LABORATORIO DE BIOQUMICA 502504 GUIA No 5.1- Cintica enzimtica (alfa-amilasa). I.

EL PROBLEMA Observar el efecto de la concentracin de sustrato y de enzima en la velocidad de reaccin enzimtica.

II. BSQUEDA DE INFORMACIN. Efecto de la concentracin de enzima y de sustrato en la velocidad de reaccin Ecuacin de Michaelis-Menten de la velocidad de reaccin enzimtica Significado de la velocidad mxima y de la constante de Michaelis.

III. MATERIALES Y REACTIVOS. Materiales por grupo. 20 tubos de ensayo un vaso de precipitados de 450ml dos vaso de precipitados de 250ml 5 pipetas graduadas de 5ml Una placa de calentamiento Una gradilla Un aro con nuez Una pinza para tubo de ensayo Un frasco lavador Un pipeteador

Materiales y reactivos generales. (volumnes calculados para 10 grupos de laboratorio) Solucin de almidn al 1% ( 2,0 L) Buffer pH 7,2 (1,0 L) Solucin de -amilasa cido 3,5-dinitrosaliclico ( 1 L) Agua destilada Dos baos de mara a 35C Espectrofotmetros y celdas Micropipetas de 0 a 100 lamdas y puntas Toallas de papel.

Departamento de Ciencias Bsicas

1/3

IV. PROCEDIMIENTO. 1. Efecto de la concentracin de sustrato: Tabla No 1: tubo B 1 2 3 4 5 6 Almidn (ml) 5,0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Buffer pH 7.2 (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Agua (ml) 5,1 9,5 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 Enzima (l) 0,0 100 100 100 100 100 100

En siete (7) tubos de ensayo adicionar las cantidades de solucin de almidn, buffer pH 7,2 y agua que se indican en la tabla No1. Colocar los tubos al bao mara a 35C por 5 minutos, luego agregue la cantidad de enzima especificada en la tabla, homogenice y deje incubando a la misma temperatura por 10min. Pasado el tiempo de incubacin, agregue 3 ml de la solucin del cido 3,5-dinitrosaliclico y coloque los tubos en un bao a ebullicin por 7minutos; retire y enfrelos cuidadosamente en un chorro de agua fra o en un bao de agua con hielo. Lea la absorbancia de cada uno de los tubos a 575nm. 2- Efecto de la concentracin de enzima: Tabla No 2: Tubo B 1 2 3 4 5 6 Almidn (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Buffer pH 7,2 (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Agua (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Enzima (L) 0,0 5 15 30 50 80 100

En siete (7) tubos de ensayo adicionar las cantidades de solucin de almidn, buffer pH 7,2 y agua que se indican en la tabla No1. Colocar los tubos al bao mara a 35C por 5 minutos, luego agregue la cantidad de enzima especificada en la tabla, homogenice y deje incubando a la misma temperatura por 10min. Pasado el tiempo de incubacin, agregue 3 ml de la solucin del cido 3,5-dinitrosaliclico, homogenice y coloque los tubos en un bao a ebullicin por 7minutos; retire y enfrelos cuidadosamente en un chorro de agua fra o en un bao de agua con hielo. Lea la absorbancia de cada uno de los tubos a 575nm.

Departamento de Ciencias Bsicas

2/3

V. PARA EL ANLISIS DE LA PRACTICA. Datos y observaciones debidamente tabulados Realice las grficas de velocidad vs concentracin de sustrato y de velocidad vs concentracin de enzima. Realice las grficas de Lineweaver-Burk y de Eodie-Hoffte para calcular la velocidad mxima de la reaccin y la constante de Michaelis.

VI. BIBLIOGRAFA. Bohinski, R. Bioqumica.1998. Quinta edicin, Pearson Educacin, Mxico Horton, R.H; Moran, L.A; Ochs, R.S y otros. Bioqumica, 1993. Prentice Hall Hispanoamericana S.A., Mxico. Plummer, D. Bioqumica Prctica, Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana, Mxico,1981.

Departamento de Ciencias Bsicas

3/3