente M. avium-intracelulare y M. kansasii. Actinomyces y Nocardia tambin estn asociados con una aparicin gradual de sntomas en las infecciones crnicas. La patogenia de muchas de las infecciones causadas por agentes que producen enfermedades crnicas del tracto respiratorio inferior est caracterizada por alguna falla en la inmunidad mediada por clulas del husped o por la capacidad de estos agentes para evitar ser destruidos por los mecanismos de inmunidad mediada por clulas. Esta capacidad puede consistir en un efecto sobre los macrfagos debido al enmascaramiento de antgenos extraos, tamao pequeo u otro factor que les permita vivir en los tejidos del husped sin estimular una reaccin local inmediata. Coleccin de muestras del TRI Respecto a la coleccin de las muestras del TRI, recomendamos la Gua Recoleccin y Transporte de Muestras microbiolgicas que hemos escrito en conjunto con el Dr. Silvio Vega, en la que se detalla los aspectos ms importantes a tener en cuenta en esta fase del proceso. Sin embargo, hacemos un resumen de los aspectos relevantes. MUESTRAS ACEPTABLES Esputo. Aspirado traqueal/ transtraqueal. Lavado bronquial. Lavado bronquioalveolar. Cepillado bronquial. Biopsia bronquial. Aspirado de pulmn. Biopsia de pulmn. MUESTRAS INACEPTABLES Saliva. Esputo con ms de 24 h de colectado. Hisopo. La muestra de esputo debe ser transportada al laboratorio a la brevedad posible y procesada inmediatamente a su arribo. ( Ref. J. Clin. Microb, 2002, 40:3115-3120 ). Muchos autores han demostrado que cuando la muestra es demorada antes de la siembra, hay prdida de los patgenos de importancia ( Ref. Am.Rev. Dis. 125:436-442 ) y hay sobrecrecimiento de flora colonizante normal ( Ref. Appl. Microbiol.18:213-220 ). CONSIDERACIONES GENERALES Si hay demora en el procesamiento, refrigere a 2-8 C. Procesar todas las muestras en la cabina de seguridad. Utilice guantes y mascarillas. Las muestras colectadas con procedimientos invasivos, deben ser manejadas como muestras valiosas y procesadas rpidamente. Solo las muestras apropiadamente colectadas con mtodos invasivos y transportadas anaerobicamente, deben ser cultivadas por anaerobios. Esto incluye: Aspirado transtraqueal, biopsia bronquial y cepillado bronquial. a) Esputo:

En primero lugar hay que reconocer que el cultivo de esputo por expectoracin no es la muestra ms apropiada para investigar infeccin del TRI, ya que el mismo est desacreditado, no aporta resultados definitivos y en muchos casos, son contradictorios. Muchos autores argumentan que el cultivo de esputo es un estndar imperfecto, el cual est comprometido por muchas limitaciones que afectan su especificidad y sensibilidad. Hay estudios que concluyen que solo el 60% de los pacientes con neumona producen esputo y de stos ms del 50% tienen cultivo de esputo negativo.( Ref. Am. Rev. Respir. Dis. 103:845-848 ). Sin embargo, por ser una muestra frecuentemente solicitada que constituye una pesada carga para el laboratorio, se hacen las indicaciones respecto a la coleccin de sta muestra. El paciente debe lavar sus dientes y boca con suero estril inmediatamente antes de obtener la muestra, as se disminuye el nmero de bacterias contaminantes de la orofaringe. El esputo debera obtenerse a primera hora de la maana (para recoger todo el conjunto de las secreciones nocturnas, en las cuales estarn ms concentradas en los microorganismos patgenos responsables del proceso infeccioso) Si la produccin de esputo es escasa se inducir la expectoracin con nebulizaciones de solucin salina. Es relevante indicar que los procedimientos invasivos que a continuacin se detallan, estn indicados en casos de: a) Neumona grave que no a respondido al tratamiento inicial b) En husped inmunocomprometido c ) Pacientes que no son capaces de exportar a pesar de la hidratacin d) Cuando se sospecha una infeccin por anaerobios donde no es til el cultivo por expectoracin e) En la neumona por aspiracin o intrahospitalaria b) Aspiracin transtraqueal: Los pacientes traqueostomizados son incapaces de producir un esputo en la forma normal, pero se puede recoger fcilmente las secreciones del tracto respiratorio inferior en una trampa de Lukens. Estas muestras (denominadas aspirados por traqueotomia o aspirados traqueales) deben ser tratadas como un esputo. Los pacientes con traqueotomias son colonizados rpidamente con bacilos gramnegativos y otros patgenos nosocomiales. Esta colonizacin per se no tiene relevancia clnica, pero estos microorganismos pueden ser aspirados y causar neumona. Por lo tanto, tratar de establecer el agente etiolgico en estos pacientes causa verdadera confusin a los microbilogos y clnicos. Metodologa: Tras anestesiar la piel de la garganta, se introduce en la trquea una aguja y se aspiran las secreciones a travs de un catter. Cualquier microorganismo aislado a partir de esta muestra se considera potencial agente causal de la neumona. c) Muestras por broncoscopia Indicaciones Diagnsticas ms comunes: o Tos con sangre. o Tos persistente que no responde a tratamiento convencional. o Anormalidades en la radiografa del trax. o Cuando se necesita analizar las secreciones y tejidos del pulmn. o Indicaciones Teraputicas: Colocacin de prtesis endobronquiales. Remocin de cuerpo extrao en vas areas. Colocacin de catter, etc. Metodologa: Colecte el espcimen va broncoscopio. El cepillado bronquial es preferido al lavado, ya que el lavado es ms diluido. Anestesie el rea con Lidocaina al 2% preferiblemente. Haga que el paciente inhale por la boca y exhale por la nariz. Lubrique ambas fosas nasales con Xylocaina en jalea. El paciente pudiera necesitar Demerol intravenoso para tolerar el broncoscopio. Lubrique el broncoscopio con Xylocaina al 2% en jalea, evitando la punta distal. Introduzca el broncoscopio intranasalmente. d) Lavado bronquial : Consiste en la instalacin y aspiracin secuencial de solucin fisiolgica (100 a 200 ml. ) a travs del broncoscopio, obtenindose un gran volumen de muestra.La primera fraccin es la mas contaminada y puede descartarse o bien se puede utilizar para cultivo de Mycobacterias, Legionella spp y micosis sistmica, ya que sta tiene el mismo valor que el lavado bronquial o las secreciones traqueales para los grmenes habituales. Sujete una trampa de Lukens al broncoscopio. Introduzca 10 ml de solucin salina no bacteriosttica a travs del canal abierto. Succione el material afuera. Selle el tubo de la trampa y enve al laboratorio. e) Cepillado bronquial Consiste de un cepillo dentro de una doble cnula, interna y externa, para evitar la contaminacin con secreciones orofarngeas a medida que avanza el dispositivo a travs del canal de succin del fibrobroncoscopio.

Una vez ubicado ste en el sitio elegido, se avanza la cnula interna y por ltimo el cepillo y se toma la muestra (0.001 a 0.01 ml), luego de lo cual se invierte el proceso. La muestra se coloca en 1 ml de solucin salina. Utilice un broncoscopio de doble lumen. Inserte la brocha citolgica dentro del canal abierto del broncoscopio y avance. Empuje la brocha fuera de su protector y realice el cepillado. Jale la brocha hacia dentro de su protector y remueva la unidad de brocha completa. La brocha se seca al aire rpidamente lo cual es negativo para el cultivo. Coloque la brocha dentro del tubo de transporte conteniendo salina o Ringers lactato. Enve al laboratorio inmediatamente. Si desea estudio por micobacterias, puede colocar la brocha dentro de un tubo conteniendo 10 ml de caldo de Middlebrook 7H9. f) Lavado bronquioalveolar Sujete una trampa de espcimen de 70 ml al broncoscopio. Introduzca 100 ml de salina no bacteriosttica a travs del canal en pociones de 20 ml. Despus de la tercera o cuarta inyeccin de salina, reemplace la trampa de 70 ml por una de 40 ml. Enve las trampas al laboratorio 10 ml de lquido de cada una en tubos estriles. COMENTARIO: El mayor problema con el lavado bronquial, es la inhibicin de las bacterias por la solucin anestsica. El cepillado bronquial solamente obtiene 0.001 ml de muestra, por lo que la brocha debe ser rpidamente colocada en el lquido de transporte para evitar la desecacin. El lavado bronquioalveolar es preferido especialmente cuando el cultivo de esputo no ha sido satisfactorio. El anlisis cuantitativo de la muestra por lavado, es clnicamente ms relevante que el anlisis de la muestra de esputo. El desarrollo de catteres de doble lumen con tapn biodegradable evita la contaminacin y permite obtener muestras de mejor calidad. El lavado bronquioalveolar y muestras por brocha bronquial es recomendada en pacientes con sospecha de neumona asociada a ventiladores por cultivo cuantitativo, para evaluar ptimamente el significado del organismo recuperado. g) Hemocultivos: Adems de muestras de secreciones respiratorias deberan extraerse hemocultivos de todos los pacientes con sospecha de infeccin del TRI, ya que en un porcentaje no despreciable de casos se consigue aislar el agente causal de la neumona a partir de la sangre del paciente. Si se sospechan infecciones pulmonares causadas por virus, hongos o parsitos deben utilizarse tcnicas especiales para recuperar el agente etiolgico. Valor del frotis por Gram en secreciones del TRI La cantidad y diversidad de flora colonizante en la cavidad orofarngea y el rbol traqueo-bronquial, constituye el gran reto para la interpretacin y reporte del frotis por Gram. La mayora de la literatura soporta el uso clnico del frotis por Gram, incluso con mayor utilidad que el cultivo del TRI .Numerosos estudio han mostrado que el frotis de esputo es un indicador ms sensible y especfico de neumona pneumoccica y provee informacin til para iniciar la terapia. Un estudios prospectivo de neumona de la comunidad, muestra que el frotis por Gram tiene una sensibilidad del 57% y especificidad del 97% para el diagnstico de S. pneumoniae, y sensibilidad del 82% y especificidad del 99% para la neumona por H. influenzae Es importante tener presente, que en al caso de aspirado traqueal de ventilacin mecnica obtenida de infantes recin nacidos de bajo peso, el aspirado purulento correlaciona ms con la prolongada intubacin endotraqueal, que con el desarrollo de sntomas respiratorios ( Ref. J. Perinatol. 21:376-381 ). Por lo anterior, recomendamos firmemente el uso rutinario del frotis por Gram en toda muestra de esputo o secrecin endotraqueal, con el fin de calificar la utilidad de la muestra. A pesar de la existencia de mltiples formas de informar el frotis, recomendamos la utilizacin del Indice de Bartlett para ste objetivo. Se debe tener presente que la presencia de clulas cilndricas ciliadas o clulas caliciformes del epitelio bronquial en muestras obtenidas por broncoscopia tambin indican un espcimen profundo y apto para cultivo. EVALUACION DEL FROTIS POR GRAM g) Utilice objetivo de 10x para escoger el campo de estudio. h) Concntrece en al rea con leucocitos. i) Evite zonas de contaminacin orofarngea. j) Haga conteo semicuantitativo de las clulas ( Leucocitos y clulas epiteliales ). k) Haga conteo semicuantitativo de los organismos. a) Si un organismo predomina en reas de inflamacin, haga conteo semicuantitativo y reporte. b) Si otros tipos de bacterias estn presente, haga conteo semicuantitativo del predominante y reporte. c) Si hay diversidad de organismos y no hay organismos predominantes : Haga conteo semicuantitativo y reporte: Mezcla de morfotipos bacterianos . d) Si no hay microorganismos: Reportar No se observ microorganismos. 5.1 Indice de Bartlett: El ndice de Bartlett es til para valorar la calidad de la muestra de esputo. Cuente el nmero de leucocitos y de clulas epiteliales escamosas observadas en no menos de 10 campos del microscopio (100x). VALORACION: a) Leucocitos: 10 a 25 leucocitos = 1 +

> 25 leucocitos = 2 + b) Clulas epiteliales escamosas: 10 a 25 clulas epiteliales = - 1 > 25 clulas epiteliales = - 2 CRITERIO DE EVALUACION: El ndice de Bartlett se obtiene al efectuar la suma algebraica del total de leucocitos Vs clulas epiteliales presentes. Cualquier valor positivo es vlido para aceptar la muestra como apropiada para cultivo. 5.1.1 Valoracin del ndice de Bartlett: MUESTRA RECHAZADA MAS DE 10 CELULAS EPITELIALES ESCAMOSAS POR CAMPO (100x)

Reportar: Muestra no representativa del tracto respiratorio inferior. Enviar nueva muestra TINCION DE GRAM DE ESPUTO MOSTRANDO CELULAS EPITELIALES ESCAMOSAS, AUSENCIA DE CELULAS INFLAMATORIAS Y FLORA BACTERIANA MULTIPLE. ESTA MUESTRA NO ES INTERPRETABLE

ESPUTO DE NEUMONIA POR PNEUMOCOCOS TINCION DE GRAM DE ESPUTO ( 100x ) MOSTRANDO ABUNDANTES CELULAS INFLAMATORIAS Y DIPLOCOCOS GRAMPOSITIVOS INDICE DE BARTLETT: +2

Procesamiento de las muestras del TRI En primer lugar, debe descartarse toda muestra que macroscpicamente corresponda a saliva. Una tincin de Gram debe preceder en todo caso al cultivo, con el fin de asegurar la calidad de la muestra. Solo deben procesarse aquellas muestras con menos de 25 clulas epiteliales por campo de 100x y ms de 25 leucocitos polimorfonucleares por campo, en base al Indice de Bartlett. Las tcnicas de cultivo de muestras deben orientarse al aislamiento e identificacin de S. pnumoniae, S. aureus, Ps. aeruginosa y Enterobacteriaceas. Se efectuar siembra de medios de cultivos slidos tales como el agar sangre al 5% , agar chocolate y McConkey, los cuales se incubarn a 35.5 C por 24 hora . Cuando se sospecha microorganismos especficos tales como Legionella ( Causa de pneumona adquirida en la comunidad ), Mycobacterias o M. pneumoniae ( Principal causa de pneumona atpica ), se utilizarn los medios especiales para este fin (BCYE, Lowenstein-Jensen, etc ). Debido a que la muestra es altamente contaminada con flora normal respiratoria, ningn medio de cultivo lquido debe ser utilizado en muestras de esputo o secrecin endotraqueal, porque falsean la visin de flora mayoritaria. ( Ref. ASMCumitech 7B , LRTI, pag. 8, June 2004 ). Inocule los medios en el orden correcto. El menos selectivo primero ( A.S >> A.Ch >> Mc > otros selectivos ). En las muestras por expectoracin, no deben estudiarse los microorganismos anaerbicos, los cuales son una poblacin predominante de la flora de la cavidad oral. La capacidad del laboratorio de obtener un diagnstico microbiolgico depende de varios factores: Del tipo de muestra: las obtenidas por procedimientos invasivos (BAL, CPE, y aspirado endotraqueal) son mejores que la expectoracin, que est contaminada con flora bucal y no siempre es representativa de la infeccin pulmonar. De la calidad de la muestra: que provenga realmente del tracto respiratorio inferior con escasa contaminacin con flora bucal, lo que es especialmente importante en expectoracin. Del agente etiolgico: las neumonas causadas por bacterias aerbicas presentan mayor porcentaje de confirmacin que aquellas producidas por bacterias fastidiosas o que no se desarrollan en medios de cultivo convencionales y que requieren mtodos serolgicos para el diagnstico: Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y Legionella pneumophila. Del transporte rpido y oportuno al laboratorio: Las muestra de expectoracin debe ser sembrada en los medios de cultivos antes de dos horas de obtenida, de lo contrario debe utilizarse medios de transporte. De la capacidad del laboratorio para reconocer una buena muestra y de establecer criterios de rechazo, cuando la calidad no es aceptable. 6.1 Procedimiento de Lavado bronquioalveolar ( BAL) y Cepillado bronquial protegido ( CEP) :

CULTIVO CUANTITATIVO DE BROCHAS DE BRONCOSCOPIA PROTEGIDA Cuente el nmero de colonias por plato y multiplique por el factor de dilucin ( 100 1000 ) COLONIAS POR PLATO CONTEO DE COLONIAS (UFC/ML) < 10 1000 10 a 100 1000 a 10000 100 a 1000 10000 a 100000 > 1000 > 100000

Conteo de >10 /ml es significativo >> 10 /ml muestra INTERPRETACION BROCHA BRONQUIAL PROTEGIDA Con respecto al examen directo es fundamental que el porcentaje de clulas epiteliales escamosas sea < 1%, contando por lo menos 200-300 elementos entre macrfagos, clulas epiteliales escamosas y neutrfilos. Si bien existe consenso internacional para considerar a 10 ufc/ml como punto de corte, algunos autores han tomado los valores de 10 de 10 ufc/ml. CRITERIOS DEL INFORME BROCHA BRONQUIAL PROTEGIDA 1) Recuentos por arriba del punto de corte (10 10 ufc/ml respectivamente) y respuesta inflamatoria importante (>10 neutrfilos/1000x) con /sin bacterias en el examen directo a) Creciminento de un microorganismo: Tipificacin y antibiograma b) Crecimiento de dos o tres microorganismos: Tipificacin y antibiograma de cada uno, informe del recuento individual y del Indice Bacteriano. 2) Recuentos "Borderline" (10 y 10 ufc/ml ) a) Con respuesta inflamatoria: Tipificacin y antibiograma del o los microorganismos. b) Sin respuesta inflamatoria: Probable contaminacin. (quedan excludos de esta consideracin los pacientes neutropnicos). Evaluar factores que afectan los recuentos bacterianos, especialmente el tratamiento antibitico instaurado dentro de las 24 horas de realizada la fibrobroncoscopia. Repetir muestra. 3) Recuentos bajos (10 y <10 ufc/ml respectivamente) con o sin respuesta inflamatoria. a) Cultivo negativo NOTA: Puede procesarse por anaerobios muestras colectadas por mtodos invasivos como Aspirado Transtraqueal, Biopsia Bronquial y Brocha Bronquial protegida. No son aceptable para cultivo por anaerobios el Lavado Bronquial y Brocha no protegida. ( Ref. Essential Procedures for Clinical Microbiology. H. Isenberg A.S.M Press ). 6.1 Mtodo del Mount Sinai Hospital en lavado bronquioalveolar (BAL ) : Otro mtodo apropiado para evaluar stas muestras es el utilizado por el hospital de Mount Sinai en Canad. INDICACIONES: Util cuando el esputo falla en Identificar al agente etiolgico responsable de la Neumona o si el paciente no puede producir esputo. MUESTRA: 15 a 30 Ml. Mantener a 4 C si hay demora. PROCEDIMIENTO: 1. Centrifuge a 3,500 rpm x 10 Mts. 2. Remover el sobrenadante GRAM: Reporte pus, organismos y si hay flora comensal. CULTIVO: Sembrar en Agar sangre y McConkey X 48 h a 35.5 C. REPORTE: Negativo: Flora Comensal o no crecimiento. Positivo: Cuantifique todo aislamiento significativo y reporte con su sensibilidad. 6.3 Mtodo del Mount Sinai Hospital para Brocha Bronquial Protegida ( CEP ) INDICACIONES: Obtener muestra libre de contaminacin orofarngea. MUESTRA: Colocar la brocha en un tubo estril con rosca y 1 Ml de Lactato de Ringer. Mantener a 4 C. PROCEDIMIENTO: Procesar rpidamente. Mezcle vigorosamente el tubo. Siembre 0.01 Ml en A.S con un asa calibrada ( Ej. de color azul utilizada en urocultivos ). Incubar en atmsfera de CO2 por 48h a 35.5 C. FROTIS: No procede. REPORTE: Identifique ,cuente y haga sensibilidad de las colonias de cualquier potencial agente etiolgico, segn su nmero : 6 Conteos de > 1 x 10 L ( > 100/ml ) es significativo. Es decir ms de 10 colonias en el plato primario utilizando un asa de 0.01 ml. Nota: No procesar brochas recibidas secas o con mucho lquido. FALSOS NEGATIVOS y POSITIVOS EN BAL y CEP FALSOS NEGATIVOS Terapia antibitica. Incorrecta localizacin del broncoscopio. Estadios tempranos de la infeccin. Pobre retorno del BAL en pacientes con vas colapsadas. Retardo en el procesamiento. Errores metodolgicos al realizar la dilucin o procedimientos inapropiados. FALSOS POSITIVOS Succin de secreciones purulentas a medida que el fibrobroncoscopio avanza. Anormalidades anatmicas. Alta presin en las vas areas.

UTILIDAD DE DISTINTAS TECNICAS BRONCOSCOPICA

Nota : Escala : 1 a 3 6.4 Estudios serolgicos de infecciones del TRI: Los estudios de serolgicos son generalmente reservados para patgeno anormales incluyendo Micoplasma pneumoniae , Chlamydia pneumoniae y Legionella pneumophila, entre otros, que son difciles de cultivar. Las contribuciones relativas de estos patgenos a las infecciones adquiridas en la comunidad, varan dependiendo de la poblacin estudiada y de los mtodos de diagnstico usados. El diagnstico de las infecciones causadas por estos patgeno son particularmente problemticos, porque la presentacin clnica se puede confundir con una variedad de otros agentes infecciosos, mientras que es poco sensible o lenta y requiere tcnicas especializadas de cultivo. La prueba del antgeno de Legionella en orina, se debe realizar en casos de sospecha de la enfermedad de los Legionarios ( Paciente de ms de 40 aos, inmunocomprometido, o que no responde a la terapia antibitica con - lactmicos ) o si el paciente est presente durante un brote de la enfermedad de Legionarios. Tiene una sensibilidad del 70 al 90% y especificidad de > 99%. Esta prueba del antgeno en orina se utiliza como prueba para Legionella serogrupo 1, que se considera el agente causante de aproximadamente el 70% de los casos divulgados de la neumona por Legionella en los Estados Unidos.Recientemente, un nuevo mtodo para la deteccin del antgeno del S. pneumoniae en la orina, un ensayo inmunocromatogrfico ( Binax, Inc., Portland, Maine ), est ahora disponible.Cuando se ha superado la dificultad tcnica de obtener una muestra representativa del proceso infeccioso en el TRI, el laboratorio de microbiologa moderno apunta hacia el uso de las tcnicas de biologa molecular, especialmente las sondas genticas, con el fin de hacer ms preciso el diagnstico etiolgico de stas infecciones. 6.5 Utilizacin de pruebas moleculares en infecciones del TRI : Las pruebas de la amplificacin del cido nucleico que han sido desarrolladas por muchos laboratorios, detectan ms rpidamente y con seguridad los patgenos que son difciles de cultivar. Un sistema comercial de PCR para la deteccin de las infecciones respiratorias por virus est disponible como prueba para el uso en la investigacin solamente. Asimismo, la deteccin por PCR de B. pertussis y B. parapertussis , ha demostrado ser ms rpida y por lo menos equivalente al cultivo, a condicin de que no se utilicen hisopos de alginato de calcio para la coleccin. Evaluacin del cultivo bacteriano en infecciones del TRI La identificacin rutinaria y sensibilidad a los antibiticos debe estar limitado a uno o dos microorganismos potencialmente patgenos de muestras de cultivo cuantitativos y de 2 a 3 microorganismos potencialmente patgenos para esputo o aspirado traqueal.La mayora de los patgenos en las infecciones de las vas bajas estn presentes en 6 concentraciones de 1 x 10 , lo cual est representado como crecimiento moderado o fuerte en los platos primarios.Se debe trabajar y reportar en base a un protocolo que evale la calidad de la muestra y los potenciales patgenos que crezcan en el cultivo.En base a esto, el ltimo ASM Cumitech del LRTI (ASM- Cumitech 7B, Lower Respiratory Tract Infections, June 2004) recomienda uno de tres protocolos para analizar stos especimenes por posibles patgenos presente. Los protocolos estn basados en la calidad de la muestra ( Gram ), la presencia de organismos y el nmero de patgenos presentes en el cultivo.En base a nuestras necesidades, recursos y metodologa de trabajo, recomendamos el Sistema Q-Score para ser utilizado en nuestro laboratorio. 7.1 Evaluacin del Cultivo Segn el Protocolo Q-Score System : El Sistema consiste en la realizacin previa de un frotis por Gram ( en campo de bajo poder ) en el que se enumera el nmero de clulas epiteliales y de leucocitos polimorfonucleares, en base a una graduacin : 1 = 1 a 9 clulas 2 = 10 a 24 clulas 3 = . 25 clulas. La combinacin de stos nmeros, determina el nmero mximo de microorganismos que deben ser trabajados y reportados en el cultivo del TRI.

El sistema es til para S. aureus, S. pyogenes, H. influenzae, Enterobactericeas, M. catarrhalis, N. meningitidis. Algunos autores respetados afirman que las levaduras no son consideradas potenciales patgenos, a menos que C. neoformans sea aislado.Las especies del gnero Candida rara vez dan lugar a micosis pulmonares invasoras, si no es en pacientes terminales, estando presentes en las secreciones respiratorias del 50% de la poblacin sana y en ms del 75% de los pacientes que han recibido antibioticoterapia. Est de ms decir que no se debe informar crecimiento de levaduras en muestras de esputo o secrecin endotraqueal, debidas casi en su totalidad a contaminacin con la flora oral. Infecciones del TRI en pacientes inmunocomprometidos Debido a que el sitio primario de destruccin tisular es el sistema inmune del husped, los pacientes con SIDA tienen numerosas infecciones entre las que se destacan la neumona, meningoencefalitis disfuncin neurolgica, candidiasis mucocutnea, mycobacterias, diarreas y otras infecciones sistmicas las cuales son producidas por diversos agentes : bacterias, hongos, virus y parsitos. El riesgo de neumona bacteriana no es igual en todas las personas infectadas con VIH. El factor de riesgo ms importante para la neumona bacteriana es el grado de inmunosupresin, lo cual es reflejado en la cuenta del linfocitos- T CD4.Las bacterias patgenas que provocan mayormente la neumona bacteriana en pacientes con SIDA son S. pneumoniae y H .influenzae, que toman ventaja de la disfuncin de las clulas B, mientras que los pacientes con mala funcin de las clulas T incrementan su susceptibilidad a infecciones por Salmonella sp. Se estima que entre el 10-35% de los pacientes con el virus HIV pueden desarrollar infeccin diseminada por H. capsulatum, si viven en reas endmicas como la nuestra.Todas las muestras del tracto respiratorio deben ser sembrados al menos en agar sangre y agar chocolate. En los casos de pacientes con SIDA, hay que tener presente la candidiasis oral ( CD4 T < 400 clulas por l ). El frotis por Gram de exudado farngeo solo es aceptable si el mismo tiene por objeto investigar la presencia de gran cantidad de hifas y levaduras en la cavidad oral de estos pacientes.Hay que tener cuidado al investigar por frotis directo Histoplasma capsulatum en esputo, ya que puede confundirse la levadura con la C. glabrata que coloniza la orofarnge y el cual es similar al H. capsulatum en tamao y forma. La pequea clula levaduriforme del H. capsulatum ( 2-4 m ), se observa dentro del citoplasma de macrfagos; sin embargo, C. glabrata raramente est dentro del citoplasma del macrfago. Es recomendable el cultivo o frotis directo por fluorescencia indirecta con anticuerpos. a) Investigacin por Pneumocystis carinii de aspirado traqueal o lavado bronquial: La biopsia de pulmn es el procedimiento a escoger. El esputo por expectoracin NO es recomendable para la investigacin de neumonitis por P. carinii en pacientes inmunocomprometidos por neoplasias, terapia de drogas y transplante de rganos. Sin embargo, en pacientes con SIDA los quistes estn presentes con frecuencia en gran cantidad en el esputo inducido. Se recomienda la preparacin del aspirado traqueal o lavado bronquial, mezclando igual volumen del lavado y de una solucin de Dithiothreitol ( Sputolysin: Calbiochem, La Jolla, Ca.). Dejar a temperatura ambiente por 15 minutos. Centrifugar a 2000 RPM por 15 minutos. Descartar el sobrenadante. El sedimento es colocado en 2 portaobjetos. Secar al aire. Fijar con formalina al 10% o metanol al 100% (Si se va a teir con tincin de methenamina de plata de Gomori). Si se va a teir con ortho-toluidina o con Giemsa, deje secar al aire por 30 minutos o por calor antes de teir. b) Biopsia de Pulmn: Es el mtodo convencional para el diagnstico de P. carinii y de otros hongos oportunistas, la cual est basada en el examen histopatolgico de tejido obtenido por biopsia.El examen del microorganismos incluye microscopa de fase, Giemsa, Orthotoluidina, Gram, Azul de Metileno, Carbolfucsina y Auramina-Rhodamina. El Wrigth y Naranja de Acridina requieren mucha experiencia para su interpretacin. La tincin de Giemsa tie el clsico quiste con ocho cuerpos intracitoplasmticos y tambin es til si hay levaduras. Las placas son investigadas en bajo poder (x100) para descarte y en alto poder (x430) para examinar estructuras sospechosas.El laboratorio debe tener presente la posibilidad de infeccin por Mycobacterias, lo cual esta muy bien explicado en las Normas de Procedimiento para Mycobacterias. Otra posibilidad es la infeccin por Nocardia, en la que se observan bacilos grampositivos con apariencia de filamentos. Para ellos se recomienda la tincin de Kinyoung o de Ziehl-Nelsen modificada para actynomicetos. La nocardia puede ser aislada de los medios tradicionales por hongos (Excepto los que utilizan antibiticos) y Mycobacterias. Sin embargo en agar sangre las colonias aparecen en 2 a 7 das. El diagnstico puede pasar inadvertido si los cultivos de esputo se desechan a las 48 horas, por lo que es conveniente que el clnico comunique al laboratorio la sospecha para una mejor evaluacin de la muestra. Otros patgenos de importancia son el Mycoplasma pneumoniae (Se requiere equipamiento especial para su cultivo) y hongos, especialmente H. capsulatum, C. neoformans, y Aspergillus sp, los cuales son causa frecuentes de neumonas en pacientes inmunocomprometidos.