Ameliorarea genetic a speciilor forestiere

Curs pentru nvmntul la distan

Conf. univ. dr. Liviu FRTI

Anul universitar: 2009-2010

UNIVERSITATEA TEFAN CEL MARE SUCEAVA FACULTATEA DE SILVICULTUR Departamentul de nvmnt la Distan

CUPRINS
I. CAPITOL INTRODUCTIV 1.1.Ameliorarea arborilor. Definiie i specificul disciplinei 1.2 Scurt istoric. II. OBIECTIVELE AMELIORRII ARBORILOR 2.1. Trsturi genetice specifice arborilor 2.2. Obiective cantitative. 2.3. Obiective calitative 2.3.1. Obiective calitative extrinseci. 2.3.2. Obiective calitative intrinseci. III. METODE CLASICE DE AMELIORARE FORESTIER 3.1. Selecia... 3.1.1. Principii fundamentale ale ameliorrii prin selecie 3.1.2. Formele seleciei artificiale.. 3.1.3. Determinarea efectelor seleciei... 3.1.4. Ameliorarea prin selecie etape generale.. 3.1.4.1. Ciclul de selecie i ciclul de ameliorare 3.1.4.2. Repetarea ciclurilor de selecie.. 3.1.5. Limitele seleciei.. 3.1.5.1. Limite genetice i biologice... 3.1.5.2. Limite metodologice.. 3.1.6. Strategii de selecie.. 3.1.7. Etapele principale ale unui program de selecie.. 3.1.7.1. Alegerea provenienelor. 3.1.7.2. Identificarea populaiilor semincere.. 3.1.7.3. Crearea populaiilor de producie plantaii semincere, plantaje. 3.2. Hibridarea.. 3.2.1. Principii generale privind aplicarea tehnicilor de hibridare 3.2.2. Criterii i modaliti concrete de hibridare.. 3.2.3. Particulariti ale reproducerii sexuate la arbori.. 3.2.3.1. Aspecte teoretice i practice asupra nfloririi i fructificaiei la arbori.. 3.2.3.2. Fenomenul de incompatibilitate interspecific n ameliorarea forestier.. 3.2.3.3. Explicarea fenomenului de androsterilitate.... IV. METODE MODERNE DE AMELIORARE FORESTIER 4.1. Mutageneza i implicaiile practice n ameliorarea forestier 4.1.1. Interesul obinerii de varieti poliploide la speciile forestiere 4.1.2. Obinerea de poliploizi la rinoase. 4.1.3. Obinerea de poliploizi la rinoase. 4.1.4. Mutaii genice i cromozomiale la speciile forestiere.. 4.2. Cultura in vitro de celule i esuturi vegetale. 4.2.1. Specificul activitii n cadrul unui laborator de culturi in vitro.. 4.2.2. Aclimatizarea n ser i repicajul n pepinier. 4.2.3. Rezultate obinute la speciile forestiere..

4.3. Inducerea i obinerea de haploizi. 4.3.1. Obinerea de haploizi prin androgenez. 4.3.2. Obinerea de haploizi prin ginogenez 4.3.3. Importana genetic a haploizilor 4.4. Cultura de embrioni sexuai in vitro. 4.5. Embriogeneza somatic i seminele artificiale 4.5.1. Embriogeneza somatic.. 4.5.2. Tehnologia obinerii seminelor artificiale.. 4.6. Obinerea i cultura protoplatilor. Hibridarea celular (somatic). 4.6.1. Obinerea de protoplati.. 4.6.2. Fuzionarea protoplatilor 4.7. Transferul de gene i obinerea plantelor transgenice.. 4.7.1. Obinerea pe cale biologic (indirect) a ADN-ului recombinant.. 4.7.2. Transferul de gene la arbori cu ajutorul plasmidelor Ti i Ri. 4.7.3. Transferul direct de gene (transfecie) 4.7.4. Strategii sens i antisens.. 4.7.5. Realizri n sectorul agricol.... 4.7.6. Realizri n silvicultur... 4.7.7. n loc de concluzii... V. PRINCIPIILE SILVICULTURII CLONALE 5.1. Tehnici de multiplicare vegetativ 5.1.1. Altoirea.... 5.1.2. Marcotajul 5.1.3. Drajonarea 5.1.4. Butirea.. 5.1.5. Micropropagarea.. 5.2. Utilizarea clonelor. 5.2.1. Modele de silvicultur clonal. 5.2.2. Tentative noi n silvicultura clonal 5.2.3. Riscuri i limite n silvicultura clonal VI. CONSERVAREA RESURSELOR GENETICE FORESTIERE (RGF) 6.1. Definiii, generaliti i grupe principale de resurse genetice la principalele specii forestiere... 6.2. Importana studiului diversitii biologice n perspectiva identificrii, conservrii i utilizrii durabile a RGF... 6.3. Conservarea germoplasmei forestiere 6.3.1. Conservarea in situ a RGF... 6.3.1.1. Crearea de parcuri i rezervaii naturale 6.3.1.2. Rezervaiile de semine 6.3.1.3. Interzicerea accesului i exploatrilor prefereniale. 6.3.2. Conservarea ex situ a RGF. 6.3.2.1. Arboretum-urile i parcurile dendrologice 6.3.2.2. Culturile comparative de proveniene i hibrizi... 6.3.2.3. Parcurile de clone. 6.3.2.4. Livezi de semine. 6.3.2.5. Bncile de gene.

I. CAPITOL INTRODUCTIV 1.1.Ameliorarea arborilor. Definiie i specificul disciplinei n sens strict genetic, ameliorarea este disciplina care se ocup cu mbuntirea calitilor plantelor cultivate i animalelor domestice, n sensul ameliorrii ereditii acestora n direcia dorit de ctre om (ameliorator). Dei mult vreme (secole sau chiar milenii) a fost realizat empiric (de baz fiind selecia fenotipic pentru nevoi imediate), ameliorarea plantelor i animalelor s-a impus treptat, cu timpul devenind o tiin, prin apariia lucrrilor fundamentale ale unor mari savani din domeniul tiinelor biologice precum Darwin, Mendel, Morgan, de Vries, Vavilov etc. n ceea ce privete ameliorarea speciilor forestiere trebuie inut cont de specificitatea biologic a arborilor n raport cu alte specii vegetale, de rolul lor structural i funcional fundamental n cadrul ecosistemelor forestiere i, nu n ultimul rnd, de faptul c sunt specii slbatice foarte vechi (gimnospermele au aprut nc din era primar, cu apogeu n mezozoic) ce posed sisteme genetice complexe i foarte greu de modificat (Stnescu, 1983). De asemenea, arborii sunt plante perene, policarpice, cu maturitate trzie, au cicluri de via foarte lungi i o lent manifestare fenotipic a caracterelor legate de structurile lor genetice. Dac mai adugm i dimensiunile mari pe care le realizeaz, precum i o foarte redus accesibilitate la flori i fructe, putem alctui un tablou complet privind dificultile ce apar pe linia ntreprinderii unor cercetri de genetic forestier teoretic i aplicat. Cu toate acestea, n ultimele decenii, cercetrile i activitile specifice domeniului ameliorrii forestiere s-au perfecionat i extins extrem de mult, astfel nct n tot mai multe ri exist i se deruleaz programe foarte complexe pe linia ameliorrii forestiere. n acest mod sunt atinse tematici vaste ce pornesc de la studiul provenienelor i selecia de populaii valoroase i se ncheie cu abordarea celor mai noi i performante tehnici moderne specifice biologiei i geneticii moleculare. 1.2 Scurt istoric nc din neolitic au existat preocupri de a se obine forme mai productive la plantele cultivate i, n acest sens, oamenii din acele timpuri au utilizat o form empiric de selecie i o depozitare a seminelor pentru scurte perioade de timp. Referitor la speciile de arbori, aceste preocupri au fost mult mai recente, cnd spre sfritul secolului al XVIII-lea s-au efectuat primele recoltri i utilizri de semine aparinnd celor mai frumoase exemplare de arbori, inclusiv pentru speciile forestiere exotice (Stnescu, 1983). La mijlocul secolului al XVIII-lea, Amiralitatea suedez recomanda recoltarea de semine de pin silvestru de la cei mai drepi arbori din nordul rii i cultivarea lor mai la sud pentru a constitui o surs de materie prim mai apropiat, n vederea construirii navelor (Lucu, 1998). Au trecut mai bine de dou secole de cnd Duhamel de Monceau, unul dintre fondatorii conceptului de silvicultur, a semnalat existena unor diferite rase n cadrul speciilor lemnoase i, la iniiativa sa, se nfiineaz n Frana primele plantaii comparative de pin silvestru cu semine din Rusia, Scoia sau Europa de sud.

Tot n Frana, ntre anii 1823-1850, Philippe Andre de Vilmorin a experimentat primele teste comparative de proveniene la pinul silvestru, avnd n vedere rectitudinea tulpinii, forma coroanei, dispoziiei ramurilor pe trunchi, etc. Cu aceast ocazie, n regiunea mpdurit a Parisului se realizeaz multe altoiri pe pin silvestru cu material biologic provenit din Corsica de Pinus laricio pentru aclimatizarea acestei specii n condiiile mai nordice specifice capitalei franceze. n a II-a jumtate a secolului XIX-lea, prin intensificarea studiilor asupra diferitelor rase de arbori, n mod deosebit n Germania, s-au putut pune bazele stabilirii unei taxonomii mai aproape de realitate a unor grupuri intraspecifice nceputul secolului XX a coincis cu redescoperirea legilor lui Mendel privind ereditatea i punerea bazelor teoriei mutaioniste de ctre Hugo de Vries. n domeniul forestier, o importan deosebit a avut-o Correns van Tschermak, crendu-se o adevrat efervescen i emulaie n rndul specialitilor forestieri care erau destul de dezamgii de recentele eecuri n ceea ce privete rezultatele unor vaste aciuni de rempdurire n Frana, Belgia sau Germania. Rezultatele mediocre obinute s-au datorat, n principal, utilizrii unui material seminal de origine incert sau de slab calitate, ca cel de larice de Alpi, pin silvestru din zona Haguenau (Frana) n Germania i, invers, material originar din Darmstadt (Germania) n Frana. Sensibilizarea specialitilor forestieri s-a manifestat i exprimat concret n cadrul primei reuniuni internaionale asupra originii materialului seminal de pin silvestru (1906) dar, mai ales, n cadrul Congresului internaional IUFRO (Uniunea internaional a instituiilor de cercetare forestier) de la Bruxelles (1910)(Nanson, 2005). O parte a populaiilor semincere actuale de pin silvestru i duglas din Belgia reprezint consecina direct i benefic a aciunilor ntreprinse n acea perioad. Dup primul rzboi mondial, urmeaz o perioad de regres n genetica forestier i, din pcate, muli dintre cei angrenai n domeniu nu au dat atenia cuvenit greelilor i eecurilor anterioare. n consecin, prin neglijarea provenienei seminelor, a crescut numrul de populaii semincere mediocre, cu exemplare neperformante ce prezentau ramuri groase i care erau devastate adesea de boli produse de Rhabdocline pseudotsugae sau Phaeocryptopus gaeumannii (Nanson, 2005). Cu toate acestea, n unele ri din Europa Central i de Vest au fost create bazele privind crearea unui cadru legislativ i instituional pe linia cercetrii agricole, n general, precum i a celei forestiere, n special. Astfel, n Belgia a luat fiin, n anul 1929, Staiunea de Cercetri a Apelor i Pdurilor, cu sediul la Groenendaal, lng Bruxelles, cu scopul principal de a reda pieii semine cunoscute ca provenien i de bun calitate. De asemenea, Delevoy a nceput instalarea experienelor comparative de proveniene. n Danemarca, Syrach Larsen a creat, cu adevrat, o disciplina autonom de genetic i ameliorare a arborilor forestieri, iar n 1926 a efectuat prima cartare seminologic i o sistematizare a populaiilor semincere. De asemenea, el a pus la punct tehnici clonale i de polenizare artificial la arbori, a realizat primul program complet de ameliorare i selecie a arborilor plus, de creare a primelor livezi de semine i teste de descenden. n mod independent, n Suedia, Langlet a efectuat n 1936 primele observaii n legtur cu variabilitatea geografic a pinului silvestru n funcie de climat, deschiznd calea viitoarei genetici ecologice, cu mult nainte de Stebbins (1950). Geneticianul Nilsson-Ehle a descoperit exemplare de plop triploid (Populus tremula var. gigas), iniiind astfel irul unor lucrri de referin n domeniul poliploidiei. n ciuda acestor realizri cu totul remarcabile, se pare c ele nu au avut un impact major n practica forestier mondial i nu puini silvicultori (unii chiar i n prezent) au rmas

la convingerea c dezvoltarea arborilor i a pdurii ar depinde numai de mediu (Nanson, 2005). n perioada interbelic, graie marilor descoperiri n domeniul geneticii, ncep s se elaboreze i s se aplice primele programe sistematice pe linia ameliorrii diferitelor specii forestiere. n acest sens se evideniaz programul propus i iniiat de ctre Fabricius, n Germania, o ampl aciune de ameliorare bazat pe introducerea practicilor de autofecundare, de selecie, hibridare i sistem clonal de nmulire. Tot n aceast perioad, n Statele Unite ale Americii, ia fiin un institut de genetic forestier la Placerville (California), n timp ce n mai multe ri din Europa (Germania, Danemarca, Suedia, Canada, Italia) apar numeroase i importante organizaii, comitete i asociaii n domeniul ameliorrii genetice a arborilor (Stnescu, 1983). Dup cel de-al II-lea rzboi mondial, un nume de referin ce s-a impus n dezvoltarea ameliorrii speciilor forestiere a fost cel al suedezului Lindquist (1948), al crui concept era ca programele n domeniu s urmeze filiera: populaii semincere, arbori plus i livezi de semine. Acest concept avea s prezinte un mare ecou pn n Statele Unite i n Japonia. Dup 1950, n urma apariiei unor discipline de mare importan precum genetica evolutiv i cea a populaiilor, bazate pe lucrrile de excepional nsemntate tiinific ale lui Dobzansky, Stebbins i Mayr, s-a putut descifra rolul fundamental ce-l deine variabilitatea intra i interpopulaional n cadrul ameliorrii genetice forestiere. Ca urmare, s-a putut trece la o selecie sistematic a primelor populaii semincere n Europa (ex. n Belgia), nfiinarea primelor livezi de semine n sistem clonal (Scandinavia, Germania i Statele Unite) cu material provenit de la arbori plus aparinnd populaiilor locale, populaii care s-au dovedit a fi cele mai productive i mai bine adaptate. Ulterior, prin dezvoltarea studiilor de provenien, s-a dovedit c ecotipurile locale nu sunt ntotdeauna cele mai bune. Tot n aceast perioad sau nfiinat primele parcuri de clone cu genotipuri dintre cele mai valoroase i s-au creat metode statistice eficiente n vederea stabilirii unor comparaii precise i elocvente ntre diferite populaii de arbori. Apariia geneticii cantitative dup 1960 (Falconer i Lerner), coroborat cu dezvoltarea studiilor de variabilitate intraspecific la arbori, a permis perfecionarea i ajustarea criteriilor de selecie a indivizilor performani necesari n activitatea de ameliorare. n acest sens, n mai multe ri din Europa (mai ales n Belgia i Frana) s-a mrit semnificativ aria de culturi comparative de proveniene, plantaiile respective fiind ulterior repetate n mai multe regiuni, n condiii ecologice din cele mai diverse. De asemenea, n Statele Unite, Noua Zeeland i Australia au luat amploare aceste culturi, aplicndu-se tot mai mult aceste metode ale genetice cantitative. Rezultatele obinute au stat la baza definitivrii i delimitrii celor mai valoroase arborete surse de semine i, n consecin, la elaborarea unei legislaii clare n domeniul provenienei, transferului i utilizrii materialului biologic provenit din aceste formaiuni forestiere. Dup anul 1970 s-au perfecionat i a luat amploare utilizarea tehnicilor biochimice, respectiv metode de electroforez privind determinarea unor indici biochimici ca izoenzimele, terpenele i taninuri. Acestea au permis caracterizarea genotipurilor i populaiilor de arbori i o estimare rapid i precis a gradului de variabilitate intra i interpopulaional. n paralel, n unele ri precum Frana, a luat amploare multiplicarea vegetativ n mas prin utilizarea unor metode moderne specifice culturilor in vitro, respectiv micropropagarea. Dup 1980, descoperirile de mare performan n domeniul biologiei moleculare, specifice analizelor de ADN (RFLP, RAPD, AFLP, marcheri QTL microsatelii) i ale ingineriei genetice (hibridare somatic i transfer de gene), au stat la baza apariiei 3

biotehnologiilor moderne cu mare impact i n cercetrile de ameliorare genetic arborilor. Utilizarea acestor tehnici de mare performan i-au gsit o tot mai larg aplicabilitate i, n prezent, contribuie din plin la elucidarea unor importante aspecte privind refugiile i migrrile postglaciare, structura genetic a populaiilor de arbori i gradul acestora de heterozigoie. n ara noastr, primele preocupri sistematice n domeniul ameliorrii genetice a arborilor sunt relativ recente i cercettori silvici ca Zaharia Przemeki, Anton Rdulescu, Petre Grunau, Marian Petcu, Marin Rdulescu, Sergiu Pacovici au adus primele contribuii concrete n metodologia de ameliorare forestier bazat pe selecie. Pe aceast linie, la iniiativa lui Zaharia Przemeki se promoveaz studiile de proveniene i alegerea ecotipurilor n culturile forestiere, prin aceasta reducndu-se semnificativ ciclurile de producie (Stnescu, 1983). Odat cu nfiinarea I.C.A.S. Bucureti, n anul 1948, s-au organizat i ntreprins primele lucrri sistematizate de selecie, hibridare i instalare de culturi comparative de proveniene. ntre anii 1950-1960 s-au pus la punct i aplicat primele experimente privind stimularea fructificaiei la cvercinee, elaborndu-se totodat primele instruciuni i ndrumri de selecie a arborilor i arboretelor n vederea stabilirii rezervaiilor de semine de stejar. n deceniul urmtor, la iniiativa i pe baza cercetrilor efectuate de ctre colectivul coordonat de V. Enescu, s-a derulat o aciune extrem de important, respectiv s-a introdus primul sistem specific de cartare seminologic pe baza cruia s-au identificat i delimitat cele mai reprezentative arborete surse de semine de la noi din ar. Astfel, ntre anii 1962 1965, s-au identificat peste 5000 de arborete semincere, totaliznd o suprafa de peste 120 000 ha, din care peste 2/3 specii de rinoase. Toate aceste formaiuni forestiere au fost descrise i clasificate n funcie de valoarea lor seminologic i s-au stabilit totodat msurile specifice de ngrijire i transformare a celor mai valoroase arborete n rezervaii de semine. Dup 1970 s-a intensificat ritmul seleciilor i hibridrilor ntre cei mai valoroi arbori n cadrul ameliorrii unor specii, astfel nct s-a extins destul de mult aria plantajelor de semine (peste 200 ha), majoritatea suprafeei fiind ocupat cu specii de rinoase (larice, pin, duglas etc.). nfiinarea primelor colecii de clone a dat un impuls i activitii de conservare a resurselor genetice forestiere concretizate prin genotipuri de mare valoare la unele dintre cele mai importante specii de arbori. n paralel, s-au intensificat cercetrile i observaiile n domeniul sistematicii i variabilitii la mai multe specii forestiere importante (pin, larice, stejar, molid) sau de stabilire a cariotipului la molid, pin etc. n cadrul activitii de ameliorare a unor specii forestiere se pot aminti cteva realizri deosebite n ceea ce privete utilizarea unor clone de plop de mare productivitate, ncepnd cu anul 1976, precum i obinerea unor clone selecionate de salcie i rchit, ambele categorii manifestnd creteri semnificative pe unitate de timp i suprafa. II. OBIECTIVELE AMELIORRII ARBORILOR n esen, prin ameliorarea forestier se urmrete obinerea unor exemplare de arbori mult mai performante ca productivitate i caliti tehnologice, mai bine adaptate la mediu n sensul creterii rezistenei la aciunile nocive ale factorilor biotici (boli, duntori) sau abiotici (inclusiv accidente climatice), n scopul satisfacerii unor cerine economice mereu crescnde. n ultima perioad sunt avute n vedere i cerine ecologice reconstrucia ecologic a zonelor distruse sau calamitate, mpdurirea unor zone aride, soluri srturoase sau ameninate cu deertificarea. 4

Paleta obiectivelor cantitative i calitative urmrite n activitatea de ameliorare a arborilor este extrem de divers, innd cont de complexitatea acestor organisme vegetale (n special complexitatea structurii genetice), de ciclurile lor de via lungi i foarte lungi, maturitate trzie i fructificaia extrem de abundent. De aici se pot defini cteva trsturi genetice specifice care deosebesc fundamental arborii de restul speciilor vegetale. 2.1. Trsturi genetice specifice arborilor 1. Arborii sunt posesorii unei uriae rezerve de variabilitate genetic, n sensul c n structura lor genotipic predomin, ntr-o proporie covritoare, heterozigoia pentru multe caractere. Aceast trstur a fost pus n eviden prin efectuarea mai multor teste i investigaii i prin utilizarea unor tehnici de vrf ca marcheri genetici, biochimici, inclusiv amprentele genetice. Marea diversitate genetic inter i intrapopulaional a arborilor se datoreaz faptului c aceste specii au evoluat, de-a lungul timpului, n cele mai diverse nie ecologice i, pe de alt parte, panmixia atinge n arboretele naturale cotele cele mai ridicate datorit alogamiei i capacitii enorme de nflorire i fructificare. 2. O trstur extrem de important i cu largi implicaii n procesul de ameliorare forestier o reprezint marea frecven a sistemelor poligenice i polialelice, arborii caracterizndu-se printr-un numr mare de caractere de ordin cantitativ (bioacumulri) rezultate din multiple i complexe interaciuni genice alelice i nealelice. Aceast caracteristic prezint o mare importan speciilor forestiere i n plan ecologic, conferindu-le o mai mare plasticitate i capacitate sporit de adaptabilitate. 3. Spre deosebire de alte specii de plante (cele cultivate sau chiar din flora ierboas spontan), arborii au un echipament genetic mult mai stabil, format dintr-un numr mai mare de cromozomi i, n general, de mai mici dimensiuni, aceasta reprezentnd o consecin a vechimii acestor specii (mai ales gimnospermele) i evoluiei lor ndelungate n nie ecologice foarte variate. 4. n ciuda structurii lor genetice complexe, a ciclurilor lungi de via i a maturitii trzii, arborii manifest o accentuat susceptibilitate la diferii factori de mediu. De aceea, n cadrul diferitelor etape ale procesului de ameliorare forestier bazate pe selecie i hibridare, problema interaciunii dintre genotipul unui arbore i mediu s prezinte o foarte mare importan pentru amelioratori n sensul utilizrii eficiente a unor metode de testare i ameliorare a diferitelor caractere. 5. Pronunatul caracter de sociabilitate a arborilor este demonstrat de nsi modul lor de existen, acetia edificnd, n majoritatea cazurilor, populaii extinse, comuniti largi, n care selecia natural a acionat sistematic n condiiile specifice mediului de via. n populaiile alogame de arbori s-a creat o constelaie bogat i specific de gene, supuse unui flux panmictic intensiv, acest fenomen datorndu-se existenei unor suprafee de schimb de gene foarte mari (cantiti uriae de polen, inflorescene la partea superioar a coroanei, etc.). De aceea, aceste populaii naturale constituie adevrate centre de germoplasm util pentru activitatea de ameliorare dar i cea de conservare a unui fond genetic extrem de valoros prin varietate i o mare capacitate de recombinare. 6. Tot la arbori, mai ales n interiorul populaiilor mari, homeostazia genetic se manifest cu deosebit intensitate, fapt explicabil prin prezena masiv a heterozigoilor care menin heterogenitatea populaiilor respective. Acest fapt face posibil meninerea echilibrului i fluxului constant de gene chiar i n interiorul unor colectiviti de arbori relativ restrnse i izolate (ex. cele de fag din nordul Dobrogei). Mecanismele stabilitii genetice, ale rezistenei 5

la schimbrile structurale profunde, sunt, n acest caz, cu mult mai puternice dect efectele consangvinizrii sau derivei genetice care, n cazul altor specii, s-ar manifesta mult mai pregnant. Izolarea reproductiv poate cauza totui ntreruperi din arealul unei specii i duce la apariia unor diferenieri genetice ca urmare a reducerii fluxului panmictic i a influenelor mediogene cu puternice efecte selective. Acest fenomen st la baza apariiei unor populaii locale, ecotipuri sau rase geografice, dar, chiar i n aceste condiii, se pstreaz constelaia de baz a genelor, fr modificri brute ale structurii genofondului i, n consecin, aceste formaiuni restrnse rezist destul de bine la puternice i brute variaii de mediu. 2.2. Obiective cantitative n cadrul acestei categorii sunt incluse toate caracteristicile legate de creteri i bioacumulri, respectiv producia de mas lemnoas, capacitate de fructificare i producere de semine. Aceste trsturi sunt supuse controlului unui numr mare de gene (gene minore), precum i interaciunilor ntre genele alele i nealele. n acest caz, influena factorilor de mediu este mare, iar eritabilitatea (n ce msur se transmite un caracter de la prini la urmai) este redus. Obiectivul prioritar urmrit n ameliorarea caracterelor cantitative la arbori l reprezint producia de mas lemnoas, respectiv producia total n volum pe unitate de suprafa i timp sau maximul creterii medii anuale exprimat n m3 / ha / an. Productivitatea total a unei populaii este aproape n exclusivitate determinat de condiiile de mediu specifice fiecrei staiuni pe de-o parte, dar i de materialul genetic utilizat, pe de alt parte. Tratamentele aplicate, n special cele privind gradul de intensivitate a rriturilor, nu au un efect direct semnificativ asupra produciei totale. Condiiile de mediu reprezint un factor fix i, de cele mai multe ori, defavorabil ameliorrii n populaiile naturale. n cadrul plantaiilor, dimpotriv, silvicultorii pot alege mult mai uor i cu costuri mult reduse cel mai potrivit material biologic pentru viitoarele generaii i pot prognoza mult mai uor evoluia regenerrii naturale a materialului plantat. n ceea ce privete producia de biomas, speciile forestiere se caracterizeaz printr-o eritabilitate relativ redus a caracterelor de cretere care sunt controlate de un numr foarte mare de gene, fiind implicate, de asemenea, multiple i complexe interaciuni alelice i nealelice. De aceea, pe linia ameliorrii produciei totale de biomas, selecia n favoarea exemplarelor cu cele mai mari creteri dimensionale (nlime dominant) poate s nu conduc ntotdeauna la rezultatele scontate i, n consecin, geneticienii amelioratori ar trebui s o aplice cu precdere n perioada de juvenilitate a arborilor selectai. n cazul unor specii, cum ar fi de exemplu la molid, n cadrul culturilor comparative, diferenele dintre provenienele cele mai bune fenotipice i cele mai slabe au nregistrat valori spectaculoase n ceea ce privete producia total de biomas, acestea atingnd pragul de aproape 300%. Totui, cea mai recomandabil msur ar fi promovarea unor genotipuri polivalente, cu caracteristici calitative remarcabile, cu larg adaptabilitate ecologic, rezistente la maladii i la condiii climatice neprielnice (Stnescu, 1984). Este cunoscut faptul c producia total de materie uscat este mai mare dect producia economic i nu toat cantitatea de lemn ce se poate recolta se poate utiliza economic. De aceea, n relaia dintre producia biologic (Ybiol) i cea economic (Yec) este introdus indicele de recolt net (IRnet) care exprim procentul de lemn, n greutate i volum,

recoltat din pdure i utilizat. Deci, n anumite condiii de mediu, dinamica relaiilor dintre cele dou producii este: Yec = Ybiol x IR Un factor favorizant privind reuita ameliorrii produciei de biomas ar fi existena unor variaii genetice la cel puin unul din factorii de care aceasta depinde. Pe de alt parte, indicele de recolt net variaz cu specia, proveniena i chiar la biotipuri diferite din cadrul aceleai populaii. Nu n ultimul rnd, producia biologic mai depinde de o serie de caractere fixate ereditar dar i de influena, uneori nsemnat, a mediului n realizarea lor. Cele mai importante componente biologice ale produciei economice sunt nlimea valorificabil, suprafaa de baz fr coaj, factorul de form, factorul calitii tulpinii, factorul calitii lemnului i densitatea arboretului. 2.3. Obiective calitative Modificarea zestrei ereditare a arborilor ar crea largi posibiliti i n ceea ce privete ameliorarea a numeroase i extrem de importante caractere calitative, caractere supuse controlului unui numr restrns de gene (uneori fiind implicat chiar o singur gen), mult mai puin sau chiar deloc influenate de condiiile de mediu. n general, se pot delimita dou mari categorii de trsturi calitative, respectiv caractere extrinseci (exterioare) cum ar fi forma trunchiului, a fusului sau forma ramurilor i caractere intrinseci (interioare) ca cele legate de calitatea lemnului (fig.1). 2.3.1. Obiective calitative extrinseci A. Rectitudinea tulpinii O bun rectitudine (dac ar posibil pn la mugurele terminal) crete proporia de lemn utilizabil prin raportul la volumul de lemn brut total, pe cnd defectele de form la nivelul tulpinii reduc n bun msur calitatea lemnului. Cilindricitatea i rectitudinea tulpinii reprezint principalii factori ai indicelui de zveltee care se exprim prin raportul dintre diametrul i lungimea fusului. Tot legat de calitatea tulpinii, se prefer formele fr nfurciri i dac totui acestea apar n mod repetat, se pare c ar fi un indiciu al predispoziiei individuale. De asemenea, este dorit absena unor defecte vizibile ca fibre torse, caneluri, gelivuri, etc. B. Calitatea ramurilor n procesul de ameliorare forestier se urmrete obinerea de exemplare de arbori cu ramuri ct mai subiri (noduri mai puin profunde) i cu inseria ct mai apropiat de unghi drept i fr nfurare pe tulpin. Lungimea ramurilor se coreleaz cu lungimea coroanei i a tulpinii. Arborii cu ramuri mai scurte i cu o coroan ngust rezist mult mai bine la rupturile provocate de cderi masive de zpad moale. De asemenea, n urma elagajului, rnile sunt mai mici i superficiale iar procesul de cicatrizare este mult mai rapid.

Figura 1. Arbori plus ntr-o populaie semincer de molid (dup Nanson, 2005) 2.3.2. Obiective calitative intrinseci A. nsuirile lemnului Preocuprile privind calitatea lemnului au trezit un tot mai accentuat interes al specialitilor amelioratori i prin aceea c mbuntirea nsuirile tehnologice a cptat o semnificaie practic tot mai profund. Densitatea lemnului este corelat cu randamentul n past, calitatea pastei i a hrtiei, cu lungimea i diametrul fibrelor, cu grosimea pereilor celulari i procentul de celuloz. Un grad redus de albire sau un coninut mare de compui chimici n lemn poate reduce randamentul de producere a hrtiei, precum i calitatea acesteia. La unele specii importante economic (pin), variabilitatea intraspecific crescut a nsuirilor lemnului, n raport cu originea geografic a provenienelor, prezint o importan deosebit pentru ameliorare. B. Rezisten i adaptare Este vorba, n principal, despre rezistena i adaptabilitatea la unele categorii de ageni: a) climatici: - ger timpuriu autumnal, profund hibernal i trziu de primvar - zpad moale - vnt - uscciune; b) biologici: - boli (micoze, bacterioze, viroze) - atacuri de insecte;

c) antropici: - poluare atmosferic (CO2, SO2, NOX, O3, F, HF) - animale domestice, vnat. Creterea rezistenei biologice a speciilor forestiere la duntorii biotici i abiotici reprezint un obiectiv cu mare valoare practic, iar eritabilitatea caracterelor legate de rezisten este foarte mare. Dup Zobel (1995), majoritatea caracterelor intrinseci ale lemnului depind n mare msur de trsturile extrinseci. n consecin, canalizarea eforturilor n direcia ameliorrii celor din urm prezint urmri favorabile i importante i asupra caracterelor intrinseci. III. AMELIORAREA ARBORILOR PRIN METODE CLASICE n cadrul populaiilor naturale, ct i n unele populaii artificiale sau plantaii, ameliorarea diferitelor specii de arbori se poate face fr a se modifica rapid (forat) structura genotipic a indivizilor, ci treptat, prin selecie sau hibridare a genotipurilor existente. Aceste metode se ncadreaz n categoria metodelor clasice (convenionale) de ameliorare genetic a arborilor i se aplic n strategii privind obinerea unor forme cu productivitate superioar (ex. selecia) sau a unor exemplare mai rezistente la atacuri masive de boli sau insecte (ex. hibridarea). n cazul existenei unei variabiliti accentuate n cadrul unei populaii de arbori, selecia poate avea efecte spectaculoase pentru caracterele cantitative specifice bioacumulrilor. n cazul obinerii unor rezultate rapide n activitatea de ameliorare a arborilor, rezultate ce depind de aplicarea unor tehnici energice dar i de mare finee asupra structurii intime a materialului genetic, sunt utilizate metodele moderne (neconvenionale), pornind cu mutageneza i terminnd cu tehnicile de mare precizie i randament specifice ingineriei genetice (fuziunea de protoplati, semine artificiale, culturi in vitro, tehnici de electroforez cromatografie i pn la marcheri genetici moleculari ca PCR, RFLP i amprente geneticesecvene de ADN). Alegerea i aplicarea diferitelor metode n procesul de ameliorare a diferitelor specii de arbori depind de obiectele urmrite n cadrul ameliorrii, de strategiile adoptate, de specificul eco-biologic al speciei i, nu n ultimul rnd, de posibilitile concrete avute la dispoziie (dotare i personal calificat de specialitate). Dei aceste metode se pot aplica de sine stttor (mai ales selecia), programele tot mai complexe de ameliorare forestier reclam utilizarea integrat a tehnicilor i operaiilor specifice, n funcie de perspectiva evoluiei unei anumite populaii dar i de cerinele de moment ce apar n anumite faze ale programului. Astfel, selecia se poate aplica uor n diferite subetape pe parcursul derulrii unui program de ameliorare forestier, prin faptul c deine largi posibiliti de acionare. Pe de alt parte, mutageneza, culturile in vitro i, mai ales, micropropagarea pot scurta semnificativ perioade foarte lungi ale procesului de ameliorare, fapt cu implicaii practice deosebite, innd cont de longevitatea mare i foarte mare a speciilor de arbori. 3.1 Selecia n sens strict genetic, selecia reprezint o regrupare ntr-un numr redus de exemplare de arbori, a unor gene sau combinaii valoroase de gene cu efect favorabil pentru obiectivul de ameliorare urmrit (Lucu 1998). Din pcate, n cadrul arboretelor naturale sunt foarte mici anse ca s existe astfel de exemplare de arbori datorit faptului c aciunea seleciei naturale 9

se exercit cu intensiti variabile asupra diferitelor caractere i, n plus, majoritatea caracterelor (mai ales cele cantitative, legate de bioproductivitate) sunt supuse unui control genetic extrem de complex avnd un pronunat determinism poligenic. Genele implicate n manifestarea fenotipic a caracterelor menionate au o larg rspndire n cadrul unei populaii datorit unei ample panmixii, iar, pe de alt parte, aceste sisteme poligenice sunt extrem de dificil de identificat astfel nct doar exemplarele purttoare ale acestor combinaii s poate fi identificate i analizate. Prin dezvoltarea tehnicilor specifice geneticii cantitative i o interpretare a aciunii genelor implicate prin extrapolare la caracterele fenotipice, ar fi, n prezent, posibil o selectare a unor exemplare de arbori posesori de combinaii deosebit de utile n cadrul ameliorrii i efectuarea, n continuare, de hibridri ntre indivizii selectai n scopul realizrii unui cumul de gene favorabile la un numr mai mic de arbori. Selecia fenotipic ar consta n alegerea dintr-o populaie a unor arbori bine dotai dup simpla observare a manifestrii unor caractere exterioare. Selecia genotipic const n selectarea unor exemplare valoroase scopului urmrit n ameliorare numai n urma efecturii unui amplu studiu privind valoarea ereditar a unor caractere, studiu ce ar avea la baz analize i testri comparative. nainte de a prezenta selecia ca metod clasic de ameliorare forestier, vom meniona cteva dintre cele mai importante principii ce stau la baza iniierii i derulrii oricrui program de ameliorare a arborilor bazat pe aceast important metod. 3.1.1. Principii fundamentale ale ameliorrii prin selecie 1. Cele mai sigure garanii privind eficacitatea unui program de ameliorare forestier bazat pe selecie sunt oferite de alegerea i utilizarea celor mai bune proveniene. Prin termenul de provenien se nelege locul n care se gsete o populaie artificial (furnizor de material reproductor), avnd ca origine locul unde se gsete populaia natural, sinonim, n acest caz, cu un ecotip (Nanson, 2005). De exemplu, duglasul ca provenien Darrington (statul Whashington ,USA) furnizeaz semine din populaia autohton din aceast regiune, avnd rezultate excelente la aciuni de rempdurire aproape peste tot: se poate afirma c Darrington reprezint o bun provenien. 2. n ciuda longevitii mari a arborilor comparativ cu alte specii vegetale, selecia i efectele ei, n limita posibilitilor, trebuie urmrit pe parcursul mai multor generaii. Culturile comparative de proveniene, n acest caz, pot avea un rol extrem de important i determinant n ceea ce privete depistarea mai rapid a efectelor seleciei. Pe de alt parte, utilizarea micropropagrii la culturile in vitro poate scurta semnificativ, la unele specii de arbori, perioadele lungi de timp ce se scurg ntre cicluri succesive de selecie. 3. Numrul de caractere urmrite n cadrul unui ciclu de ameliorare prin selecie este de preferat s se limiteze la 2, cel mult 3, situaie n care ctigul genetic este superior att n cazul caracterelor cantitative, ct mai ales n cazul celor calitative unde eritabilitatea (proporia n care un caracter este transmis la descenden) este maxim. 4. Selecia artificial nu poate s fie dirijat pe traiectul seleciei naturale, ntruct cea din urm cu greu poate fi depit privitor la unele caractere i adaptri formate ntr-un lung proces grevat pe nsi evoluia unei populaii n cadrul unei anumite staiuni. De aceea, n cadrul iniierii i derulrii unui proces de ameliorare forestier bazat pe selecie trebuie inut cont de specificul fiecrei populaii locale i de condiiile staionale ce au stat la baza evoluiei acesteia.

10

5. ntotdeauna, demararea oricrui program de ameliorare forestier prin selecie se va face n cadrul unor populaii mari i foarte mari de arbori, acest fapt certificnd existena unei foarte largi baze genetice printr-un grad mare de heterozigoie. n acest mod este evitat apariia efectelor nedorite ale consangvinizrii, fenomen coroborat cu diminuarea semnificativ a bazei genetice iniiale. 6. n cele mai multe cazuri, rezultatele cele mai rapide ale aciunii seleciei sunt remarcate n cadrul regenerrilor artificiale n comparaie cu populaiile naturale de arbori, deoarece, la acestea din urm, nu este posibil i o testare a descendenelor, aceasta reprezentnd o condiie obligatorie n practica ameliorrii forestiere. 7. n general, nainte de iniierea unui program de ameliorare forestier se recomand efectuarea unei inventarieri a populaiilor existente i a unor proveniene remarcabile, precum i o estimare a gradului de variabilitate intraspecific general existent att pentru speciile autohtone, ct i pentru cele exotice din cultur (Stnescu, 1983). 3.1.2. Formele seleciei artificiale Marea diversitate a formelor seleciei a fcut necesar o difereniere a acestei metode pe mai multe tipuri de criterii. Astfel, n funcie de valoarea relativ a exemplarelor, care constituie obiectul direct al activitii n munca de ameliorare a diferitelor specii de arbori, se disting: - selecia pozitiv, n situaia n care sunt selectai numai arborii de calitate (de regul numai arbori plus cu creteri excepionale i caliti deosebite), n timp ce restul de arbori sunt ndeprtai total sau parial, n funcie de prioriti, acest procedeu fiind caracteristic rriturilor selective; - selecia negativ, ce se practic n arboretele surse de semine din care se extrag arborii slab dotai, defectuoi i al cror fond slab de gene nu ar trebui s participe la perpetuarea speciei, conservndu-se arborii valoroi din punct de vedere biologic i economic. n final, selecia negativ are efecte pozitive i este practicat la lucrrile de ngrijire de igienizare i stimulare a regenerrii naturale. Dup natura caracterelor urmrite n ameliorare, exist selecia fenotipic i selecia genotipic, despre care s-au fcut precizrile potrivite n subcapitolul anterior. n funcie de gradul de intensivitate al lucrrilor, putem avea: - selecie n mas practicat mai ales n cadrul executrii unor lucrri de ngrijire n cadrul arboretelor surse de semine. n acest caz se trece la alegerea unui numr relativ mare de arbori valoroi de la care se recolteaz semine amestecate, rezultate n urma unui proces de fecundare liber, iar evoluia descendenei nu este urmrit individual. - selecia individual se execut n cadrul familiilor unde arborii se nmulesc sexuat (din smn) sau n sistem clonal (multiplicare vegetativ). n cazul aplicrii acestui tip de selecie, exemplarele valoroase de arbori sunt urmrite individual i n descenden, evoluia fiecrui individ interesnd amelioratorii prin prisma unor hibridri i selecii viitoare. Dup efectele avute asupra structurii genetice a populaiilor se disting trei tipuri de selecie: - selecia stabilizatoare prin a crei aciune sunt eliminate formele de la periferia unei populaii, care sunt mai puin adaptate, dar i exemplarele cu valoare sczut de reproducere i supravieuire. n acest mod sunt conservate i promovate fenotipurile cu capacitate mare de adaptare i reproducere n cadrul populaiei, acestea fiind cantonate,de regul, n partea de mijloc (fig.2.1). Cnd condiiile de mediu sunt relativ constante, ntre aciunea factorilor specifici mririi variabilitii genetice (recombinarea, mutaia, migraia) i aciunea seleciei

11

naturale se ajunge la un echilibru, n structura genetic a populaiei fluxul genelor i a genotipurilor rmnnd constant pe o anumit perioad de timp (homeostazie genetic); - selecia disruptiv reprezint opusul seleciei stabilizatoare, n sensul c aciunea acesteia favorizeaz cteva fenotipuri (n funcie de specificul aciunii i optimul fiecrui fenotip), restul fenotipurilor intermediare fiind defavorizate n mod discriminator (fig. 2.2). n acest mod rspunsul populaiei pe ansamblu la acest tip de aciune se va caracteriza, printre altele, prin apariia unei pronunate discontinuiti n ceea ce privete variabilitatea. Astfel sunt evidente manifestrile unui pronunat polimorfism genetic, materializat prin apariia a numeroase forme distincte n cadrul fiecrui optim i, n final, o tendin clar de divergen i izolare, respectiv apariia unor subpopulaii adaptate local. Efectele acestui tip de selecie sunt foarte rar aplicate n practic i numai n cazul unor caractere supuse unui puternic control genetic. Interveniile neraionale, uneori iresponsabile, n viaa pdurii pe de o parte, sau efectul catastrofal al unor calamiti naturale, pe de alt parte, nu pot avea alt efect dect distrugerea sau alterarea unor ecosisteme forestiere ntregi i o reducere dramatic a diversitii genetice a populaiilor i a variabilitii intraspecifice la arbori. - selecia direcional se caracterizeaz prin aciune sa alternativ asupra unor forme aflate la periferia unei populaii, prin care sunt promovate fie unele forme superioare sub aspectul unor caracteristici fenotipice (aa numitele plusvariante), caz n care avem o selecie direcional progresiv (fig.2.4), cu efecte pozitive i asupra fenotipurilor comune, sau asupra unor exemplare mai puin valoroase (minusvariante), respectiv selecie direcional regresiv (fig.2.3). Evident, n practica silvic intereseaz cel mai mult efectele seleciei progresive prin faptul c se urmrete o nmulire constant a numrului de arbori de valoare, cu mult peste media populaiei prin prisma dimensiunilor, volumului total, etc. n anumite situaii (mult mai rar), este promovat n ameliorarea forestier i selecia regresiv, mai ales cnd sunt urmrite unele minusvariante utile n anumite condiii specifice zonei (ca de ex. arbori cu ramuri subiri i coroane nguste preferai celor cu lemn de calitate) (fig. 2). n funcie de natura genotipurilor din populaie, promovate sau eliminate prin selecie, se difereniaz: selecie n favoarea sau mpotriva homozigoilor dominani (a genelor aditive), selecie n favoarea sau mpotriva heterozigoilor, selecie n favoarea sau mpotriva homozigoilor recesivi. Avnd n vedere mrimea coeficienilor de selecie care se folosesc, adic intensitatea seleciei, aceste tipuri de intervenie pot fi pariale sau totale (Stnescu, citat de Lucu,1998). 3.1.3. Determinarea efectelor seleciei Eficiena unui program de ameliorare forestier este concretizat prin gradul de rentabilitate a metodei (n cazul nostru este vorba de selecie), legat de parametri specifici i tehnologia utilizat, dar i de natura speciei care face obiectul activitii de ameliorare.

12

Figura 2. Forme ale seleciei dup structura genetic a populaiei (dup Lucu 1998) Este evident faptul c scopul oricrei iniiative privind derularea unui program de ameliorare bazat pe selecie l constituie realizarea unui ctig de producie ce se estimeaz prin calcularea ctigului genetic (G), parametru exprimat prin relaia: n care: i reprezint intensitatea seleciei i este dat de raportul n/N (n nr. de arbori selecionai i N nr. total de arbori); este factorul ce poate cel mai mult influenat de ctre silvicultor; h2 reprezint eritabilitatea unui caracter urmrit n ameliorare i este un factor fix asupra cruia silvicultorul nu poate interveni n nici un fel; F este ecartul tip fenotipic sau rdcina ptrat a varianei fenotipice ce poate estima gradul de variabilitate al caracterului respectiv i acesta poate varia de la o staiune la alta sau de la un caracter la altul. Ctigul genetic poate fi calculat n valori absolute, respectiv n uniti de msur specifice caracterului considerat sau n valori relative, cu ajutorul raportului dintre termenii ecuaiei de mai sus i valoarea genotipic medie (G) (Stnescu, citat de Lucu,1998): G G ih2F G G = ih2F

13

Procentul de arbori promovai din efectivul total al unei populaii ne precizeaz dimensiunea real a proporionalitii directe dintre ctigul genetic i intensitatea seleciei (i). Pe de alt parte, intensitatea seleciei, orict de mare ar fi la nivelul unei populaii de arbori, nu poate genera un ctig genetic substanial atunci cnd existent o slab eritabilitate (h2) a caracterului urmrit n ameliorare. n sfrit, ctigul genetic este influenat i de ecartul de tip fenotipic (F), prin aceea c exist o mult mai mare posibilitate de a depista prin selecie genotipuri valoroase prin prisma existenei unei mari variabiliti la un anumit caracter urmrit n procesul ameliorrii. ntotdeauna, n cadrul arboretelor surse de semine, chiar i n condiiile aplicrii unui sistem intensiv de selecie, ctigul genetic va fi extrem de mic, n primul rnd datorit existenei unui coeficient de eritabilitate redus pentru majoritatea caracterelor. n urma efecturii seleciei n mas a indivizilor rezultai prin polenizare liber, ctigul genetic este detectabil i crete pe msura aplicrii unor rrituri ce favorizeaz arborii cei mai valoroi. O cu totul alt situaie se nregistreaz n cadrul livezilor semincere de descendene materne n care, n urma seleciei celor mai bune familii i a celor mai valoroi indivizi, ctigul genetic crete semnificativ. Cele mai spectaculoase creteri ale ctigului genetic se nregistreaz n cadrul livezilor semincere de descendene biparentale, n care exemplarele plantate rezult ntotdeauna din ncruciarea controlat a 2 genitori cunoscui (tab.1). Tabelul 1 Ctiguri genetice relative obinute la diferite forme ale seleciei, dup eritabilitate (dup Wright, 1963, citat de Lucu, 1998)
Ctigul genetic n: Uniti G % din valoarea medie cnd eritabilitatea este: 0,10 0,20 0,30 0,05 0,1 0,2 0,3 0,12 1,25 2,06 1,63 1,83 3,08 0,12 1,25 1,52 1,30 1,55 2,11 0,12 1,25 1,26 1,14 1,42 1,88 0,05 0,5 1,1 0,8 1,1 2,0 0,1 1,0 1,7 1,3 1,5 2,5 0,2 2,0 2,4 2,1 2,5 3,3 0,4 3,0 3,0 2,7 3,4 4,5

Forme de selecie 0,05 Arborete surse de semine, alegerea semincerilor Plantaje de clone fr teste de descendene Plantaje de clone cu teste de descendene Plantaje de descendene materne; rrituri n favoarea celor mai bune familii Plantaje de descendene materne; rrituri n favoarea celor mai buni arbori din cele mai bune familii Plantaje de descendene biparentale; rrituri n favoarea celor mai buni arbori din cele mai bune familii 0,12 1,25 2,70 2,03 2,83 4,91

14

3.1.4. Ameliorarea prin selecie etape generale 3.1.4.1. Ciclul de selecie i ciclul de ameliorare A. Obinerea de informaii i calculul parametrilor genetici pentru stabilirea cilor optime de selecie O ameliorare genetic, cu adevrat eficient, se poate ndeplini numai atunci cnd toate caracterele urmrite sunt controlate genetic i prezint n cadrul populaiei stabilite un suficient grad de variabilitate. Pe de alt parte, este foarte important de cunoscut gradul de legtur existent ntre caractere, cunoscut fiind faptul c selecia pentru o anumit trstur poate antrena i modificarea altei trsturi datorit existenei fenomenelor de pleiotropie i linkage. Controlul genetic i manifestrile fenotipice ale diferitelor caractere ale organismelor depind foarte mult de factorul genetic, de factorul mediu, ct i de interaciunea acestora: F = G + M + GM n care, F valoarea fenotipic, G structura genotipic i M influena mediului. Factorul genetic rmne, pentru majoritatea caracterelor, factorul determinant i, n funcie de modul su de aciune, se manifest sub dou forme de baz: - gene cu efect aditiv (A), ce se transmit prin reproducere pe baz de hazard, sunt independente fa de alte gene i au efect propriu asupra manifestrii anumitor caractere; - gene complexe care, de regul, interacioneaz alelic i nealelic (I) cu multe alte gene, cu efect de dominan (D) n cadrul caracterelor specifice bioacumulrilor (cantitative), acestea reprezentnd efectul neaditiv (fig. 3).

Figura 3. Efectele interaciunii dintre alela A2 i alte alele, fie din acelai locus fie din loci diferii (dup Kremer, citat de Lucu, 1998)

15

Prin urmare, efectele de ansamblu al tuturor genelor implicate (G) asupra unui caracter (ex. volumul unui arboret) s-ar rezuma prin relaia: G=A+D+I Este deja cunoscut faptul c efectele aditive (D i I ) dein ponderea cea mai nsemnat n ceea ce privete exprimarea fenotipic a celor mai importante caractere urmrite ntr-un program de ameliorarea genetice, numai c aceste efecte nu pot fi calculate individual, ci numai estimate global. Referitor la existena unui anume grad de variabilitate fenotipic pentru diferite caractere, se poate afirma c n populaiile forestiere exist un grad foarte mare de variabilitate, ceea ce, comparativ cu plantele cultivate (caracterizate de existena unei nguste variabiliti genetice) reprezint un avantaj enorm privind eficiena unor metode de selecie practicate ntr-un program de ameliorare. Astfel, prin aplicarea seleciei pe termen scurt a unor exemplare de mare valoare i multiplicarea n mas a acestora, pe cale sexuat sau n sistem clonal, prezint o deosebit utilitate n practica silvic. Estimarea gradului de variabilitate n cadrul unei populaii forestiere este astzi din ce n mai precis, graie metodelor tot mai precise i performante, cu precdere cele bazate pe marcheri biochimici i moleculari. Datorit existenei numeroaselor legturi de ordin genetic ntre diferite caractere urmrite n ameliorare, selecia poate avea efecte diferite, n funcie de natur legturilor existente. n funcie de aceasta, pot exista trei situaii: - selecie fr eficien, atunci cnd exist legturi defavorabile ntre anumite caractere urmrite a fi ameliorate; - selecie relativ eficient, atunci cnd sunt legturi puin defavorabile ntre caracterele urmrite; - selecie simultan foarte eficient, dac ntre caracterele vizate nu exist legturi sau acestea sunt favorabile. Din pcate, legturile ce aparin primei categorii sunt cele mai multe ntr-o populaie de arbori i, de aceea, stabilirea unei metodologii adecvate de selecie implic mari riscuri i creeaz multiple probleme amelioratorilor. Evitarea sau reducerea la minimum a apariiei acestor riscuri implic apelarea la metode specifice geneticii cantitative, respectiv evaluarea unor parametrii statistici ca eritabilitatea unui anumit caracter, ecartul tip fenotipic sau coeficientul de corelaie genetic pentru legturile dintre anumite caractere. Populaia de arbori destinat culegerii i interpretrii acestor date i n care se realizeaz ncruciri libere sau controlate ntre indivizi reprezint populaia de informare (I). Cunoaterea acestor parametri ar crea posibilitatea efecturii unei evaluri a eficacitii seleciei, eficacitate exprimat concret prin calcularea ctigului genetic dar i estimarea valorii genotipice a unui arbore, plecnd de la valorile sale fenotipice. B. Stabilirea celor mai valoroase genotipuri Selecionarea celor mai valoroi arbori, pe baza trsturilor lor fenotipice, se face pe parcursul lucrrilor de ngrijire n pdure. Totui, pentru ndeplinirea unui program riguros de ameliorare, este necesar evaluarea exemplarelor selecionate i din punct de vedere al valorii lor genotipice, inclusiv a valorii aditive. Acele populaii care sunt formate din grupuri de arbori, poteniali candidai la selecie, i din care sunt adunate informaii i date privind valorile fenotipice specifice seleciei, constituie populaiile de evaluare (E).

16

n funcie de datele culese, valorile estimate i, innd cont i de legturile dintre caractere, se poate definitiva aciunea de selectare a celor mai valoroase genotipuri. Ansamblul de exemplare rezultat n urma seleciei constituie populaia de ameliorare. C. ncrucirile dintre genotipurile selecionate n acest stadiu al populaiei de ameliorare, selecia se poate opri, iar exemplarele cele mai valoroase pot fi multiplicate intensiv (mai ales n sistem clonal), aceasta constituind sursa de baz n programe de rempduriri. Pe de alt parte, populaia de ameliorare constituit poate reprezenta un punct de plecare pentru o nou ameliorare, aceast populaie devenind practic o nou populaie slbatic. n urma ncrucirilor care se efectueaz ntre indivizii populaiei de ameliorare au loc noi recombinri de gene, rezult noi genotipuri, posesori a noi constelaii de gene, ce pot servi la realizarea altor obiective urmrite n ameliorare. n acest stadiu, cea mai important operaiune este cea de realizare a ncrucirilor controlate. Sistemul vegetativ ar fi acum cu totul contraindicat pentru realizarea unui spor al ctigului genetic, deoarece nu este valorificat potenialul ereditar al noilor forme selectate. Cele trei operaii prezentate (A,B,C) stau la baza formrii unui ciclu de selecie, fiecare etap avnd ca suport specific urmtoarele formaiuni (fig. 4): - dispozitive experimentale cu diferite populaii de arbori; - teste de descendene (pentru populaii de informare i evaluare); - parcuri de clone (pentru populaii de ameliorare) (Lucu, 1998).

Figura 4. Ciclul de selecie (I - populaie de infirmare, E populaie de evaluare) 3.1.4.2. Repetarea ciclurilor de selecie n funcie de obiectivele urmrite n cadrul unui program de ameliorare forestier, dar i de dispozitivul experimental utilizat, vor evolua i tehnicile de selecie, urmarea fireasc fiind separarea populaiei iniiale n mai multe subpopulaii. Acest fapt se datoreaz urmririi n ameliorare a mai multor obiective, cantonate, n prim faz, ntr-un singur dispozitiv experimental. De aceea, principiul de baz n cadrul programelor moderne de ameliorare se refer la repetarea ciclurilor de selecie prin care ctigurile genetice se acumuleaz pe parcursul derulrii ntregului program de ameliorare. De remarcat faptul c pentru fiecare nou ciclu de selecie, populaia de plecare este de fapt populaia de ameliorare a ciclului precedent. Acest tip de selecie se numete selecie recurent intrapopulaional i constituie metoda

17

curent de ameliorare prin selecie a principalelor specii forestiere dar care fixeaz numai efectele aditive (proprii genelor ce controleaz anumite caractere) (fig. 5) O alternativ mai complet a acestui tip de selecie este reprezentat de selecia recurent reciproc, n urma creia populaia de ameliorare iniial este subdivizat n 2 subpopulaii, A i B, ameliorate independent prin selecie recurent normal. Acest subtip de selecie permite valorificarea complet i a efectelor neaditive, acestea din urm constituind baza realizrii unor ctiguri genetice reale n ameliorarea forestier. Acest proces este asigurat prin ncruciarea controlat, la un moment dat, a celor mai bune exemplare din cadrul celor dou subpopulaii, iar rezultantele ar putea fi purttoare a celor mai interesante combinaii de gene ce controleaz caractere urmrite n ameliorare. Un exemplu concludent n acest sens l constituie pinul maritim, specie la care s-a observat c aplicarea seleciei recurente la 2 subpopulaii separate (cea olandez viguroas dar cu form defectuoas i cea corsican mai slab viguroas dar cu form bun) a dus la obinerea unor proveniene constituite din arbori cu cele mai bune rezultate la ncrucirile dirijate (Kremer citat de Lucu 1998).

Figura 5. Repetarea ciclurilor de selecie selecia recurent intrapopulaional (dup Lucu, 1998) 3.1.5. Limitele seleciei Exist dou categorii principale de limite ce pot aprea pe msura repetrii ciclurilor de selecie, respectiv limite genetice i limite metodologice, fiecare categorie avnd un anume grad de impact asupra variabilitii populaiei de ameliorare sau asupra gradului de dificultate al metodologiei utilizate n cadrul programelor de ameliorare forestier. 18

3.1.5.1. Limite genetice i biologice Limitele genetice se fac simite atunci cnd se face o repetare a ciclurilor de selecie timp de mai multe generaii i, n consecin, apare pericolul scderii, uneori drastice, a bazei genetice, n sensul reducerii gradului de heterozigoie i cretere a celui de consangvinizare la nivelul populaiilor de ameliorare i de producie. Creterea gradului de nrudire ntre exemplarele supuse ncrucirilor controlate, n acest caz, devine tot mai evident, pe msura reducerii numrului de indivizi. Instalarea unui nceput de depresiune consangvin este de nedorit i, pentru acest fapt, se pot lua unele msuri de contracarare, ca de exemplu: - alegerea unei populaii de plecare cu un efectiv numeros i un grad mare de heterozigoie; - urmrirea precis a pedigreului n cursul generaiilor msur destul de dificil de realizat dar absolut necesar, mai ales n cazul populaiilor reduse numeric. Din pcate, nc nu este posibil o calculare precis a taliei unei populaii de plecare, ntruct acest lucru depinde de o multitudine de factori, dintre care cei mai importani sunt legai de numrul i natura criteriilor de selecie, de numrul i frecvena genelor implicate n ameliorare i de timpul necesar derulrii programului de selecie. Limitele biologice se fac simite doar n corelaie cu o serie de caracteristici biologice specifice arborilor ca perenitatea sau lungimea generaiilor i, cel mai adesea, ngreuneaz efectuarea unei evaluri i caracterizri mai rapide a genotipurilor existente. n al doilea rnd, acest tip de limite afecteaz rotaia generaiilor, n sensul prelungirii perioadelor de succesiune. 3.1.5.2. Limite metodologice De cele mai multe ori, n stabilirea unei strategii de ameliorare forestier este luat n calcul nsemntatea economic a unei anumite specii de arbore urmrit n programul de ameliorare, precum i evoluia utilizrii varietilor obinute n acest program. Datorit faptului c pe timpul derulrii activitii de ameliorare pe baz de selecie pot aprea, n diferite etape ale programului, noi obiective conexe i contingene exterioare, se recomand ca la iniierea oricrui program s se porneasc cu o palet ct mai larg privind metodele de lucru, fapt ce poate asigura att o anumit suplee a programului pe ansamblu, ct i continuitatea acestuia. Aceste deziderate pot fi atinse n cadrul unui program complex de ameliorare forestier dac se pornete cu un efectiv numeros de exemplare n populaia iniial, coroborat cu o intensitate moderat a seleciei, precum i o divizare a acestei populaii n mai multe subpopulaii n care s se realizeze independent selecia recurent. Acest din urm aspect ar permite o aciune de regionalizare a programului de ameliorare, n funcie de anumite zone ecologice specifice, cu efect benefic asupra unor genotipuri ce prezint o instabilitate intrinsec accentuat. 3.1.6. Strategii de selecie A. Strategii pe termen lung Acest tip de strategii este potrivit pentru unele specii forestiere importante, cu cicluri lungi i foarte lungi de via, utilizate pe scar larg n activiti de mpdurire i rempdurire (stejari, molid sau fag). n cadrul adoptrii acestor strategii, se practic selecia de tip recurent n cadrul unor populaii de ameliorare cu un efectiv de pornire de cel puin cteva sute de indivizi, cu pondere majoritar deinut de arborii plus. Derularea acestor strategii de ameliorare la speciile menionate se face pentru mai multe generaii succesive, cu nfiinare de 19

livezi de semine i realizarea unor varieti policlonale deosebit de valoroase, situaie ce permite i o acumulare nsemnat a ctigului genetic. B. Strategii pe termen mediu Aceste strategii sunt potrivite pentru specii de arbori cu cicluri de via mai scurte dar care sunt utilizate,de asemenea, n activiti de mpdurire i rempdurire. Aici, cele mai potrivite specii de arbori sunt cele care au un efectiv ceva mai redus n populaiile de plecare (pin, cire sau larice), selecia, n acest caz, urmrind caracterizarea exemplarelor sub aspectul capacitii lor de ncruciare dar i prin eficacitatea n sistem clonal, mai ales n ciclul iniial de selecie. Diferitele varieti obinute (hibride, sintetice sau policlonale) asigur, de asemenea, acumularea ctigului genetic de la prima generaie (Lucu, 1998). C. Strategii pe termen scurt n condiiile unui climat cu influene marine sau oceanice, aceste strategii se aplic la unele specii utilizate n aciunea de mpdurire i rempdurire (ex. cedrul) i, n care, selecia conduce la identificarea celor mai valoroase populaii din cadrul unor teste comparative de proveniene, n vederea decelrii acumulrii ctigului genetic. n funcie de specie sau de cerinele economice de moment, aprute n cadrul derulrii unui anumit program de ameliorare forestier, este posibil ca o strategie de durat medie sau chiar scurt de timp s evolueze ntruna de lung perioad. n acest caz, este posibil ca o populaie de ameliorare de la o strategie de termen scurt s se transforme ntruna de plecare la o strategie de termen lung. 3.1.7 Etapele principale ale unui program de selecie Orice program de ameliorare forestier bazat pe selecie va include obligatoriu parcurgerea unor etape importante, dup cum urmeaz: - alegerea provenienelor; - identificarea de populaii semincere; - crearea populaiilor de producie. 3.1.7.1. Alegerea provenienelor n cadrul seleciei, alegerea provenienelor este prima i poate cea mai important etap, ntruct o ameliorare bazat exclusiv pe provenienele locale ar avea un inconvenient major i anume, cel al desfurrii ameliorrii ntr-un ritm mult prea lent, cu creteri mari ale costurilor. Pe de alt parte, nu ntotdeauna provenienele locale sunt cele mai productive i cel mai bine adaptate. n aceste condiii, este extrem de util existena unei solide baze de date (bnci de date) privind inventarierea complet a celor mai valoroase proveniene de la o specie sau alta de arbori. Operaiuni specifice A. Crearea de plantaii comparative de proveniene n cadrul acestei operaiuni apar 3 probleme importante ce trebuie rezolvate: a) Eantionajul provenienelor reprezint operaiunea cea mai dificil deoarece este extrem de dificil de a se stabili cu exactitate zonele de delimitare (unde ncepe i unde se termin arealul unei proveniene), cu att mai mult cu ct, la cele mai importante specii de arbori din punct de vedere economic, arealul natural este foarte ntins. n cadrul acestor areale continue, variaiile majoritii caracterelor sunt gradate (variaii clinale) i, din acest punct de vedere, este foarte dificil de a se fixa exact limitele fiecrei proveniene. n aceste condiii,

20

numrul de proveniene fiind foarte mare, este necesar realizarea unui eantionaj al acestora, n final, alegndu-se cte o provenien din fiecare regiune. b) Stabilirea siturilor experimentale se face cu precdere n regiunile reproductoare cele mai importante dar i n acele zone n care exist posibiliti de apariie a unor interaciuni pedoclimatice puternice. De exemplu, fagul, n aceast privin, este extrem de sensibil la modificri de la nivelul substratului i manifest puternice interaciuni, dup natura calcaroas sau silicioas a substratului, fapt dovedit de existena unor ecotipuri specifice substratului calcaros. c) Alegerea provenienelor se face dup cteva criterii, dintre care cel mai important este cel al adaptrii. Capacitatea de adaptare se apreciaz n funcie de rata de supravieuire, de rezistena la atacuri de boli i duntori sau la factori abiotici nefavorabili (cderi masive de zpad, vnt, ger, ari, etc.). Pe lng estimarea capacitii de adaptare, n alegerea provenienelor se mai ine cont de vigoarea de cretere, dar i de calitatea lemnului. De asemenea, se va avea n vedere plasticitatea, n acest sens preferndu-se provenienele mai puin interactive i care sunt mai uor adaptabile la situri experimentale diverse. B. Alegerea provenienelor n lipsa culturilor comparative n cazul unor specii autohtone sau exotice ale cror culturi sunt relativ bine adaptate, se pot alege provenienele locale care sunt deja bine adaptate i corespund ntrutotul principalului criteriu de selectare a provenienelor. n acest caz nu se mai pune problema apariiei unor eecuri n ceea ce privete eficiena aciunii de ameliorare prin selecie i, n subsidiar, n cadrul arealului natural al speciei se realizeaz conservarea unui fond valoros de germoplasm. C. Introducerea de specii exotice Sunt destul de numeroase situaii cnd are loc introducerea de specii lemnoase exotice n diverse culturi forestiere, ns aici se pune problema efecturii unor testri prealabile pentru a se putea determina gradul de compatibilitate a noilor forme la noile locaii. Efectuarea acestor operaiuni prezint adesea riscuri foarte mari i pierderi pe msur i, de aceea, este obligatorie efectuarea acestor testri, chiar i atunci cnd condiiile din regiunea de origine sunt foarte asemntoare cu cele din regiunea de introducere. n acest mod au fost introduse n Europa mai multe specii lemnoase aduse din Asia sau America, n scopul rentregirii fondului european de specii lemnoase serios afectat de ultima glaciaiune. Astfel s-au introdus mai multe specii de pin, de salcm, platan negru, nuc negru, etc. D. Evaluarea provenienelor Identificarea precis i evaluarea eficient a provenienelor i a variabilitii genetice a arborilor s-au putut realiza doar n urma punerii la punct a metodelor moderne de utilizare a marcherilor biochimici i genetici, n acest fel putndu-se delimita cu precizie diverse populaii i caracteriza provenienele aparinnd diverselor specii forestiere. Analizele complexe de electroforez au permis ca, pe baza studiului izoenzimelor, s se identifice i s se inventarieze numeroase populaii de arbori, precum i originea provenienelor. Stabilirea riguroas i precis a gradului de variabilitate genetic existent n cadrul acestor forme a putut fi realizat n urma perfecionrii tehnicilor de vrf ale tehnologiilor specifice ingineriei genetice. Polimorfismul genetic (al macromoleculei de ADN) s-a putut identifica cu ajutorul metodologiei de analiz a secvenelor ADN (amprente genetice), analiz ce a permis identificarea unui foarte mare numr de loci genici.

21

3.1.7.2. Identificarea populaiilor semincere Arboretele surse de semine sau populaiile semincere sunt reprezentate de comuniti de arbori pure sau de amestec, majoritatea naturale, care se caracterizeaz prin calitate i productivitate (mas lemnoas i fructificare) net superioare altor tipuri de arborete, dar i prin capacitate deosebit de adaptare la condiiile pedoclimatice ale diferitelor tipuri de staiuni. Aceste formaiuni forestiere conin un numr mare de arbori plus i constituie sursa principal pentru iniierea i dezvoltarea programelor de selecie forestier bazate pe selecie, reprezentnd aa numitele populaii de plecare. n urma derulrii amplului program de cartare seminologic la principalele specii forestiere din ara noastr, program iniiat i coordonat de ctre reputatul cercettor silvic Valeriu Enescu n perioada 1965 1970 i reactualizat ntre anii 1972 1973, s-au identificat i selecionat peste 4100 de arborete surse de semine. Dintre acestea, peste 3000 aparin mai multor specii de rinoase (molid, brad, pin, larice), iar restul, de peste 1100, la diferite foioase (fag, cvercinee, plop alb, anin negru, frasin, tei, salcm, etc.). n funcie de origine, provenien, compoziie, clas de producie, categorii de calitate, elagaj, starea fitosanitar, vrst i suprafa ocupat, populaiile semincere din ara noastr se mpart n dou mari categorii: - arborete surse de semine de categoria A (plus) care sunt cele mai valoroase populaii surse de semine i conin cel mai mare numr de arbori plus. Aceste formaiuni forestiere, care constituie i cele mai valoroase surse de germoplasm forestier, au un fond genetic intact i deosebit de valoros, sunt excluse de la tieri i produc mari cantiti de semine elite a cror valoare genetic este din plin confirmat prin culturi comparative de proveniene i teste de descendene. Aceste populaii ocup suprafee limitate, totaliznd cca. 10.000 ha, din care 7000 ha la rinoase i cca. 3000 ha pentru foioase; - arborete surse de semine de categoria B (normale) reprezentate de formaiuni forestiere ce conin populaii de arbori cu semine netestate i ocup aproximativ 100.000 ha, din care 75.000 ha pentru rinoase i cca. 25.000 ha la foioase. Arboretele din prima categorie se pot transforma n rezervaii de semine, cu condiia ca aceste populaii s fie izolate de surse de contaminare cu polen aparinnd unor arbori de calitate inferioar. Izolarea se poate face prin crearea unei benzi de izolare, cu o lime cuprins ntre 300 i maximum 1000 m. Dac acest lucru, din diverse motive, nu se poate nfptui, atunci se procedeaz la extragerea i ndeprtarea exemplarelor de arbori deficitari ca form sau care produc cantiti sczute de semine i de slab calitate (selecie negativ). n interior se mai pot executa i lucrri de ngrijire sau rriri adecvate i de refacere. 3.1.7.3. Crearea populaiilor de producie (plantaii semincere, plantaje) Materialul biologic obinut n urma aplicrii programului de selecie constituie un material deosebit de valoros din punct de vedere genetic i se impune multiplicarea masiv a acestuia pentru obinerea populaiilor de producie de semine sau de butai. Aceste tipuri de formaiuni forestiere sunt principalii furnizori de material biologic (semine, butai, altoaie) forestier de calitate necesar rempduririi. Principalele tipuri de livezi de semine din ara noastr au fost i sunt nfiinate n funcie de sistemul de reproducere utilizat, respectiv reproducere sexuat prin care seminele determin o mrire considerabil a frecvenei genelor cu efect favorabil sau sistem clonal (n special butai) ce asigur o pstrare integral a genotipurilor valoroase selectate. Acest ultim sistem se aplic ns la un numr limitat de specii (unele foioase cu o predilecie intrinsec pentru producerea de butai sau drajoni) i la un numr redus de indivizi (fig. 8).

22

n figura de mai jos sunt redate schematic cele mai reprezentative tipuri de livezi de semine, n funcie de sistemul de reproducere care st la baza crerii acestor populaii forestiere. 1. Livezi de semine n sistem vegetativ (plantaje n sistem clonal) a) Livezile de clone (parcuri de clone) sunt plantaje formate din mai puine exemplare (se instaleaz cu densitate mic de 200 pn la max. 500 arbori/ha) i rezult din butai sau grefe recoltate de la indivizi extrem de valoroi (arbori plus), selecionai n funcie de valoarea lor fenotipic i genotipic. Este recomandat ca la nfiinarea unei astfel de arboret s se porneasc cu material clonal provenit de la minimum 30 de surse nenrudite, n scopul meninerii unui grad ct mai mare de heterozigoie i de a se evita, n acest fel, apariia oricrui semn al presiunii de consangvinizare. b) Livezi de clone pentru hibridare (livezi de semine biclonale) sunt livezi instalate pentru a se obine hibrizi interspecifici, prin polenizri libere sau controlate, arbori cu o puternic manifestare a fenomenului de heterozis. Exemplarele donatoare de material clonal sunt selecionate dintre cele care au dovedit, n prealabil, o deosebit capacitate de combinare i au semine performante i n ceea ce privete capacitatea de germinaie.

Figura 6. Tipuri de livezi de semine (dup Lucu, 1998) 2. Livezi de semine n sistem de reproducere sexuat Tipurile de livezi de semine din aceast categorie au n compoziia lor un numr mare i foarte mare de indivizi, la instalarea acestora pornindu-se cu densiti cuprinse ntre 2500 i 4000 de arbori/ha. a) Livezi de descendene materne (plantaje de semifrai) sunt acele livezi n care indivizii provin din semine recoltate de la arbori plus i sunt rezultatul unei polenizri libere, cunoscndu-se numai genitorul de pe linie matern. Este recomandat nfiinarea acestui tip de livezi de semine pentru unele specii de arbori la care polenizarea controlat este dificil de realizat (arari, stejari).

23

b) Livezi de familii cu repetiii sunt plantaje ce conin n compoziia lor indivizi ce provin din polenizri dirijate. c) Livezi de descendene biparentale (plantaje de frai buni) sunt plantajele cele mai performante pentru unele specii importante (molid, pin silvestru, larice, brad, mesteacn, plopi) i, la care, polenizarea controlat se realizeaz destul de uor. Aici, arborii provin din ncruciri controlate ntre prini cunoscui att pe linie matern, ct i pe linie patern. 3.2. Hibridarea n sens strict genetic, hibridarea reprezint procesul prin care se realizeaz contopirea a dou informaii ereditare diferite n urma unirii gameilor la fecundare (Bra, 1996). Hibridarea poate fi intraspecific, atunci cnd descendena apare prin ncruciarea unor indivizi aparinnd la rase, soiuri sau populaii diferite ale aceleai specii sau interspecific, n situaia cnd descendena rezult n urma ncrucirii dintre indivizi aparinnd unor specii diferite. n cazuri mult mai rare, descendena apare n urma ncrucirilor ntre indivizi ce aparin la genuri diferite i, n acest caz, avem tipul de hibridare intergeneric. La aceste ultime dou tipuri de hibridare, descendenii rezultai au diferite probleme legate n special de fertilitate dar, mai ales, de viabilitate sczut, situaie ntlnit cel mai frecvent la hibrizii intergenerici. Acest impediment se datoreaz, n principal, unor cauze de ordin genetic, dintre care cele mai importante sunt: - complex de gene care provoac o dezvoltare anormal; - diferene ntre cromozomii provenii de la cei doi prini ndeprtai taxonomic i filogenetic; - factori citoplasmatici care compromit dezvoltarea normal i fertilitatea hibrizilor. 3.2.1. Principii generale privind aplicarea tehnicilor de hibridare Pe baza celor prezentate mai sus i innd cont de complexitatea trsturilor genetice ale arborilor, n practica ameliorrii silvice bazat al crui program include i lucrri de hibridare se va ine cont i se vor respecta, n mod obligatoriu, unele norme i principii, fapt ce poate asigura succesul acestui program. 1. Evaluarea posibilitilor de hibridare interspecific ntre diferite specii de arbori este foarte necesar ntruct, din totalul hibrizilor interspecifici, doar max. 20% produc semine fertile. n cazul majoritii speciilor de arbori, hibridarea interspecific este imposibil de realizat deoarece, din cauza distanei de ordin taxonomic, exist mari diferene de structur ale aparatelor reproductoare i neconcordane ale perioadelor de receptivitate maxim n maturarea elementelor sexuale ale inflorescenelor mascule i femele. Toate acestea constituie elemente care stau la baza manifestrii fenomenului incompatibilitii la nivelul florilor sau al polenului. 2. Studiul repartiiei naturale a speciilor de arbori este extrem de util, cu att mai mult cu ct sunt cazuri destul de numeroase cnd dou specii care ocup aceiai staiune nu hibridizeaz ntre ele. Acelai fenomen se constat i n situaia cnd dou specii diferite sunt nvecinate sau parial suprapuse, susceptibilitatea la polenizare fiind foarte redus. 3. Efectuarea unei selecii foarte riguroase a exemplarelor parentale naintea oricrei polenizri este foarte necesar, ntruct exist pericolul ca la hibridri s participe i polen nedorit ce ar aparine unor exemplare cu unele caractere defavorabile.

24

4. Efectuarea testelor de pepinier i de teren a hibrizilor rezultai este imperios necesar pentru a se efectua un control timpuriu asupra rezultatelor i de a se urmri comportarea ulterioar a hibrizilor naturali sau artificiali obinui. 5. Selectarea i multiplicarea intensiv a celor mai valoroi hibrizi se poate face prin refacerea celor mai performante hibridri i nmulirea ulterioar (n sistem clonal intensiv) a descendenei valoroase rezultate sau o combinare a celor dou modaliti. 3.2.2. Criterii i modaliti concrete de hibridare I. Dup modul n se produc: a) hibridarea natural reprezint calea cea mai rspndit prin care se realizeaz polenizarea i care se produce fr intervenia dirijat a omului. Acest tip de hibridare este specific, n primul rnd, speciilor alogame i reprezint fecundarea ncruciat caracteristic multor specii forestiere importante (rinoase, fagacee). b) hibridarea artificial se face cu intervenia omului n cadrul lucrrilor de ameliorare forestier i se practic prin efectuarea de polenizri controlate (dirijate) la specii autogame i alogame. II. Dup tipul de polenizare a exemplarelor materne a) hibridarea liber - se efectueaz la specii auto dar i la cele alogame. La primele are loc, n prealabil, operaiunea de castrare (ndeprtarea mecanic a inflorescenelor mascule la exemplarele stabilite drept componente materne). Polenul provenit de la una sau mai multe forme paterne este purtat i depus cu ajutorul vntului sau a insectelor polenizatoare. n livezile de semine create i amenajate pe spaii mai mari, acest tip de hibridare s-a dovedit a fi cel mai eficient n obinerea unor varieti sintetice. b) hibridarea semiliber are loc n condiiile izolrii plantei mam, cu flori castrate i sub un cort special, cu polen recoltat de le exemplarul patern i care este mprtiat liber sub cortul de izolare. c) hibridarea forat - se realizeaz prin polenizarea forat a inflorescenelor femele de pe exemplarul matern, operaiune urmat imediat de acoperirea i izolarea cu pungi de hrtie sau plastic a inflorescenelor polenizate. III. Dup numrul i natura genitorilor care iau parte la hibridare a) hibridarea simpl se produce atunci cnd are loc polenizarea ntre doi indivizi (prini homozigoi). La arbori, situaia este mult mai complex, n sensul c, spre deosebire de speciile cultivate, indivizii genitori sunt heterozigoi pentru majoritatea caracterelor, dar i n acest caz, descendenii din prima generaie manifest un grad deosebit de heterozis. (AXB) b) hibridarea dubl are loc atunci cnd hibridul provine din fuziunea gameilor ce aparin la doi hibrizi simpli, ns fenomenul de heterozis este mai puin accentuat dect n cazul precedent. (AXB)X(CXD). c) hibridarea repetat (backcross) mai este cunoscut i sub numele de ncruciare repetat i are loc atunci cnd se ncrucieaz un hibrid din F1 cu una din formele parentale. Acest tip de hibridare s-a dovedit extrem de util i eficient n cazul cnd se urmrete creterea rezistenei la atacul unor boli i chiar duntori dar i n de ndeprtare a unei trsturi nedorite de la o form valoroas obinut n cadrul procesului de ameliorare. AXB=AB, ABXA=(AB)A1. d) hibridarea reciproc se produce ntre dou forme parentale care pot fi, pe rnd, fie forme paterne, fie forme materne. De menionat faptul c hibrizii care rezult nu sunt identici datorit influenei factorilor ereditari extranucleari (citoplasmatici) de la gameii femeli. A(F)X B(M)=AB, B(F)X A(M)=BA, ABBA. 25

e) hibridarea ciclic const n ncruciarea unei forme parentale (considerat ca analizator) cu toate celelalte forme. BXA, CXA, DXA, etc. f) hibridarea dialel este o form de hibridare utilizat i n practica silvic, n care mai multe forme parentale, cu constituie genetic diferit, sunt ncruciate n toate combinaiile posibile. Acest tip de ncruciare se dovedete extrem de util n cazul cnd se urmrete ameliorarea caracterelor cantitative, deoarece se scurteaz mult timpul necesar alegerii genitorilor. AXB, AXC, AXD, AXE; BXC, BXD, BXE; CXD, CXE; DXE. g) hibridarea complex reprezint ncruciarea ntre o form materne cu amestec de polen aparinnd mai multor genitori paterni. A(F) X (B+C+C+D+E). 3.2.3. Particulariti ale reproducerii sexuate la arbori 3.2.3.1. Aspecte teoretice i practice asupra nfloririi i fructificaiei la arbori esutul meristematic nedifereniat din care se va forma floarea este situat n axila frunzelor i dezvoltarea acestuia va depinde, n mare msur, de influena unor factori externi sau interni. n prima categorie, temperatura i lumina joac un rol de prim nsemntate. Primveri i veri mai calde sau mai rcoroase, ori o intensitate mai mare sau mai mic a luminii, vor determina creterea sau, dimpotriv, scderea capacitii de nflorire i de fructificare la majoritatea speciilor de arbori. n cadrul celei de-a II a categorii, aplicarea unor tratamente externe experimentale cu fitoregulatori de cretere (auxine i gibereline), n diferite concentraii, la exemplare aparinnd mai multor specii de conifere (Larix, Tsuga, Picea, Pinus), a condus la obinerea unor rezultate promitoare, cu condiia ca aplicarea acestor tratamente s fie ntr-o strict concordan cu fazele de dezvoltare ale fiecrui exemplar, cu vrsta, precum i n funcie de condiiile specifice climatice n anii de studiu. 3.2.3.2. Fenomenul de incompatibilitate interspecific n ameliorarea forestier Factorii care limiteaz sau fac imposibil polenizarea artificial ntre exemplare aparinnd unor specii diferite de arbori sunt legai n primul rnd de diferenele de ordin morfologic la nivelul florilor. Dup cum se cunoate, la gimnosperme, ovulul este la vedere i, n faza de receptivitate maxim (destul de scurt, de doar 2,3 zile), polenul purtat de vnt este colectat i poate avea loc polenizarea. Dificultile intervin la efectuarea polenizrii artificiale la 2 specii diferite, la care nu se suprapun perioadele de receptivitate (ex. specii de pin i larice). n acest caz, este necesar ca polenul uneia dintre cele dou specii s fie colectat i pstrat n condiii care s asigure meninerea viabilitii materialului pentru perioade limitate de timp. Mecanismul incompatibilitii propriu-zise nc nu este elucidat pe deplin, dar cunotine destul de avansate n domeniu sunt semnalate la unele specii de angiosperme. Astfel, la plop se cunosc mult mai n detaliu mecanismele intime (semnale biochimice) ale acestui fenomen, respectiv prezena unor molecule de pe suprafaa polenului i a stigmatului. Aceste molecule se constituie ntr-un adevrat decodor biochimic prin care polenul depus pe stigmat este respins sau, dimpotriv, acceptat. n acest din urm caz, polenul germineaz i se poate realiza fecundarea ovulului. S-au semnalat situaii (ex. la teste de hibridare ntre dou specii de plop) cnd germinarea grunciorilor de polen s-a oprit la jumtatea stilului. Tot de incompatibilitate

26

putem vorbi i n situaia avortrii brute a embrionilor abia rezultai n urma unor fecundri interspecifice. Toate aceste constatri au determinat pe specialitii n domeniul ameliorrii genetice forestiere s efectueze o serie de cercetri, iar primele rezultate ncurajatoare pe linia eliminrii efectelor acestui fenomen nedorit au aprut la sfritul deceniului 7, secolul trecut. n acest sens, cea mai notabil realizare experimental n domeniu s-a nregistrat la efectuarea unor teste pe diferite specii de plop, cea mai cunoscut fiind efectul Mentor. Tehnica este destul de simpl i pornete de la dou probe iniiale de polen, unul compatibil dar cu nuclei spermatici inactivai i, cea de-a II-a, cu polen incompatibil dar cu nuclei spermatici normali. Amestecul celor dou probe de polen a fost depus pe stigmatul unei flori femele, iar germinarea polenului compatibil a determinat formarea tuburilor polenice i la nivelul materialului incompatibil. Evident, pn la urm, fecundarea s-a realizat doar din direcia polenului incompatibil, ntruct numai acesta prezenta nuclei spermatici normali. La gimnosperme, aplicarea acestei metode nu a dus la obinerea unor rezultate promitoare ca n cazul plopului i, de aceea, s-au ncercat i alte variante experimentale n vederea suprimrii efectului de incompatibilitate ce apare frecvent la polenizrile interspecifice. Una dintre cele mai utilizate tehnici a fost aceea de aplicare a unor solveni organici pe suprafaa stigmatului. Rezultatele ns au fost mult mai modeste i, n rarele cazuri de reuit (ex. hibridri ntre unele specii ale genului Pinus), seminele rezultate au fost n mare msur sterile sau, n alte cazuri, tuburile polenice nu ajuns dect pn la un punct intermediar al esutului femel. La molid, doar prin aplicarea efectului Mentor, s-au obinut unele rezultate pozitive n realizarea de hibridri interspecifice. 3.2.3.3. Explicarea fenomenului de androsterilitate Asemenea multor specii de plante din flora ierboas (spontan i cultivat) i la diferite specii lemnoase apare frecvent fenomenul de androsterilitate, respectiv forme fr polen sau cu polen steril. Cauza major a manifestrii acestui fenomen se poate explica prin defectele aprute n formarea unor elemente la nivelul organelor florale mascule (antere deformate, vide, indehiscente, producere de polen neviabil) sau prin absena anterelor. Aceste exemplare s-au dovedit ns extrem de utile n practica ameliorrii forestiere prin faptul c aceti indivizi, n calitate de genitori materni, pot produce descendeni (hibrizi) cu un pronunat fenomen de heterozis, evitndu-se operaii complicate i stresante de castrare. n ceea ce privete stabilirea originii acestui fenomen, cercettorii n domeniu au cutat s elucideze i s dea mai multe explicaii, pornind de la teoria conform creia androsterilitatea are cauze genetice i ar depinde de gene localizate n nucleu, (recesive), n citoplasm dar i n urma unor interaciuni nucleo-citoplasmatice. Pornind de la aceast premiz, de-a lungul timpului s-au formulat mai multe teorii (ipoteze) cu privire la apariia i manifestarea fenomenului de androsterilitate. 1. Ipoteza apariiei spontane se bazeaz pe explicaia instabilitii ereditii extranucleare, iar plantele (inclusiv arbori) androsterile sunt meninute n interiorul unei populaii. 2. Ipoteza apariiei n momentul efecturii ncrucirilor este susinut prin apariia unor exemplare androsterile n cadrul unor ncruciri interpecifice sau intergenerice (ntre gru i secar). 3. Ipoteza apariiei la inducerea mutagenezei care este demonstrat prin apariia de indivizi androsterili n urma efecturii de tratamente prealabile cu diferii factori mutageni (chimici/colchicin sau fizici/radiaii) a exemplarelor selectate.

27

4. Ipoteza viral se bazeaz pe faptul c la o serie de plante androsterile (ex. la exemplare aparinnd genului Vicia) au fost descoperii corpusculi mici cu dou molecule de ARN. Prin marea lor asemnare cu virusurile, aceste particule sferice au i fost denumite pseudovirusuri, fiind depistate n numr mare n esuturile androsterile. 5. Ipoteza mitocondrial este, se pare, teoria cea mai avansat i se bucur, n prezent, de o tot mai larg credibilitate n domeniu. Dup cum bine se cunoate, mitocondria joac un rol decisiv n etapa de formare a gameilor, prin energia ce o pune la dispoziia ntregului proces de gametogenez. n urma efecturii unor cercetri mai aprofundate, s-a putut ntocmi o list de argumente tiinifice ce susin aceast ipotez. Astfel: - exist diferene notabile n ceea ce privete cantitile unor constitueni membranari de la nivelul mitocondriilor ntre exemplarele androsterile i cele normale; - s-a descoperit o rearanjare a secvenelor ADN-ului mitocondrial de la plantele androsterile, comparativ cu cel de la exemplarele normale; - n cadrul fuziunii protoplatilor are loc un transfer al androsterilitii prin asociere cu un anumit segment al ADN-ului mitocondrial; - s-a demonstrat existena unor diferene ntre catenele polipeptidice (sintetizate in vitro) de la plante androsterile i cele fertile. Este evident faptul c, separat, o teorie sau alta nu poate elucida acest fenomen i, prin urmare, determinismul androsterilitii este nc departe de a fi complet lmurit. Numai descifrarea tuturor mecanismelor de la nivel molecular ar putea crea o baz cert privind elaborarea unei viitoare teorii complete asupra acestui fenomen. IV. METODE MODERNE (NECONVENIONALE) DE AMELIORARE FORESTIER nainte de a fi prezentat pe larg acest capitol, trebuie precizat faptul c problematica ameliorrii forestiere n prezent dar, mai ales, n viitor este recomandabil s se raporteze i la elemente specifice problematicii resurselor genetice forestiere. Aceste aspecte sunt n concordan cu ultimele reglementri naionale i internaionale i constituie, n prezent, elemente de baz n cadrul unor etape distincte ale programelor de ameliorare pentru cele mai importante specii forestiere. Utilizarea poliploizilor naturali sau artificiali a constituit obiectul unor studii intense efectuate n Suedia (Ekebo) sau n Germania (Hamburg), n perioada 1930 1960 (Nanson, 2005). Experienele privind iradierea unor plante tinere cu radiaii ionizante puternice (, , ) au condus ns la obinerea unor rezultate extrem de nefavorabile, fapt ce a determinat abandonarea, n foarte mare msur, a utilizrii acestor tehnici experimentale n genetica forestier. Msura s-a dovedit pe deplin justificat, cu att mai mult cu ct majoritatea speciilor de arbori dein o variabilitate natural la cote foarte nalte i au cicluri de via foarte lungi comparativ cu speciile ierboase. ncepnd cu anii `90 ai mileniului trecut, cercetrile n domeniul ingineriei genetice i punerea la punct a diverselor tehnici moderne de explorare a variabilitii au creat posibiliti concrete de modificare a garniturii genetice i ncorporarea de transgene la unele specii de arbori (ex. specii de plop), noile forme putnd fi ulterior multiplicate n sistem vegetativ. Recentele dezbateri privind necesitatea i oportunitatea extinderii utilizrii unor varieti transgenice (organisme modificate genetic - OMG) i n practica silvic suscit nc multiple 28

controverse, innd cont de complexitatea structurii arborilor (inclusiv structura echipamentului genetic) i de ciclurile lor lungi de via. Totui, trebuie recunoscut interesul enorm pe care l manifest cercettorii n acest nou domeniu, acesta putnd oferi oportuniti nc nebnuite n ceea ce privete realizarea unor forme de arbori cu caractere excepionale pentru practica de ameliorare silvic. 4.1. Mutageneza i implicaiile practice n ameliorarea arborilor n prezent, inducerea experimental a mutagenezei este nc pe larg utilizat n practica ameliorrii speciilor cultivate i n pomicultur. n zootehnie, procedeul este mult limitat datorit unei mult mai mari rigori privind determinismul cromozomial al sexelor i a complexitii structurale a organismelor animale. 4.1.1. Interesul obinerii de varieti poliploide la speciile forestiere n sens larg, poliploizii sunt indivizi posesori a mai mult de 2 seturi cromozomiale (3n triploizi, 4n tetraploizi, etc.) i, la anumite specii vegetale, aceast stare legat de noua garnitur cromozomial ofer un optim fiziologic adaptiv i productiv acestor varieti (ex. Triticum sp.). La arbori, n marea majoritate a cazurilor, optimul fiziologic este conferit de starea normal de diploidie (2n) (n special la rinoase). Totui, n urma cercetrilor efectuate n experimente de inducere a mutagenezei, s-a ajuns la concluzia c la unele specii de foioase (ex. plop tremurtor), crearea facil a unor forme triploide s-a dovedit a fi un real ctig pe linia ameliorrii acestor specii, mai ales n privina acumulrilor bioproductive i a ritmului de cretere. Obinerea de forme poliploide la unele specii forestiere este posibil prin aplicarea unor metode experimentale, dintre care cele mai utilizate sunt cele chimice i biologice. Metodele biologice presupun regenerri de ramuri sau tulpini dup tierea lor sau aplicarea unor tratamente speciale cu diferii parazii pe vrfurile de cretere. Aceste tehnici au totui un caracter mai restrictiv, rezultate notabile fiind nregistrate mai mult n pomicultur. Mult mai pe larg utilizate sunt tratamentele chimice, n acest sens, cel mai intens aplicat agent chimic fiind colchicina, alcaloid extras din brndua de toamn (Colchicum autumnale). Aceasta se prepar sub form de soluii, de diferite concentraii (acestea nu depesc ns 0,5%), care se aplic pe vrfuri de cretere. O alt modalitate mult mai comod i eficient este cea de imersare a seminelor, pe diferite perioade de timp, n soluia de colchicin. Recunoaterea exemplarelor poliploide rezultate se face prin nregistrarea anumitor particulariti morfologice (dup specie) dar, mai ales, dup efectuarea unor teste i observaii citogenetice (analize microscopice). 4.1.2. Obinerea de poliploizi la rinoase Ca i n cazul utilizrii altor metode moderne privind modificarea structural i funcional a echipamentului genetic, rinoasele rspund, n general, mult mai greu la aplicarea tratamentelor chimice specifice, comparativ cu multe dintre speciile de foioase. n cadrul inducerii experimentale a mutagenezei, la tratamentele cu soluii de colchicin aplicate seminelor (imersare la concentraie de 0,2%, umectare n faza de germinaie a seminelor la o concentraie de 0,4%, respectiv cultur de embrioni pe medii cu colchicin) s-au obinut, cu relativ dificultate, serii de poliploizi i unele exemplare de 29

mixoploizi la specii ale genurilor Abies i Pinus. Indivizii poliploizi obinui au prezentat ns creteri mult mai slabe, comparativ cu indivizii normali diploizi (un evident fenomen de nanism), noile forme avnd ramuri groase i ace mai scurte. Adesea, la aceste exemplare se remarc i lipsa nfloririi. Puiei colchicinizai s-au mai obinut i la molid, ns numrul acestora a fost mult mai redus. Dup cum se cunoate, rinoasele, comparativ cu foioasele, sunt specii lemnoase mult mai vechi, cu o mare dezvoltare n mezozoic (au o vechime de peste 300 milioane de ani) i, n consecin, structura lor genetic este de foarte mult timp stabilizat. Din acest motiv, gimnospermele au optimul metabolic i adaptiv n stare de diploidie, pe cnd poliploizii acestora sunt pitici, nu nfloresc i adesea nici nu supravieuiesc. n concluzie, se poate afirma c inducerea poliploidiei la specii de rinoase nu prezint interes din punct de vedere economic al ameliorrii forestiere, puinele forme poliploide obinute interesnd doar din punct de vedere estetic i ornamental. 4.1.3. Obinerea de poliploizi la foioase La o serie de specii foioase de arbori, inducerea mutagenezei a atins o nalt cot privind performanele cantitative i calitative i, n consecin, n practica de ameliorare a acestor forme i varieti, mutageneza dovedete mari disponibiliti i practici extrem de performante. Astfel, cazul plopului tremurtor a devenit, de ceva vreme, de mare notorietate, pornind de la utilizarea formelor naturale de poliploizi sau de inducere i obinere artificial a triploizilor cu mare randament de cretere i potenial de adaptare. De exemplu, n Suedia, n cadrul unor populaii de plopi tremurtor, exemplarele de triploizi depesc indivizii normali (2n) cu cca. 14% la nlime i cu peste 50% n volum. Producerea de plopi tremurtori triploizi 1) Plecnd de la triploizi naturali n cadrul unei populaii, plopii tremurtori triploizi produc gamei n i 2n (mai rar 3n) i se ncrucieaz cu indivizi diploizi care produc numai gamei n, rezultnd descendeni diferii ca grad de ploidie (2n, 3n i mai rar 4n) (fig. 7). Indivizii tetraploizi sunt de mic nlime i fr vigoare, ceea ce indic faptul c s-a depit optimul de 3n. Totui, aceti indivizi sunt utilizai la ncruciarea cu exemplare normale diploide, n vederea obinerii de noi triploizi. Acetia sunt autotriploizi, deoarece provin din indivizi aparinnd aceleai specii.

Figura 7. Producerea artificial de triploizi la plopul tremurtor (dup Nanson, 2005) 30

2) Plecnd de la triploizi artificiali Indivizii triploizi naturali sunt destul de rari i au o fertilitate sczut, aceste manifestri fiind datorate probabil garniturii cromozomiale relativ instabile. Acest lucru i-a determinat pe cercettorii din Suedia, de exemplu, s recurg la producerea artificial i utilizarea tetraploizilor prin tehnica colchicinizrii (fig. 7). n acest sens, semine de plop diploid au fost aezate n plci Petri, pe hrtie de filtru impregnat cu soluie de colchicin 0,2% n urma aplicrii acestui tratament, a rezultat un numr redus de plantule tetraploide de plop i un anumit procent de plante mixoploide (indivizi diploizi ce conin n structura lor anumite esuturi tetraploide). Cel mai important aspect este ca, la final, esuturile generatoare de flori s fie tetraploide. Dup cretere, nflorire i selecie, prinii tetraploizi se ncrucieaz cu exemplare diploide, rezultnd triploizi n sistem regulat. n Germania, Froelich i Illies au obinut triploizi, reuind ncruciarea ntre exemplare 4n de Populus tremula i indivizi 2n de Populus tremuloides (specie american). n acest fel au fost obinui alotriploizi, indivizi ce se caracterizeaz prin creteri rapide, vigoare deosebit, precum i o bun rezisten la boli i duntori. Din aceste motive, formele obinute au fost trecute ntr-un sistem clonal intensiv de multiplicare, utilizndu-se experimental micropropagarea (multiplicarea n mas in vitro). (fig. 8). Extinderea metodologiei utilizrii i obinerii de poliploizi s-a materializat prin aplicarea acestei tehnici i la alte specii de foioase, cum ar fi, n principal, la alun i mesteacn. Astfel, dup Gathy, pe la mijlocul anilor 50 ai secolului trecut, n pdurile din Suedia au fost depistate 5 exemplare de mesteacn triploid, unul dintre ele msurnd cca. 26 m n nlime, la o vrst de 25 ani. Exemplarele tetraploide, obinute n urma ncrucirii dintre indivizi 2n i 4n (max. 1% din descenden), sunt mai puin viguroase i cu numeroase defecte de form, comparativ cu triploizii din aceeai generaie. n natur, aceti indivizi sunt eliminai rapid prin aciunea seleciei naturale, de unde i explicarea absenei acestora n pduri, la vrste mai naintate. n schimb, exemplarele triploide au dovedit cam aceeai vigoare i capacitate de cretere ca i n cazul diploizilor normali.

Figura 8. Hibrizi alotriploizi Astriade Populus tremuloides x Populus tremula (vitroplante n pepinier) (dup Nanson, 2005)

31

n cazul genului Alnus, s-a dovedit faptul c formele de alotriploizi, rezultate n urma ncrucirii dintre Alnus rubra 2n i Alnus glutinosa 4n, au avut o cretere excelent. O situaie asemntoare s-a observat i n cazul unor autotriploizi de Betula verrucosa. 4.1.4. Mutaii genice i cromozomiale la speciile forestiere Din experiena destul de vast acumulat n practica ameliorrii speciilor cultivate sau ierboase, mutaiile genice i cromozomiale (deleii, inversii, duplicaii sau translocaii) sunt destul de frecvente, ns depistarea acestora la speciile forestiere este foarte dificil de realizat. n acest sens, exist extrem de puine realizri i date att n ceea ce privete depistarea unor mutante, ct i inducere experimental a acestor tipuri de mutaii. De exemplu, apariia unor exemplare cu deficiene ale sistemului clorofilian ar fi, se pare, datorat unor mutaii cromozomiale. Pe de alt parte, n natur au fost identificate cteva situaii punctuale referitor la apariia unor mutani naturali, cum ar fi la brad (mutani cu coroan piramidal), la duglas (mutani cu ramuri n form de mtur) sau la salcm (forme mutante cu tulpini trtoare). De asemenea, la alte specii lemnoase s-au identificat forme mutante cu frunze variegate. n general, mutaiile sunt mai uor de depistat la formele haploide, naturale sau obinute experimental prin andro i ginogenez, deoarece aceste forme au n structura lor ereditar doar o singur garnitur cromozomial, iar n fenotip, efectele se manifest n prima generaie, inclusiv n cazul mutaiilor recesive. n multe situaii, exemplarele mutante i-au dovedit din plin utilitatea n cadrul procesului de ameliorare a diferitelor specii i varieti lemnoase, indivizii n cauz constituind un valoros material de plecare n cadrul unor cicluri mai ample de selecie i hibridare. Prin utilizarea acestor forme se scurteaz foarte mult durata de timp necesar derulrii acestor etape importante ale procesului de ameliorare. De asemenea, prin utilizarea unor mutani se pot obine mai uor indivizi mai rezisteni la aciunea nociv a diferiilor factori biotici i abiotici.

32

AMELIORAREA ARBORILOR PRIN BIOTEHNOLOGII I INGINERIE GENETIC Conceptul de inginerie genetic reflect, la modul cel mai sintetic, dezvoltarea impetuoas a domeniului de vrf n genetica i biologia modern, urmare fireasc a marilor descoperiri efectuate n ultimele decenii n domeniul biochimiei i geneticii moleculare. Pe de alt parte, nevoile crescnde ale societii umane privind sporirea i diversificarea permanent a gamei de produi alimentari, precum i necesitatea gsirii de noi i tot mai eficiente tratamente legate de profilaxia multor maladii genetice grave, inclusiv a cancerului, constituie motivaii extrem de puternice privind avntul spectaculos al acestui nou domeniu. La modul cel mai concret posibil, ingineria genetic poate fi definit ca un ansamblu de metode i tehnici care poate face posibil manipularea materialului genetic la nivel molecular, n sensul modificrii structurii macromoleculei de ADN, respectiv de izolare, sintez artificial i transfer de gene la alte organisme, unele foarte ndeprtate din punct de vedere taxonomic i filogenetic. n acest mod, se poate trece foarte uor peste aceste bariere i se poate obine rapid un nou organism, pornind de la o singur celul, esut sau fragment de organ. Unele dintre aceste metode, datorit eficienei i rapiditii extraordinare de dezvoltare, au putut fi trecute n regim industrial, acestea constituind noile ramuri ale biotehnologiilor. Ne referim aici, mai cu seam, la tehnica micropropagrii (multiplicarea in vitro a celulor i esuturilor vegetale), la obinerea de protoplati i hibridarea somatic a organismelor vegetale, sau obinerea la scar industrial de semine artificiale, inclusiv pentru specii forestiere. Trebuie menionat faptul c i silvicultura (mai ales n domeniul ameliorrii) a adoptat unele dintre metodele i tehnicile acestui nou domeniu, n scopul mbuntirii nsuirilor ereditare ale celor mai importante specii forestiere. Una dintre cele mai utilizate tehnici n domeniu o constituie cultura in vitro de celule i esuturi vegetale. 4.2. Cultura in vitro de celule i esuturi vegetale Prin cultura in vitro de celule i esuturi vegetale se nelege detaarea unei celule sau a unui meristem apical (explant) de pe o plant donatoare, cultivarea acestora pe un mediu sintetic aseptic (n condiii controlate de temperatur i lumin) i obinerea de noi organisme, precum i multiplicarea acestora. Reuita acestei metode se bazeaz pe totipotena celulei vegetale, n sensul c explantul (celula sau esutul meristematic) este o unitate vie, independent de locul de origine, care deine ntreaga cantitate de informaie genetic preluat de la planta mam i poate regenera o nou plant. Faptul c ntr-un timp relativ scurt (n mai puin de un an) se pot obine prin micropropagare milioane de exemplare (copii fidele ale plantei donatoare), forme care n condiii obinuite s-ar obine foarte greu sau nu ar putea supravieui, reprezint un ctig enorm privind eficiena i implicaiile practice ale acestei metode n ameliorarea multor i importante specii forestiere. De asemenea, prelevarea i cultura in vitro de meristeme asigur obinerea i multiplicarea unui material biologic sntos, liber de virui.

4.2.1. Specificul activitii ntr-un laborator de culturi in vitro Laboratorul propriu-zis este ncperea unde se prepar mediile de cultur. n acest scop, aceast ncpere trebuie s fie suficient de spaioas i iluminat corespunztor, cu instalaii de ap i canalizare curent, reea de electricitate i gaz. Camera de cretere este ncperea cea mai important i caracteristic oricrui laborator de culturi in vitro, n care explantele inoculate pe medii sintetice aseptice cresc i se dezvolt pentru multiplicare. n acest scop, camerele de cretere sunt dotate cu sistem automatizat de climatizare, asigurndu-se un regim controlat de temperatur (20-25oC) i umiditate (5060%). Iluminatul (3200-5000 lx) este furnizat de lumina alb i rece a tuburilor fluorescente, montate la partea superioar a etajerelor pe care sunt aezate culturile (la cca. 40 cm deasupra) (fig. 9). Meninerea la lumin a culturilor se face prin poziionarea lor vertical sau uor nclinat. Fotoperioada optim de16 ore lumin i 8 ore ntuneric pe zi este necesar stimulrii progresive adecvate a caulogenezei i rizogenezei in vitro la explantele majoritii speciilor vegetale. Zona aseptic sau camera steril este ncperea n care se execut sterilizarea, prelevarea, inocularea explantului pe mediu de cultur i multiplicarea (micropropagarea) materialului biologic obinut. Toate aceste operaiuni se execut la hota cu flux laminar de are steril (fig. 10). Pe ct posibil, aceast ncpere va fi ct mai izolat de restul camerelor laboratorului i este indicat s fie aezat n apropierea zonei de preparare a mediilor. n reuita cultivrii explantelor vegetale pe medii aseptice, un rol foarte important revine mediilor de cultur, prin compoziia lor chimic, natura elementelor chimice din substrat i proporia acestora, epuizarea preferenial a unor compui sau concentrarea altora.

Fig. 9. Camer de cretere (dup Nanson, 2005)

34

Figura 10. Hot cu flux laminar de aer steril (original) Mediile de cultur conin n compoziia lor substane anorganice i organice. Elementele chimice din componenta anorganic pot fi accesibile celulei vegetale sub forma unor anumite tipuri de compui sau soluii i sunt mprite n macroelemente i microelemente. Din acest punct de vedere, cel mai utilizat tip de mediu de cultur este mediul Murashige-Skoog (tab. 2). n cadrul componentei organice a mediului de cultur se includ vitamine (inozitol, tiamin, pantotenat de calciu, ac.nicotinic, ac.ascorbic), fitoregulatori de cretere (auxine, citochinine i gibereline), substrat de carbon (zaharoz) i agar (cnd se prepar mediu solid). Fitoregulatorii sunt din cei aparinnd celor 3 mari grupe, respectiv auxine, gibereline i citochinine, iar agarul (un polizaharid extras din alge roii) reprezint agentul solidificator al mediului de cultur. Alegerea explantelor la speciile forestiere depinde de metoda de multiplicare utilizat. De regul, se recolteaz mugurii axilari (se au n vedere meristemele apicale caulinare situate la baza frunzelor), deoarece utilizarea unor explante mai mari (noduri de 2-5 cm lungime) ar crete considerabil riscul perpeturii contaminrilor microbiene secundare. La speciile lemnoase care sunt multianuale, o problem practic foarte important este cea a rentineririi unor organe de pe care urmeaz s fie prelevate meristeme apicale. Explantele sau butaii prelevai de pe astfel de plante i pierd capacitatea de nrdcinare. De aceea, la arbori aplicarea prealabil culturii in vitro a unor metode de rentinerire a materialului biologic prin butiri sau microbutiri in vitro, altoiri de apexuri de plante adulte pe tinere plantule (formate din semine), tieri, altoire repetat sau simpl, etc. Alegerea celei mai potrivite metode de dezinfectare a explantului trebuie s in seama de natura organelor, profunzimea esuturilor care vor deveni explante, de fineea tegumentelor i a epidermei. Inocularea reprezint operaiunea de detaare i aezare a explantului (meristemul apical caulinar) pe mediul de cultur aseptic. Datorit fragilitii i dimensiunilor foarte mici ale explantului (un meristem are diametrul, n medie, de 0,1-0,2 mm), aceast operaie este extrem de delicat i dificil i se efectueaz, obligatoriu, sub lupa binocular amplasat n incinta hotei cu flux laminar de aer steril. De asemenea, tot instrumentarul se

35

sterilizeaz n alcool i se flambeaz la becul de gaz din incinta hotei, naintea i dup fiecare inoculare. Tabelul 2 Mediul Murashige-Skoog (MS,1962) (dup Cachi-1987)
Ingredient Azotat de amoniu (M) Azotat de potasiu Sulfat de magneziu Fosfat de potasiu Acid boric (m) Sulfat de mangan Sulfat de zinc Molibdat de sodiu Sulfat de cupru Clorur de cobalt Iodur de potasiu Clorur de calciu Na2EDTA Sulfat feros (m) 82.500 95.000 18.500 8.500 620 2.176 860 25 2,5 2,5 83 14.500 2.984 1.114 Concentraii n soluii stoc (mg/l) n mediu (mg/) 1.650 1.900 370 170 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 0,83 440 37,3 27,8

M macroelemente; m microelemente

ndeprtarea primordiilor foliare se poate face cu minibisturie mai mari sau cu ace spatulate. Primordiile foliare se detaeaz complet pentru ca meristemul s fie ct mai bine expus i individualizat. Rapiditatea efecturii acestei operaiuni prentmpin apariia riscului deshidratrii meristemului detaat n contact prelungit cu instrumentarul flambat. Imediat, recipientele se vor acoperi cu folie de polietilen sterilizat n alcool de 70o, dup care, culturile vor fi trecute n camera de cretere pentru incubarea, pasarea i creterea inoculilor. Primele sptmni de meninere a culturilor in vitro n camera de cretere reprezint perioada de incubare, care se ntinde ca durat n funcie de natura explantului, de specie sau de condiiile climatice. n primele zile dup inoculare se fac trierile, ndeprtndu-se flacoanele contaminate. Pe mediile solide, mucegaiurile sau coloniile bacteriene apar, cel mai adesea, la suprafaa mediului, mai aproape sau mai departe de explante. Inducerea proceselor regenerative la explantele speciilor lemnoase este mai lent dect la inoculii plantelor ierboase sau speciile cultivate, aceste procese manifestndu-se dup cca. 45-60 de zile. Procesul de organogenez in vitro debuteaz cu formarea primilor lstari i mugurai (caulogeneza in vitro), dup care are loc formarea primelor rdcinie (rizogeneza in vitro). Culturile care prezint o ncetinire evident a creterii explantelor, fenomen datorat epuizrii mai timpurie a substanelor nutritive din mediu, vor

36

fi pasate pe mediu de cultur proaspt i steril. Stadiul final al etapei de organogenez in vitro l constituie formarea plantulelor din cultura primar. nmulirea in vitro a plantelor poart denumirea de micropropagare (micromultiplicare sau micronmulire). Este o form de multiplicare vegetativ i asigur un randament net superior, n comparaie cu alte procedee practicate, pn n prezent, n horticultur i silvicultur. Micropropagarea se face prin minibutire in vitro, atunci cnd plantulele din culturile primare sunt bine dezvoltate, cu rdcinie, tulpinie i frunzulie bine individualizate i viguroase. Minibutaii rezultai sunt trecui, n condiii aseptice, pe medii de cultur noi i vor forma culturile secundare. 4.2.2. Aclimatizarea n ser i repicajul n pepinier Multe vreme, din pcate, muli i foarte buni specialiti n activitatea de laborator au neglijat adesea aspectul privind aclimatizarea n ser a materialului biologic obinut in vitro, respectiv trecerea la condiiile de vegetaie in vivo, acest fapt fiind considerat secundar ca importan. Multiplele eecuri aprute au determinat o reconsiderare a acestei atitudini i, n consecin, eforturile specialitilor s-au concentrat i n aceast direcie, ceea ce a determinat luarea de msuri adecvate asigurrii condiiilor propice de a se obine plante adecvate i perfect aclimatizate. Odat obinut aclimatizarea, plantele pot fi trecut n pepiniere, loc n care personalul calificat l va supune operaiei de repicaj normal asemenea i celorlalte tipuri de plante. Plantele obinute n laborator sunt denumite n limbajul de specialitate ca vitroplante (fig. 11).

Figura 11. Ser amenajat pentru aclimatizarea vitro-plantelor de Prunus avium (dup Nanson, 2005) 4.2.3. Rezultate obinute la specii forestiere La specii ale unor importante genuri de foioase (Prunus avium, Populus sp., Betula, Quercus robur, Q. petraea, Eucalyptus, etc) s-au nregistrat rezultate pozitive sub aspect tehnic, ns din punct de vedere al eficienei economice, realizri notabile au fost obinute doar la cireul slbatic. De altfel, n Frana au fost iniiate i dezvoltate programe complexe privind cultura i multiplicarea in vitro la Prunus avium.
37

Referitor la specii de rinoase, s-au obinut unele rezultate sub aspect tehnic doar la cteva specii cum ar fi Picea abies, Pseudotsuga menziesii sau Larix eurolepis. De asemenea, unele experimente privind cultura in vitro, parial reuite, au fost efectuate la Sequoia sempervirens, n Statele Unite, sau Pinus radiata, n Noua Zeeland. La speciile agricole cultivate, unde variabilitatea genetic este mult ngustat, micropropagarea constituie i un mijloc de a genera variaii somaclonale, opiune care la speciile forestiere nu s-a urmrit n mod deosebit datorit existenei unei variabiliti genetice naturale n limite nc largi. 4.3. Inducerea i obinerea de haploizi Acest proces intereseaz i practica silvic n domeniul ameliorrii genetice, mai ales n perspectiva obinerii de indivizi homozigoi pentru toate genele, respectiv linii pure prin dublarea ulterioar a garniturii cromozomiale haploide. La unele specii forestiere, obinerea de exemplare haploide intereseaz n cel mai nalt grad specialitii, datorit uurinei cu care se obin aceste forme i marii lor utiliti n cadrul diferitelor programe de ameliorare. n acest sens putem aminti specii aparinnd genurilor Populus, Prunus, Ribes etc. 4.3.1. Obinerea de haploizi prin androgenez Prin conceptul de androgenez se nelege dezvoltarea partenogenetic a unui embrion, respectiv a unei plante haploide, pornind de la un nucleu haploid al microsporului sau grunciorului de polen (Raicu, 1980). Primele experimente i rezultate concrete au fost menionate n 1964, cnd Guha i Maheswari au cultivat antere de Datura innoxia pe mediu artificial, obinnd embrioizi haploizi. Prin cultura in vitro, programul normal de dezvoltare a microsporului (microsporogeneza) este deviat i, n urma unor diviziuni de tip mitotic repetate, rezult embrioizi care ulterior se vor transforma n plante haploide. n cazul androgenezei indirecte, n urma diviziunilor se formeaz mai nti un esut nedifereniat de tip calus, dup care, n condiii favorabile de mediu, temperatur i lumin, acest esut se va diferenia n organe i, n final, n plante haploide. n cazul angiospermelor, n urma primei diviziuni meiotice, rezult tetrade de microspori uninucleai haploizi. Acetia vor suferi, n continuare, diviziuni de tip mitotic prin care din fiecare microspor vor rezulta dou celule diferite ca mrime i nuclei inegali (stadiul timpuriu al grunciorului de polen). Din nucleul mare va rezulta nucleul generativ, care va mai suferi o diviziune dup polenizare i vor rezulta doi nuclei spermatici. Acetia vor participa la dubla fecundare, prin care unul va fecunda oosfera i va rezulta zigotul, iar cellalt va fecunda nucleul secundar al sacului embrionar i va rezulta endospermul (fig.12). Cultura in vitro a anterelor n condiii controlate de mediu, temperatur i lumin, va devia traiectul normal al microsporogenezei, n sensul c, n urma primei diviziuni de tip mitotic, se vor forma dou celule egale, iar microsporul se va dezvolta pe calea embriogen. (fig. 13). n aceast situaie, celula generativ degenereaz i nu particip la formarea viitorului organism haploid.

38

Figura 12. Dezvoltarea normal a microsporilor la angiosperme (dup Raicu, 1980) n reuita acestei operaii concur mai muli factori, factori legai de planta donatoare (vrsta anterelor, poziia lor pe butonul flora, sezonul de recoltare) pe de o parte, factori legai de aplicarea unor pretratamente cu efect pozitiv (ocuri termice la +30C sau temperaturi ridicate de pn la +350C), de mediu de cultur (cu factorul de solidificare agar sau diferite combinaii i concentraii ale fitoregulatorilor de cretere), pe de alt parte. Mai este utilizat i aplicarea unor tratamente cu diverse substane chimice.

Figura 13. Obinerea de haploizi prin androgenez direct i via calus (dup Raicu, 1980)

39

4.3.2. Obinerea de haploizi prin ginogenez Dac devierea prin cultura in vitro a anterelor a devenit deja o operaie facil i de rutin, n cazul culturii de celule ovariene ca noi surse de obinere a plantelor haploide condiiile sunt mult mai dificil de realizat, fapt datorat mai ales nc necunoaterii complete a efectelor diferitelor tratamente fizice sau chimice privind devierea gametofitului femel normal i obinerea de haploizi. La angiosperme, n urma meiozei a I-a rezult 4 macrospori haploizi, din care unul va suferi noi diviziuni de tip mitotic ce vor duce la formarea sacului embrionar cu 8 celule haploide (fig. 14). n ceea ce privete eficacitatea acestei metode, comparativ cu androgeneza, se situeaz la cote mult mai sczute, rezultnd un numr redus de haploizi la 100 de ovule cultivate.

Figura 14. Macrosporogeneza i formarea sacului embrionar la angiosperme (dup erbnescu i Toma, 1980) 4.3.3. Importana genetic a haploizilor obinui prin androgenez Rezultatele mai mult dect ncurajatoare obinute la tot mai multe specii de plante, inclusiv specii forestiere, confirm pe deplin justeea teoriei totipotenei celulei vegetale, enunat de ctre Haberlandt la nceputul sec. al XX-lea. Plantele haploide sunt pure din punct de vedere genetic datorit fenomenului de hemizigoie, existnd o coresponden total ntre genotip i fenotip. Plantele haploide obinute prin androgenez experimental sunt i foarte variate genotipic, datorit faptului c n meioza a I-a are loc recombinarea genetic, ceea ce constituie un mare avantaj pentru ameliorarea bazat pe selecie. La haploizi se pot selecta foarte uor cei cu mutaii recesive, acestea fiind foarte greu decelabile la diploizi. Utilizarea haploizilor n ameliorarea plantelor conduce la o reducere semnificativ (cca. 7-8 ani) a timpului necesar obinerii unor linii pure i, pe de alt parte, pentru studierea diferitelor caractere n procesul de ameliorare este necesar un numr mult mai redus de indivizi. n acest din urm caz, se reduce considerabil i volumul de munc, mrindu-se totodat ansele de a se seleciona mai rapid i mai precis homozigoii importani n ameliorare.

40

4.4. Cultura de embrioni sexuai in vitro n cadrul activitii de ameliorare a diferitelor specii de arbori, la efectuarea hibridrilor interspecifice, n majoritatea cazurilor, hibrizii rezultai avorteaz sau sunt sterili. Aceste fenomene nedorite sunt, cel mai adesea, puse pe seama incompatibilitii dintre esuturile embrionare i cele ovariene dar i a sensibilitii deosebite a embrionilor interspecifici rezultai. Laboratoarele moderne din institutele de specialitate sunt dotate cu echipamente i aparatur ce permit cultura in vitro a acestor embrioni, condiii n care se pot dezvolta i viitoarele plante hibride. Dublul avantaj al utilizrii acestei metode biotehnologice este conferit de faptul c acestor embrioni li se poate induce o dezvoltare normal dar, mai ales, este posibil o accelerare a vitezei de selecie. Embrionii pot fi recoltai imediat dup fecundare i nu mai este necesar parcurgerea etapei de maturare a seminelor, ceea ce pentru ameliorarea majoritii speciilor forestiere, specii caracterizate printr-o longevitate mare i maturare trzie, reprezint un foarte important ctig. Reducerea acestor intervale de timp, face posibil totodat i introducerea mai rapid a unui nou caracter ntr-o nou varietate. De asemenea, obinerea mult mai rapid de linii pure, n urma efecturii anuale a mai multor cicluri de autofecundare, reprezint un alt mare avantaj n ceea ce privete iniierea i aplicarea acestei biotehnologii. 4.5. Embriogeneza somatic i seminele artificiale Pe plan european, ca urmare a unor eecuri n ceea ce privete aplicarea i extinderea culturii i multiplicrii in vitro la unele specii importante de arbori, cercetrile sau orientat ctre adoptarea unor noi tehnici biotehnologice, cum ar fi embriogeneza somatic i obinerea de semine artificiale. 4.5.1. Embriogeneza somatic Tehnica embriogenezei somatice urmrete multiplicarea indivizilor, plecnd de la embrioni imaturi sau chiar maturi (la anumite specii). Un scop asociat acestei tehnici l constituie obinerea de semine artificiale. Embrionii imaturi sunt extrai de la seminele aflate nc n stadiul de formare. Materialul biologic prelevat este fragmentat i cultivat pe mediu de cultur aseptic adecvat. n cazul reuitei, fragmentele de material secionat se transform treptat n proembrioni. Acetia trebuie separai cu ajutorul microtomului i repicai pe un mediu de cultur n care se pot dezvolta i atinge maturitatea, cu timpul devenind plantule nrdcinate. n acest stadiu, materialul biologic este scos din mediul de cultur i apoi este repicat n sere sau pepiniere, devenind embrio-plante (fig. 15 ). Aceast tehnic s-a dovedit fezabil pentru molid, nuc i alte specii lemnoase. De exemplu, n Belgia s-a reuit crearea mai multor embrio-plante, plecnd de la embrioni imaturi recoltai din livezi semincere. Un caz foarte interesant a fost semnalat cnd s-a obinut o embrio-plant trizomic, ceea ce confer o oarecare not de risc n utilizarea acestei tehnici prin faptul c pot rezulta i mutani somatici, uneori periculoi pentru practica silvic. Pe de alt parte, costurile prohibitive legate de tehnicile in vitro pot constitui, de asemenea, un factor limitativ puternic privind utilizarea pe scar larg a acestei biotehnologii.

41

Figura 15. Ser de aclimatizarea a embrio-plantelor de Picea abies (dup Nanson, 2005) 4.5.2. Tehnologia obinerii seminelor artificiale n ultima perioad, ca urmare a avntului deosebit nregistrat n domeniul biotehnologiilor, s-a trecut la o propagare n sistem intensiv (industrial) a unor varieti i biotipuri extrem de valoroase cu o constelaie de gene de mare performan, dar care, prin reproducerea sexuat, nu s-ar putea obine, n timp relativ scurt, cantiti suficiente de material biologic de valoare i performant economic. Rezolvarea problemei a venit odat cu punerea la punct a tehnicii de obinere a seminelor artificiale i trecerea acesteia n faz industrial. Condiia de defect zero la seminele naturale (care germineaz 100% i rezult numai plante viguroase) nu poate fi niciodat atins, chiar dac se fac unele intervenii la polenizare, la fecundare sau chiar la formarea seminelor. Afectarea membranelor n condiii de deshidratare, aprute n timpul germinrii, va conduce invariabil la producerea unor daune, n sensul c se va pierde o parte a substanelor de rezerv (de exemplu, unele proteine absolut indispensabile unei bune germinaii). De asemenea, pot aprea mari probleme n perioada de stocare a seminelor diferitelor specii, datorit faptului c sunt afectate ireversibil mai multe sisteme enzimatice responsabile de rezistena la efectele negative ale oxigenului i derivailor acestuia. n timpul manipulrii stocurilor de semine (livrri, schimburi, etc.) este foarte probabil apariia de leziuni, daune sau chiar distrugeri, mai ales la speciile lemnoase ale cror semine dovedesc o deosebit fragilitate. n noua tehnologie de obinere i producere a seminelor artificiale, sistemul de culturi in vitro utilizeaz anumite tipuri de material biologic, n general esuturi foarte tinere (cu caracter embrionar), cele mai potrivite fiind inflorescene, pri de cotiledoane, sau axe hipocotile. Tehnologia seminelor artificiale se realizeaz, de fapt, prin nglobarea acestor esuturi n medii nutritive i nvelirea acestor ansambluri cu pelicule permeabile i biodegradabile. Culturile pentru obinerea seminelor artificiale se realizeaz n bioreactoare de diferite capaciti, similare celor utilizate n industria fermentativ sau cea a produilor microbieni. La sfritul procesului tehnologic, embrionii sunt foarte fragili i expui i, de aceea, sunt imediat nvelii ntr-o pelicul care le permite meninerea n via pentru o perioad relativ scurt de timp (n funcie de cantitatea de mediu de sub nveli).

42

Membrana protectoare va avea de ndeplinit 3 funcii importante: - de protecie, prin care noul embrion din interior, aflat ntr-o stare similar dormanei, va fi ferit de ocurile termice sau hidrice din exterior, putnd, n aceste condiii, s fie transportat i pstrat o anumit perioad de timp; - de nutriie, n urma creia viitoarea plantul are posibilitatea s se hrneasc din microrezerva de mediu de cultur aflat sub membrana de protecie; - de aprare i revigorare, prin aceea c embrionul are asigurat o protecie fitosanitar minim mpotriva diferiilor ageni patogeni. n ciuda costurilor relativ ridicate privind producerea la scar industrial a seminelor artificiale, trebuie remarcat totui interesul tot mai mare manifestat de ctre specialitii din agricultur, pomicultur i, mai recent, n silvicultur. Acest fapt este justificat de marea problem privind nmulirea dificil (uneori chiar imposibil) pe cale natural (prin smn) a unor varieti hibride extrem de performante. Tehnologia producerii seminelor artificiale este nc la nceput dar se bucur, deja, de un interes crescnd att n silvicultur, ct i n agricultur. Seminele artificiale sunt, n mod evident, mai scumpe dect cele naturale dar ele prezint avantaje incontestabile care fac ca producerea i utilizarea lor s devin rentabil. Este deja cunoscut faptul c unele varieti hibride performante se reproduc foarte greu, sau chiar deloc, prin smn (sterilitate sau meioze neregulate). Pe de alt parte, la unele varieti de gimnosperme (pin, larice, molid), tehnologia producerii de semine artificiale constituie unica posibilitate de multiplicare i difuzare n mas a unui material deosebit de valoros obinut n cadrul unor etape distincte ale proceselor de ameliorare. n S.U.A., de exemplu, la molidul comun s-au obinut rezultate promitoare nc pe la mijlocul anilor 80, crendu-se la scar industrial forme cu rezisten crescut la diverse maladii sau cu toleran deosebit la diferii produi chimici. 4.6 Obinerea i cultura protoplatilor. Hibridarea celular (somatic) Primele metode cu adevrat eficiente de obinere i izolare a protoplatilor (celule vegetale fr peretele celular) au fost puse n aplicare n deceniul al VII-lea al secolului trecut, ndeprtarea peretelui rigid celulozo-pectic fcndu-se prin perfecionarea tehnicilor enzimatice. Primele experimente i totodat realizarea primelor regenerri de plante ntregi au fost obinute de ctre francezul J. P. N i t s c h, n anul 1971. El a reuit regenerarea unor plante de tutun, pornind de la cultura pe mediu artificial a unor celule nude, complet separate unele de altele. Ulterior s-a reuit izolarea i obinerea de protoplati i la alte specii vegetale (soia, morcov, petunie, mazre, bob), inclusiv la specii lemnoase i de arbori (plop, pin, ienupr, mr). Suspensiile monocelulare ale protoplatilor pot fi obinute practic din orice tip de esut vegetal, aceste ansambluri permind efectuarea unor studii extrem de avansate i de mare finee n vederea elucidrii a numeroase i complexe procese biologice la nivel celular i molecular. n acest sens, obinerea protoplatilor i, mai ales, fuzionarea acestora deschid perspective dintre cele mai largi asupra procesului de manipulare a structurii i informaiei genetice cantonat ntr-o celul i, n final, de elucidare a fenomenului de omnipoten celular i mecanismele de reglare adiacente. Un aspect practic extrem de important este reprezentat de posibilitatea acestor celule vegetale nude de a-i reface peretele celular dup fuziune, de a se divide i de a forma noi esuturi i ulterior organisme autonome.

43

4.6.1. Obinerea de protoplati Obinerea i izolarea protoplatilor este posibil prin prelevare de la aproape toate organele plantelor superioare, respectiv rdcini (inclusiv nodoziti radiculare), frunze, fructe, tuberculi, endosperm, etc. Totui cel mai potrivit esut vegetal, furnizor de protoplati de bun calitate (cu un grad mare de omogenitate), este parenchimul frunzelor tinere. n general, recomandabil este ca prelevarea de celule surse de protoplati s se fac de la esuturi tinere, ntruct va rezulta o bun proliferare ulterioar a esuturilor n cultur. La speciile lemnoase (plop, ienupr, mr, pin), eficiena metodei de extragere i izolare a protoplatilor este foarte mare, n sensul c dintr-un gram de esut din frunze tinere verzi se pot obine cca. 2 milioane de protoplati identici genetic. n prezent, n laboratoarele de specialitate se practic n mod curent 2 metode principale de obinere a celulelor vegetale nude, viitori protoplati: - metoda mecanic este o metod mai veche care const n aplicarea tehnicii de microdisecie a celulelor vegetale plasmolizate n vederea ndeprtrii peretelui celulozopectic rigid. n ultima vreme, aceast metod este din ce n ce mai puin utilizat din cauza randamentului net inferior comparativ cu alte metode (numr redus de protoplati n timp mai scurt), precum i datorit imposibilitii aplicrii metodei la un numr mai mare de specii; - metoda enzimatic, n schimb, este mult mai accesibil n urma stabilirii unor combinaii optime de fermeni specifici (pectinaze care disociaz celulele i celulaze care atac peretele celular). Randamentul extrem de ridicat, precum i accesibilitatea metodei la un numr mult mai mare de specii de plante, reprezint avantaje de necontestat privind utilitatea acestei metode (fig.16).

Figura 16. Obinerea de protoplati pe cale enzimatic i regenerarea plantelor (dup Raicu, 1980) 4.6.2. Fuziunea protoplatilor
44

Datorit absenei peretelui celular, celulele vegetale nude pot fuziona ntre ele, proces ce reprezint hibridarea celular sau somatic, tehnic de nalt performan ce face posibil fuziunea ntre celule provenite de la organisme ndeprtate din punct de vedere taxonomic i filogenetic. Fuziunea poate s se desfoare spontan n cadrul suspensiei celulare (celule n mediu lichid) sau mediat de unele substane (mediatori chimici ca polietilenglicolul sau ioni de Ca++) i pe baza ncrcturii electrice negative a protoplatilor. Pe baza celor menionate i n condiiile unui pH ridicat, protoplatii vor intra n stare de agregare, fenomen favorabil fuziunii celulare (fig. 17). O metod mai perfecionat i mai eficient de inducere a fuziunii celulare este cea a electrofuziunii n prim faz se aplic un cmp electric alternativ neuniform asupra suspensiei. Prin conductivitatea electric a suspensiei se creeaz un efect electroforetic asupra protoplatilor care vor migra i se vor alinia, asemenea iragurilor de perle, pe liniile cmpului, fenomenul purtnd numele de dielectroforez. n faza imediat urmtoare se aplic un puls electric de foarte mare intensitate, pe o durat extrem de scurt de timp, fapt ce va determina ruperea membranelor celulelor aflate n contact i va favoriza fuziunea celular. O problem foarte important n definitivarea ntregului program de obinere, n final, a plantelor hibride dorite este eficiena selectrii celulelor hibride rezultate, celule care sunt relativ puine i se gsesc n amestec cu celulele nefuzionate n mediul de cultur. Procedeele cele mai folosite, n acest sens, sunt cele bazate pe efectuarea de diferenieri fenotipice i de cretere, dup care celulele fuzionate sunt selectate i trecute n sistem de cultur n micropictur (aa numitele culturi doic).

Figura 17. Principalele etape ale hibridrii somatice la plante (dup Raicu, 1980)

45

Obinerea, fuzionarea i cultura celulelor hibride reprezint operaiuni de o foarte mare importan n cercetrile de genetic, n general, i pentru cele de ameliorare genetic a diferitelor specii vegetale, n special (fig. 18).

Figura 18. Diferite utilizri ale protoplatilor (dup Raicu, 1980) Marea eficien privind obinerea protoplatilor, nclusiv la specii forestiere, ofer practic posibiliti nelimitate de nmulire vegetativ a unor genotipuri foarte valoroase. Pe de alt parte, este posibil obinerea unor hibrizi celulari ntre organisme ndeprtate filogenetic (acestea nu se pot ncrucia sexuat) i, nu n ultimul rnd, prin hibridarea citoplasmei celor 2 celule, este valorificat din plin variabilitatea extranuclear care la reproducerea sexuat este transmis doar uniparental. Prin fuzionarea protoplatilor aparinnd aceleai specii se pot obine exemplare cu diferite grade de ploidie, procedeu greu realizabil prin mutagenez. 4.7. Transferul de gene i obinerea de plante transgenice n sens strict teoretic, ingineria genetic reprezint n esen introducerea unor gene sau grupe de gene strine n genomul unui anumit individ. Aceste gene, de regul, provin de la specii ndeprtate taxonomic (chiar la regnuri diferite: microorganisme, plante, animale). Manipulrile genetice s-au dezvoltat extrem de rapid n ultimele decenii, ncepnd cu anul 1983, cnd s-a creat prima plant transgenic la tutun i crearea, n anul 1994, a primei varieti transgenice (cu maturitate prelungit) la tomate, varietate deja comercializat n S.U.A. n prezent, n genomul porumbului este posibil de a se introduce fragmente de cromozom bacterian rezistente la o serie de pesticide sau insecte fitofage. Una dintre cele mai strlucite realizri n domeniul transferurilor de gene n terapeutica uman este aceea c seturi de gene umane, izolate din celule specializate ale
46

pancreasului (insulele Langerhans), productori naturali ai insulinei, au fost introduse cu succes n genomul unor bacterii care produc apoi hormonul la scar industrial. De remarcat faptul c noul produs este extrem de eficient i nu provoac nici un fel de reacii alergice, fiind foarte bine suportat de ctre bolnavii de diabet (fig. 19). Foarte recent s-a dat publicitii faptul c geneticienii au descoperit gena care provoac metastaza, pornind de la cancerul de sn. Gena SATB1, supranumit de cercettorii americani ca arbitrul ef, poate transforma rapid circa 1000 de celule, n celule canceroase. Atunci cnd sunt supraactivate, celulele canceroase se nmulesc, ns cnd gena este neutralizat, celulele nu se mai divid i nici nu mai migreaz.

Figura 19. Schema obinerii insulinei umane Cercettorii sunt de prere c SATB1 va putea constitui un punct int n dezvoltarea unor terapii eficace pentru vindecarea cancerului i, n perspectiv, chiar apariia pe pia a unor medicamente care s previn sau s trateze metastaza n cazul cancerului de sn. n prezent este dificil s se determine cu claritate dac celulele canceroase dintr-o tumoare pot invada esuturile vecine sau s circule liber prin snge i s formeze alte tumori n organism. Cert este faptul c descoperirea noii gene uureaz enorm cercetrile ulterioare, de acum tiut fiind faptul c activarea unei tumori prin gena incriminat nseamn a deschide calea spre metastaz. O dificultate n plus ns n iniierea noilor cercetri o reprezint faptul c gena SATB1 are i un rol pozitiv foarte important n organismul uman, respectiv acela de a activa sistemul imunitar. Cercettorii n domeniu intenioneaz s pun la punct o terapie prin care gena s fie dezactivat doar n zona tumorilor, acolo unde este hiperactiv. Cercetrile fcute pe oareci au artat c la exemplarele n care a fost suprimat activitatea genei, numrul nodulilor metastazici era ntre zero i cinci, spre deosebire de cei netratai, care aveau ntre 125 i 160 de noduli. Tot n S.U.A., n ultimii 20 de ani, cu precdere n domeniul agricol, s-au dezvoltat extrem de rapid aceste tehnici de mare performan, multe forme i varieti transgenice

47

fiind deja introduse n producia agricol larg. n Europa, n acest domeniu, se manifest nc o mare rezerv (chiar ostilitate din partea micrilor i organizaiilor ecologiste), inclusiv la nivel de guverne, privind acceptarea i introducerea pe scar larg a acestor biotehnologii de vrf pentru crearea i utilizarea de organisme modificate genetic (OMG). 4.7.1. Obinerea pe cale biologic a ADN-ului recombinant - transferul indirect ADN-ul recombinant (ADN hibrid) rezult prin mbinarea in vitro a unor fragmente de ADN ce provin de la alte specii sau sintetizate n laborator (aa numite gene himere), iar noua macromolecul de AND va avea o structur deosebit ce va conine un mesaj genetic modificat. I) Izolarea pasagerului Gena de interes, denumit i pasager, este compus din trei segmente de baz, i anume: - promontorul, alctuit dintr-o secven cu un numr limitat de nucleotide i avnd rolul de iniiator dar i n a determina expresia genei de interes; - secvena median sau codificatoare, care reprezint parte cea mai consistent a pasagerului i care trebuie mai nti identificat, apoi izolat i secvenionalizat. Pentru identificarea celulelor transformate ale plantei n vederea selectrii, este necesar utilizarea unor gene marquer care, pe lng rezistena la antibiotice (surs: Escherichia coli la oarece) sau la ierbicide (surse: specii ale genului Streptomyces sau Arabidopsis thaliana), pot face posibil i reperarea secvenei codificatoare - terminatorul, compus din secvene (triplete de nucleotide nonsens) ce ncheie lanul structural al pasagerului. Izolarea unei gene de interes din genomul unei specii vegetale se poate face cu ajutorul unor enzime specifice, denumite enzime de restricie, urmnd ca gena izolat s fie recunoscut i pregtit de a fi preluat de un vector. II) Izolarea, deschiderea i pregtirea vectorului Sub denumirea de vector se nelege o molecul de ADN capabil de autoreplicare, de a accepta gena de interes, de a fi acceptat de nou celul gazd n care s se multiplice i s se exprime odat cu noua gen transferat. Cel mai potrivit vector care poate ndeplini toate aceste cerine este un plasmid, formaiune genetic independent de cromozomul bacterian, capabil de autoreplicare, izolat din bacterii (Agrobacterium sp.) sau chiar din virui (ex. bacteriofagul din virusul SV-40) i care, n majoritatea cazurilor, are form circular (fig. 20). Introducerea genei de interes (pasagerul) n structura ADN-ului plasmidial se face dup deschiderea prealabil a celui din urm ntr-un singur loc, cu ajutorul enzimelor de restricie care pot fragmenta molecula n puncte de recunoatere. Fiind vorba de acelai tip de enzim de restricie, ca n izolarea genei de interes, atunci sunt mari anse ca s existe un mare grad de coezivitate ntre capetele celor dou fragmente de ADN (plasmidial i al pasagerului). Acest fenomen se datoreaz complementaritii bazelor azotate ale nucleotidelor de la capete i a punilor de H+.

48

Figura 20. Etapele formrii ADN-ului recombinant (dup Popa i Repanovici, citat de Lucu, 1998) III) Transferul genei de interes Noua molecul de ADN care se prefigureaz i desvrete constituirea sub aciunea unei alte enzime specifice ADN ligaz ce determin formarea legturilor covalente. Aceste legturi vor asigura stabilitatea noii molecule de ADN, n acest mod, crendu-se condiii propice integrrii n genomul gazdei i manifestrii expresiei genice ulterioare. Din regiunea transformabil i transferabil a plasmidului (vectorul), respectiv ADN-t, genele de interes pentru transfer (pasagerul) substituie genele proprii ale bacteriei sau virusului. Urmeaz procesul de eliminare a genelor de virulen, pornind de la fragmentul transformabil i transferabil ADN-t. n urma acestui proces rezult aa numiii vectori dezarmai, iar noua molecul de ADN (ADN recombinat) este gata pentru a se integra n celula gazd i s se multiplice. Introducerea noului material genetic se produce prin fenomenul de transformare a celulei care va cpta aa numita stare de competen, n urma efecturii unor tratamente cu ioni de Ca2+ i polietilenglicol (PEG). Dup transformarea celulelor receptoare, n mod obligatoriu, se fac testrile prin culturi in vitro pentru a se verifica dac transformarea a avut loc la nivelul diferitelor esuturi. n general, procesele de integrare i transformare a celulelor receptoare de echipament genetic modificat (genele modificate sunt foarte sensibile) au o eficien sczut i, de aceea, se aplic tehnica specific de amplificare a secvenelor de ADN (PCRPolymerase Chain Reaction). Puterea de multiplicare este foarte mare, astfel nct, dup cca. 30 cicluri de amplificare a unui segment de ADN, cuprins ntre 2 secvene considerate ca normale (matrice), fragmentul n cauz de ADN se poate distinge deja pe un gel

49

agarizat. Odat transgena integrat n genomul celulei gazd, se trece la detectarea i identificarea ARN-urilor mesager (din procesul transcripiei) i a proteinelor cu aciune specific (n cadrul procesului de translaie). n final, expresia genei de interes (inclusiv in situ) se realizeaz prin utilizarea unei gene marquer a crei expresie se poate repera prin efectuarea unor teste complexe specifice citoenzimologice, imunocitochimice, de fluorescen, etc. Din cazuistica experimental obinut pn n prezent, se poate concluziona c dicotiledonatele rspund mai uor la aplicarea metodei indirecte de transfer de gene (mai ales la plop), comparativ cu monocotiledonatele sau gimnospermele care sunt mult mai recalcitrante. 4.7.2. Transferul de gene la arbori cu ajutorul plasmidelor Ti i Ri a) Transferul de gene cu ajutorul plasmidei Ti Poate cel mai intens utilizat vector n cadrul procesului de transfer indirect de gene la plante (inclusiv la arbori) l reprezint plasmida Ti (tumor inducing) de la Agrobacterium tumefaciens. Aceast bacterie induce tumori la plantele dicotiledonate i numai la unele monocotiledonate, iar acest proces de infecie are la baz de fapt un proces natural de transformare genetic, proces ce poate servi ca un model ideal n realizarea transferului de gene pe cale biologic. Responsabilitatea patogenitii microorganismului o deine o mic poriune a plasmidului (aa numitul ADN-t), constituit din numai 6 gene (crora li se cunoate succesiunea dar nu i structura exact) i care determin apariia de tumori la locul unor leziuni de la nivelul coletului plantelor. Boala este specific atacului bacterian i este cunoscut sub numele de gal de colet (crown gall)(fig. 21). Pornind de la acest proces natural de infecie, s-a descoperit c aceste gale pot fi cultivate i n absena microorganismelor generatoare, precum i n absena substanelor de cretere. n zona esuturilor atacate au fost izolate i identificate anumii substane denumite opine - care lipsesc n celelalte esuturi normale ale plantei. Este cert faptul c bacteria, prin cele 6 gene specifice de la nivelul plasmidului (ADN-t), determin o deviere a metabolismul plantei gazd, rezultnd producerea n esutul vegetal a unei substane metabolizabile numai de microorganismul respectiv.

Figura 21. Gala de colet produs de Agrobacterium tumefaciens (INRA, 1991 citat de Lucu, 1998)

50

Fragmentul din ADN-ul plasmidian, respectiv ADN-t, a fost depistat nucleul esuturilor tumorale ale plantei gazd. n prezent, mecanismul transferului nu este nc pe deplin lmurit, dar este sigur posibilitatea integrrii de gene strine n segmentul ADN-t al plasmidei Ti ce se vor putea transmite la celulele vegetale, concomitent cu celelalte gene din secvena specific segmentului (fig. 22). b) Transferul de gene cu ajutorul plasmidei Ri Un alt vector eficient n transferul indirect de gene la plante l constituie plasmida Ri de la bacteria Agrobacterium rhyzogenes. Avnd o structur similar vectorului prezentat anterior, plasmidei Ti. provoac un proces natural de infecie ce determin apariia periorilor radicelari, rezultnd o proliferare excesiv a rdcinilor la mai multe specii de dicotiledonate. Ca i n cazul prezentat anterior, plasmidul bacteriei are o regiune ADN-t ce se poate transfera n celulele vegetale gazd. Dup integrarea n genomul gazdei, segmentului ADN-t al plasmidului Ri, avnd ncorporat i gena de interes, se poate exprima datorit transformrii genetice naturale. Ulterior, prin culturi in vitro pe celule n suspensie, se pot regenera, n final, plante transgenice ce posed noi trsturi.

.
Figura 22. Transferul de gene cu ajutorul plasmidului Ti n celula vegetal 4.7.3. Transferul direct (transfecie) n acest sens au fost elaborate tehnici fizice sau chimice de transfer direct al genelor pasager, din care vom meniona doar cele mai importante. a) Tratamentul cu polietilenglicol conduce la destabilizarea structural a membranei celulare cu ajutorul polietilenglicolului (PEG). n urma acestei operaii, gena de interes poate migra spre nucleu, putndu-se integra n genomul gazdei. n acest mod se poate efectua transferul direct al genei pentru rezisten la kanamicin, gen situat pe o plasmid de la Escherichia coli, rezultnd plante rezistente la antibiotic i care transmit
51

caracterul la descendenii sexuai. Tehnica prezentat are totui un randament destul de sczut, puine gene de interes integrndu-se n genomul gazdei. b) Fuziunea protoplatilor cu lipozomi. Lipozomii sunt microformaiuni celulare protejate la exterior cu un strat dublu fosfolipidic, iar n interior se gsete un mediu apos ce conine unele molecule de interes (inclusiv ADN de transfer) pentru a fi transferate n diferite celule int. Fuziunea este mediat de polietilenglicol, iar coninutul lipozomilor se amestec n citoplasm. S-a reuit regenerarea de plante transformate, ns randamentul sczut al tehnicii nu justific extinderea metodei la o producie de rutin de plante transformate. c) Electroporarea const n aplicarea unui cmp electric, de slab intensitate i un timp foarte scurt, asupra unei suspensii de protoplati ce conin ADN de transferat. Aciunea cmpului se va finaliza cu producerea de pori n membrana protoplatilor care vor primi cel puin o copie a genei strine, integrate sau nu n genom. Exprimarea genelor pasager integrate n genomul gazdei se va realiza rapid, fapt ce ofer posibiliti semnificative de extindere a acestei tehnici. d) Tunul de particule este o tehnic ce face posibil forarea penetrrii ADN-ului de transfer dup ce, n prealabil, a fost fixat electrostatic de o particul de tungsten sau aur. Noile particule create sunt accelerate i, cu o foarte mare vitez, sunt proiectate n celule int. n ciuda faptului c este destul de brutal, aceast tehnic este mult utilizat datorit randamentului crescut i eficacitii deosebite. e) Microinjeciile sunt de asemenea utilizate n transferul de ADN, ns rezultate notabile s-au nregistrat mai mult la celulele animale. n ultima perioad s-au efectuat ncercri i la celule vegetale, cum ar fi grunciorii de polen n curs de germinare, numai c rezultatele au fost slabe, chiar dezamgitoare. e) ncorporarea de organite celulare n protoplati. Aceast tehnic a atras atenia specialitilor, n primul rnd, la transferul de cloroplaste de la o specie la alta, n scopul corectrii unor sisteme fotosintetizante deficiente. 4.7.4. Strategii sens i antisens Prin aplicarea tehnologiilor de transfer a unor gene de interes n genomul altor specii de plante are loc integrarea genelor strine n genomul gazd i crearea practic a unor organisme vegetale cu structura genetic modificat, acest modalitate de transfer constituind strategia sens. De asemenea, prin tehnologia ADN-ului recombinat, se pot crea organisme deosebite, n sensul diminurii unei funcii, respectiv o diminuare a expresiei unui caracter deja existent n genomul iniial, ceea ce constituie strategia antisens. Strategia antisens reprezint, de fapt, o modulare a expresiei unei gene prin realizarea i exprimarea unui ARN m complementar celui de baz (rezultat n urma transcripiei iniiale). Din punct de vedere funcional, expresia genei iniiale este diminuat sau chiar suprimat (gen blocat). n acest mod s-au obinut exemplare de petunii albe (necolorate) n urma blocrii genei care controleaz sinteza de flavonoide cu rol n coloraia florilor. De asemenea, printr-un procedeu asemntor, s-a reuit reducerea cantitativ a sintezei de lignin n fibra lemnoas , proces controlat de aa numita gen cad. Strategia sens, dimpotriv, conduce la o supraexprimare a expresiei anumitor gene, modificate sau nu. 4.7.5. Realizri n sectorul agricol Prin intermediul bacteriei Bacillus thuringiensis din sol s-au putut produce cristale proteice foarte toxice pentru mai multe specii de insecte fitofage, respectiv lepidoptere i coleoptere, n stadiul larvar. Genele de transfer au fost realizate n urma modificrii ctorva

52

secvene nucleotidice care au fost apoi amplificate i, n consecin, nivelul de proteine toxice s-a mrit considerabil (cca. 100 ori). Astfel s-au obinut varieti modificate genetic la specii de tutun, rapi, tomate, cartof i porumb. Aceast nou caracteristic, respectiv de rezisten crescut la insectele fitofage, are un caracter monogenic i, n consecin, exist un risc destul de important n ceea ce privete o eventual depreciere a rezistenei pe vertical la noile varieti create. Efectele nedorite ale unei astfel de situaii sunt totui mult mai reduse la speciile cultivate, acestea fiind plante cu cicluri scurte de via (1-2 ani) i care permit modificarea setului genetic ntr-un timp relativ scurt. n schimb, la arbori, specii forestiere multianuale, posesori ai unor structuri genetice extrem de complexe i stabile, efectele privind afectarea rezistenei pe vertical ar fi devastatoare, ntruct este practic imposibil de a se modifica din mers setul genetic iniial ct, mai ales, a celui modificat. Gene modificate de origine vegetal pot aciona, de exemplu, ca inhibitori ai sintezei unei enzime foarte importante din categoria proteazei (IP), ceea ce conduce la imposibilitatea efecturii digestiei materiilor ingerate de ctre insectele fitofage. n ceea ce privete rezistena la micoze i viroze, sunt semnalate unele rezultate notabile doar la civa virui. Mult mai avansate i cu rezultate mult mai importante se nregistreaz cercetrile privind rezistena la erbicide. n acest sens, sunt deja cunoscute realizrile privind rezistena cerealelor i a rapiei la Round-upR i BastaR. De notat faptul c marile firme productoare ale acestor produse investesc masiv n realizarea de cercetri i n acest domeniu al crerii de OMG cu rezistene sporite. n practica ameliorrii agricole, una dintre direciile importante de cercetare este legat de interesul obinerii seminelor unor hibrizi puri (100%). n cazul speciilor dioice, acest lucru se poate realiza fr probleme deosebite, ns la speciile monoice situaia este mai complicat. Totui, prin utilizarea unei gene de androsterilitate cu spectru larg, este posibil obinerea de hibrizi puri 100% i la aceste forme de plante. Acest fapt s-a realizat la porumb prin utilizarea androsterilitii (prin gena de androsterilitate) la una din liniile parentale. Tot cu ajutorul genelor modificate s-au putut prelungi semnificativ perioadele de conservare (pstrare prelungit) a fructelor unor specii (ex. la tomate) prin inhibarea producerii de melanin. De asemenea, pe baza genelor modificate se pot modifica compoziiile iniiale ale unor acizi aminai rari i convertirea lor n lipide speciale, sau se pot obine compui cu importan farmaceutic, lignin sau ali produi de interes. 4.7.6. Realizri n silvicultur Spre deosebire de plantele cultivate, arborii sunt cu mult mai puin receptivi la aplicarea i dezvoltarea tehnologiilor privind transferul de gene datorit complexitii lor structural morfologice i genetice, longevitii i trsturilor fiziologice deosebite. Dup cum s-a menionat deja, eventuala prbuire a rezistenei pe vertical ca urmare a transferului i integrarea n genomul unui arbore a unei gene modificate, cu rezisten crescut la o insect fitofag, de exemplu, ar constitui un mare handicap, cu att mai mult cu ct o modificare a ntregului set cromozomial, la nivel de populaie, ar fi practic imposibil de realizat ntr-un interval de relativ scurt de timp, ca n cazul speciilor cultivate. De aceea, la speciile lemnoase orice iniiativ privind introducerea unor astfel de tehnologii de vrf trebuie abordat cu mult chibzuin i discernmnt, cu mare pruden de la caz la caz i numai dup o temeinic documentare privind existena unor riscuri majore asupra destabilizrii structurii ereditare de baz. Totui, la unele angiosperme lemnoase (ex. la plop), cu nmulire vegetativ facil i cu cicluri mai scurte de producie (25-30 ani), s-au putut obine, relativ uor, varieti

53

modificate genetic, pornind de la cteva celule i de la care, ulterior, prin culturi in vitro i micropropagare, s-au edificat formaiuni forestiere monoclonale (fig. 23). n ceea ce privete obinerea unor varieti cu rezisten crescut la unele insecticide, cercetrile pe aceast linie nu au nregistrat deocamdat rezultate spectaculoase, dar au fost create varieti prin modificarea unor gene ce codific sinteza unor toxine ale bacteriei Bacillus thuringiensis mpotriva unor insecte xilofage. Principiul const n inhibarea sintezei proteazei, enzim foarte important n ceea ce privete digestia produilor ingerai de ctre insectele respective. n prezent, noi programe vizeaz modificarea cantitativ i calitativ a ligninei din fibra lemnoas, aplicnd o strategie antisens care determin o subexprimare a genei codificatoare a sintezei acestui produs. n acest sens se pot utiliza tehnici directe de transfer a genelor modificate (protoplati sau tunul de particule), dar i cele indirecte prin intermediul plasmidului de Agrobacterium sp.

Figura 23. Cultur de plopi transgenici (dup Nanson, 2005) Raportul diminuat lignin/celuloz, n favoarea celui de celuloz, intereseaz productorii de hrtie. Invers, cnd interesul se manifest pe linia proprietilor mecanice, atunci conteaz mai mult coninutul n lignin. n orice caz, pentru ambele scopuri se pot obine, de exemplu, dou clone de plop, n ciuda unor inconveniente de ordin economicofinanciar. n concluzie, utilizarea transferului de gene sau combinaii de gene modificate n vederea crerii i utilizrii OMG n ecosistemele forestiere este privit, n stadiul actual al cunotinelor, cu rezerv i pruden de ctre marea majoritate a specialitilor silvicultori i chiar cu ostilitate de ctre ecologiti. 4.7.7. n loc de concluzii La nceputul acestui mileniu, presa a fost inundat de articole contradictorii cu privire la utilizarea biotehnologiilor, n special cele privind transferul de gene modificate i crearea organismelor modificate genetic OMG, n cadrul activitii de ameliorare a animalelor domestice i a plantelor de cultur. Urmarea a fost declanarea unei dispute aprinse ntre diveri poli ai societii ce includ micri i partide ecologiste, companii
54

multinaionale, sectorul agricol i forestier, consumatori. Pe cadrul discuiilor sunt abordate diverse categorii de probleme ca cele legate de patrimoniul genetic, de securitate alimentar, de aprare a drepturilor consumatorilor, etc. n domeniul culturilor agricole, marile firme (companii) multinaionale fac uriae presiuni pentru a se admite pe pia produsele lor cele mai avansate, produse care includ i sunt sub sigla OMG. Mai mult, firmele americane de profil nu vor ca produsele lor s fie etichetate, ceea ce i mpiedic pe consumatori (marii productori agricoli) s achiziioneze cu aceste produse n cunotin de cauz. n contradicie cu aceast poziie, Parlamentul Europei de la Strassbourg susine ideea ca OMG pe pia s nu depeasc 0,9% din totalul produselor de profil i acestea s fie menionate i, prin urmare, cunoscute. Sistemul OCDE (Oficiul de Cooperare i Dezvoltare Economic) privind certificarea materialului reproductor (inclusiv forestier) este actualmente n impas dei este recunoscut oficial i de ctre S.U.A., care ns nu renun la pretenia lor. Asupra acestor ultime aspecte menionate sunt necesare cteva clarificri. Pentru nceput, trebuie menionat faptul c marile firme (n special cele din SUA) investesc sume enorme n cercetarea procesului transferului de gene, obinnd varieti superperformante privind unele trsturi cu impact asupra productivitii sau rezistene i tolerane deosebite. Prin inducerea autosterilitii asupra seminelor, prin tehnici specifice ingineriei genetice, aceste varieti nu pot fi multiplicate de ctre agricultorii rilor care le achiziioneaz. Acest tip de monopol constituie un impediment serios pentru statele care utilizeaz acest tip de material biologic, cu att mai mult pentru rile n curs de dezvoltare. Legat de aceast problem, firmele n cauz rspund c aceast autosterilitate este indus seminelor varietilor modificate genetic pentru a se evita contaminarea cu polen provenit de la populaiile indigene (problema este cel puin discutabil!). Cert este faptul c, sub aspect financiar, noile varieti obinute i distribuite sunt mai degrab n avantajul marilor firme productoare de semine modificate genetic dect n avantajul consumatorului (productorii agricoli). n alt ordine de idei, numeroase discuii i chiar semne de ntrebare se pot ridica asupra unor aspecte de ordin strict genetic. Astfel, genele modificate provin adesea de la unele specii total diferite de specia gazd (prin utilizarea de intermediari aparinnd unor virui, bacterii sau chiar celule animale). De asemenea, cile utilizate pentru transferul de gene sunt, n unele cazuri, nesigure sau brutale (vezi tehnica utilizrii tunului de particule). n atare situaie nu se poate afirma cu certitudine care gene, exceptnd cele int, sunt aduse (importate) i nici cum acestea se insereaz n genomul gazdei. Mai mult, este foarte probabil instalarea unui dezechilibru datorat apariiei fenomenului de epistazie, existnd n acest caz o interaciune complex cu genele deja existente. Acestea din urm se pot inactiva sau, din contr, pot intra ntr-o stare de supraactivare. Anumite gene (ex. la rapi, cele legate de rezisten la erbicide) pot migra foarte uor dintr-un ecosistem agricol n altul prin hibridare n genomul unor buruieni (ierburi rele) care aparin aceleai familii (cazul mutarului de cmp), conferindu-le i acestora o rezisten sporit la erbicide. n consecin, este necesar aplicarea unor cantiti mult mai mari de erbicide pentru a le controla i pe acestea din urm. n acest caz, este indubitabil faptul c avantajele vor de partea firmelor furnizoare de erbicide, iar dezavantajele, din pcate, vor fi de partea agricultorilor i a mediului nconjurtor. Fenomenul odat produs are efectele ireversibile datorit faptului c genele deja rspndite, cu greu mai pot fi extrase (eliminate) din populaia respectiv. Nu puini susin i ideea c genele modificate i, mai ales, proteinele noi care se sintetizeaz, n urma ingerrii de ctre consumatori n-ar fi perfect digerate i ar trece accidental n circuitul sanguin. n acest mod ar rezulta maladii grave, de tipul Kreutzfeld-

55

Iacob, ca n cazul sindromului vacii nebune, sau mai uoare, ca alergii la noile proteine ale cror efecte de acumulare nu sunt previzibile. n domeniul forestier, cercettorii pot crea clone cu material genetic modificat, ns cu mare dificultate i aceste formaiuni (de ex. la plop) au dezavantajul de a fi create n sistem monoclonal. Aceste pduri sunt extrem de fragile pentru c n-au variabilitate genetic i, n cazul unor atacuri masive de duntori sau boli (rugini n special), pot fi foarte uor distruse, n proporie de 100%. Acest fapt poate cauza adevrate catastrofe ecologice datorit controlului monogenic al rezistenei la un anume duntor sau parazit dar, n schimb, este complet bulversat rezistena vertical (pe ansamblu) a arboretului. Pe de alt parte, un program complex de ameliorare forestier va avea n vedere ameliorarea principalelor trsturi ale arborilor, n acest sens criteriile de selecie n silvicultur sunt cel mai adesea de ordin cantitativ (creteri), trsturi extrinseci (forma) i intrinseci (calitatea lemnului) sau de rezisten i adaptare. Ori, dup cum se cunoate, n majoritatea cazurilor, aceste caractere sunt supuse controlului unui numr mare de gene, iar un program de ameliorare att de avansat, la ora actual este practic imposibil de aplicat n silvicultur. De aceea majoritatea geneticienilor din silvicultur vor fi obligai s in cont de toate aceste aspecte i s adopte o atitudine precaut n abordarea i punerea n practic a diferitelor programe de ameliorare forestier, innd cont de ciclurile lungi de via ale arborilor i de complexitatea structurii lor morfologice i ereditare. n silvicultur, lipsa prudenei n ceea ce privete adoptarea unor strategii raionale i eficiente n ameliorare poate crea un dezastru ecologic pe mari suprafee i cu urmri catastrofale pentru perioade lungi de timp (zeci, chiar sute de ani). Metodele clasice utilizate n ameliorarea forestier, precum selecia i hibridarea, au fcut de mult dovada eficienei lor i nu prezint nici un pericol pentru integritatea unei populaii dac sunt practicate raional i eficient. n acest sens, condiia de baz este de a se menine permanent un grad minimum de variabilitate genetic intra i interpopulaional. Pe de alt parte nu trebuie, sub nici o form, abandonate cercetrile n acest domeniu de vrf al biotehnologiilor, respectiv transferul de gene modificate, crearea i utilizarea OMG. Este necesar ns aprofundarea acestor studii i cercetri n cadrul universitilor i institutelor de cercetare de renume n domeniu, studii ce vor fi axate cu precdere pe aspecte fundamentale pe termen lung legate, n primul rnd, de nelegerea mecanismelor de baz la nivel molecular. Cnd aceste mecanisme vor fi pe deplin elucidate i nelese, atunci se va putea face o evaluare corect a raportului costuri-riscuri / beneficii, nainte ca rezultatele cercetrilor s fie implementate n ameliorarea genetic a arborilor. Deocamdat, acest raport pare a fi unul clar n defavoarea silvicultorilor.

56

V. PRINCIPIILE SILVICULTURII CLONALE Multiplicarea vegetativ reprezint indiscutabil metoda cea mai utilizat n cadrul silviculturii clonale, fapt datorat progresului spectaculos al tehnologiilor n domeniul fiziologiei plantelor (inclusiv la speciile forestiere). Prin urmare, aceste tehnici ocup n prezent un loc foarte important n practica ameliorrii silvice, fiind practic nelipsite din multiplele programe sau etape de ameliorare la cele mai importante specii de arbori. nmulirea vegetativ se bazeaz pe aptitudinea majoritii speciilor de plante de a putea reconstitui un exemplar identic cu el nsui, plecnd de la un organ (tulpin, rdcin, frunze), de la un esut sau chiar de la o celul (Lucu, 1998). 5.1 Tehnici de multiplicare vegetativ n ceea ce privete speciile forestiere, numai cteva se preteaz la multiplicarea vegetativ de rutin (eucalipt, sequoia, molid, pin, cire, plop, slcie, tei). Restul speciilor de arbori dovedesc o afinitate mult mai redus n ceea ce privete obinerea facil de butai, drajoni sau inoculi in vitro. Prin urmare, la acestea din urm, costurile ridicate i punerea cu dificultate n aplicare a acestor tehnici nu justific efortul de iniiere i dezvoltare ulterioar a unor programe silviculturale n sistem clonal. 5.1.1. Altoirea Altoirea este una din cele mai vechi metode (tehnici) horticole, succesul acesteia depinznd de specie, tipul altoaielor i de epoca altoirii. Altoirea n cap este recomandat pentru nfiinarea de livezi de semine, n vederea obinerii unor creteri rapide i armonioase a plantelor, precum i a reducerii timpului necesar de producere a seminelor (Pinus, Picea, etc.). n cadrul lucrrilor de ameliorare a arborilor, altoirea este intens utilizat la nfiinarea livezilor semincere de clone. n efectuarea lucrrilor de altoire trebuie s se in cont de cteva principii de baz, i anume: - contactul ntre altoi i portaltoi trebuie s fie ct mai strns n vederea realizrii unei perfecte sudri a esuturilor, mai ales a cambiului ca zon generatoare a ambelor componente; - portaltoii trebuie s fie puiei provenii din smn, bine dezvoltai (la rinoase, diametrul la colet s fie de 6-8 mm iar la foioase de minimum 10-12 mm), sntoi, s aib creteri active, coaj neted i o bun nrdcinare; - altoaiele se recolteaz, de regul, n perioada de repaus vegetativ (ntre octombrienoiembrie i martie-aprilie). Pentru altoirile de var (luna august), recoltarea altoaielor se face cu maximum 2 zile naintea lucrrii. n funcie de poziia florilor, recoltarea altoaielor se face fie din treimea mijlocie a coroanei pentru un raport echilibrat ntre inflorescenele mascule i femele (ex. la pin) sau din oricare parte a coroanei la speciile cu flori hermafrodite (ex. la salcm); - confecionarea altoaielor se face din lujeri viguroi, n vrst de 1-2 ani, cu o lungime de cca. 20 cm, iar dup recoltare, altoaiele se leag n mnunchiuri de cte 25-30 buci cu etichet; - pstrarea altoaielor se va face n ncperi cu suficient umiditate i o temperatur care s nu le permit intrarea n vegetaie, n situaia de nclzire a vremii.

Altoirea n ser este mai uoar i mai sigur dect altoirea n aer liber, beneficiind de unele avantaje cum ar fi: adpost fa de condiiile nefavorabile de mediu, un regim reglabil de intensitate luminoas temperatur i umiditate si poate fi practicat i iarna. Dezavantajele constau n costurile ridicate privind investiia, nclzirea, materialele i, nu n ultimul rnd, riscul apariiei unor boli criptogamice. Acest tip de altoire se poate practica la rinoase i la unele foioase (fag). Altoirea n aer liber, respectiv n livezile de semine, prezint unele mari avantaje, n sensul c este mult mai puin costisitoare dect altoirea n ser i materialul biologic nu trebuie s suporte att de multe manipulri ca n cazul precedent. Totui, acest tip de altoire trebuie s se execute pe timp cu suficient umiditate atmosferic, cer nnorat, fr vnturi uscate i calde, toate aceste condiii la un loc fiind greu de ndeplinit pentru perioade mai lungi de timp. Anumite specii (duglas) prezint fenomene de incompatibilitate pe o perioad mai mare sau mai mic de timp. n acest caz, se selecioneaz portaltoaie compatibile care vor produse din smn sau din butai. 5.1.2. Marcotajul Marcotajul reprezint metoda vegetativ prin care este provocat formarea de rdcini pe un ram nedetaat (n prim faz) de arborele mam. Dezvoltat iniial n domenii ca horticultura, pomicultura sau horticultura, tehnica inducerii i formrii rdcinilor pe ramuri nedetaate iniial s-a aplicat, treptat i cu bune rezultate, la unele specii de arbori. Operaii ca inelarea scoarei i aplicarea unor tratamente cu substane rizogene (mai ales cele din categoria auxinelor), precum i crearea mediului necesar dezvoltrii rdcinilor (sub form de muuroaie la marcotaj n lstar sau sub form de manon la marcotaj aerian), stau la baza nrdcinrii i separarea noii plante de arborele mam. Aceast tehnic este complex i relativ costisitoare i, n consecin, se recomand a fi aplicat drept completare sau n caz de eec la aplicarea altor tehnici vegetative(ex. la nuc). 5.1.3. Drajonarea Este fenomenul prin care se produc lujeri tineri pe rdcini. Anumite specii (cire slbatic, tei, plopi hibrizi) au capacitatea intrinsec de a dezvolta aceste formaiuni specifice, rezultnd adevrate buchete de drajoni, iar fiecare dintre acetia reprezent o clon. Aceste formaiuni se pot preleva fie n mnunchiuri de 50-100 buci (lungime de cca. 8-10 cm) i care se pot instala n ser, fie cte 2-3 lujeri, lungi de 20 cm i care se pot instala n pepinier. Important este faptul ca aceti lujeri s fie recoltai de pe plante tinere, n vederea inducerii rapide i eficiente a procesului de nrdcinare. 5.1.4. Butirea Butirea reprezint probabil tehnica cea mai veche dar i cea mai utilizat n silvicultura clonal, aceasta n scopul rspndirii materialului selecionat i ameliorat (molid, pin, cire, slcii, plopi). Butaii de calitate se disting mai ales prin capacitatea lor deosebit de nrdcinare, iar factorii de care depinde calitatea butailor sunt legai de vrsta arborelui mam i de starea fiziologic a materialului vegetal, ca factori endogeni, respectiv de condiii de butire sau aplicare de tratamente factori exogeni. naintarea n vrst conduce invariabil la o descretere a capacitii de nrdcinare a butailor i, implicit, la scderea calitii materialului. Descreterea poate fi brusc (ex. la nuc) sau progresiv (larice sau molid). Poziia lujerilor pe ramuri poate, de asemenea, influena direct calitatea viitorilor butai. Astfel, lujerii din vrful ramurilor sau cei provenii de la ramurile aflate la baza coroanei sunt mai tineri i pot furniza butai de calitate superioar, cu un procent superior 58

de nrdcinare. Ca anotimp, este recomandabil ca la rinoase, recoltarea s se fac nainte de intrarea n vegetaie, pe cnd la foioase chiar n plin sezon de vegetaie, n faz activ de cretere. Legat de factori exogeni, mediul de butire poate avea adesea o influen decisiv asupra procesului de formare i dezvoltare a unor rdcini de bun calitate la butai. Se cunoate faptul c la duglas, un procent mai mare de pietri n mediul de butire induce formarea unor rdcini groase, puin ramificate i fragile la repicaj. Dimpotriv, utilizarea unor medii cu un coninut mai ridicat de turb favorizeaz formarea de rdcini fine, lignificate i ramificate, favorabile repicajului. Exist o relaie direct ntre factorul termic i umiditatea mediului de butire, n sensul c la o umiditate suficient, butaii pot nrdcina destul de bine i la temperaturi mai mari sau mai sczute, ns optimul termic al mediului este cel cuprins ntre 21- 24oC. ntre aceste limite ale temperaturii, viteza de nrdcinare este cea mai favorizat. n ceea ce privete administrarea unor substane active (simple sau combinaii), pe baza cercetrilor efectuate, se poate afirma c aplicarea acestor produi, n anumite concentraii, combinaii sau n anumite etape fiziologice de cretere, au o influen benefic pentru butaii aparinnd majoritii speciilor forestiere. Cele mai indicate substane, n acest sens, sunt cele aparinnd grupei auxinelor (AIA, ANA, AIB, etc.) ce au un efect rizogen recunoscut. Strategii de butire Dezvoltarea i aplicarea pe scar tot mai larg a acestei tehnici de nmulire vegetativ n pomicultur i viticultur au creat premize favorabile stabilirii i adoptrii unor programe i chiar strategii de butire i n silvicultur. - Multiplicarea clonal a arborilor vrstnici. Nu este indicat a se utiliza n mod direct butai prelevai de la arbori vrstnici, deoarece aceti butai nrdcineaz foarte greu i, n final, rezult plante de calitate mediocr. n prezent, sunt puse la punct tehnici de revenire le un anumit stadiu de juvenilitate a zonei de interes la un astfel de arbore Aceste tehnici favorizeaz dezvoltarea mugurilor iniiai de mai muli ani dar care au fost meninui reprimai. n acest scop, se procedeaz la executarea unor tieri severe, sau la tierea puieilor aproape de pmnt (recepare), aceste operaii permind multiplicarea vegetativ la unele specii importante de rinoase (pin) sau foioase (stejar, nuc, frasin). De asemenea, rejuvenilizarea se mai poate realiza i prin executarea unor altoiri repetate pe rsaduri tinere (ex. la duglas, pin, eucalipt). n ciuda faptului c toate aceste tehnici necesit timp i se efectueaz cu costuri destul de ridicate, totui ele sunt dezvoltate n cadrul activitilor specifice de nfiinare a unor parcuri de arbori-mam de butai sau chiar n anumite etape ale unor programe de ameliorare forestier. - Multiplicarea cu selecie clonal n pepinier constituie o important metod pentru multiplicarea materialului juvenil i fost aplicat, prima dat, la molidul comun, n Germania. Este recomandabil de a se preleva un numr ct mai mare de clone (cteva mii), deoarece este greu a se depista exemplarele valoroase la vrste mai fragede. n plus, definitivarea seleciei se realizeaz pe parcursul mai multor etape ale testelor clonale. Meninerea stadiului de juvenilitate se poate realiza prin butire ciclic i meninerea clonelor sub form de nuieli - Multiplicarea n vrac a provenienelor constituie o alt variant strategic n cadrul programelor de silvicultur clonal i depinde de stadiul de avansare a programelor de ameliorare. Sistemul de butire aplicat la populaiile semincere conduce la obinerea rapid de plantaii foarte performante, permind totodat i meninerea juvenil a parcurilor de arbori-mam. Exist posibilitatea ca, la apariia primelor simptome de 59

maturare-mbtrnire la butai, respectivele exemplare s fie nlocuite cu noi rsaduri obinute din acelai lot de semine. Dezavantajul const n costul ridicat al activitii, situaie datorit echipamentelor sofisticate necesare creterii i formarea plantelor, ct i pentru realizarea butirii (ex. la Picea mariana) (Lucu, 1988). 5.1.5. Micropropagarea in vitro nmulirea in vitro a plantelor poart denumirea de micropropagare (micromultiplicare sau micronmulire). Este o form de multiplicare vegetativ i asigur un randament net superior, n comparaie cu alte procedee practicate, pn n prezent, n horticultur i silvicultur. Micropropagarea se face prin minibutire in vitro, atunci cnd plantulele din culturile primare sunt bine dezvoltate, cu rdcinie, tulpinie i frunzulie bine individualizate i viguroase. Minibutaii rezultai sunt trecui, n condiii aseptice, pe medii de cultur noi i vor forma culturile secundare. Faptul c ntr-un timp relativ scurt (n mai puin de un an) se pot obine, prin micropropagare, milioane de exemplare (copii fidele ale plantei donatoare), forme care n condiii obinuite s-ar obine foarte greu sau nu ar putea supravieui, reprezint un ctig enorm privind eficiena i implicaiile practice ale acestei metode n ameliorarea unor importante specii forestiere. De asemenea, prelevarea i cultura in vitro de meristeme asigur obinerea i multiplicarea unui material biologic sntos, liber de virui (Frti, 2002). 5.2. Utilizarea clonelor. Sistemul de cultur a clonelor, devenit deja de rutin pentru unele specii care butesc uor (ex. la plopi i slcii), a cptat o nou dimensiune prin extinderea la tot mai multe specii forestiere. 5.2.1. Modele de silvicultur clonal Cultura clonelor la salicacee i specii ale genului Criptomeria se practic de mai mult vreme, acestea devenind ntre timp modele de referin (modele clasice) pentru rezolvarea problemelor apar la alte specii forestiere. Un modelul mai recent al aplicrii culturii clonale, cum este cel adoptat la eucalipt, prezint o serie de rezultate interesante i ncurajatoare prin butire erbacee i a avut un succes notabil n Congo, ar n unde s-au plantat n sistem industrial cca. 25.000 ha. Pentru reuita acestui program, s-au adaptat pepinierele la cultura de butai erbacei, s-a lucrat n sistem mecanizat, iar ecartamentul plantaiei a fost mrit de la 3m x 3m, la 4m x 4m. n acest mod, s-a nregistrat loc o cretere considerabil a ctigului genetic n ceea ce privete producia de lemn i producia de past (de 3, respectiv 5 ori). 5.2.2. Tentative noi n silvicultura clonal n unele ri ale Europei (ex. Suedia, Frana), molidul constituie obiectul predilect al noilor tentative privind introducerea varietilor policlonale, n acest sens fiind puse la punct unele programe de multiplicare vegetativ (inclusiv in vitro). De asemenea, sunt n plin desfurare aciuni vaste de instalare a unor plantaii clonale, n sistem industrial, la Sequoia, bazat pe un program sistematizat de introducere, selecie i clonare, cu rotaie la 15-18 ani. Cercetri i experimente n acest sens s-au mai ntreprins la pin, precum i alte specii de rinoase. Tot acest ansamblu de tehnici i programe circumscrise sistemului de cultur clonal permite, n final, multiplicarea n mas a descendenilor foarte avantajoi, evitndu-se apariia mbtrnirii prin multiplicarea de rsaduri foarte tinere (Lucu, 1988). 60

Noi tentative de cultur n sistem clonal sunt aplicate i la multe specii de foioase, la unele dintre acestea nregistrndu-se succese notabile. Astfel, n ceea ce privete populicultura n zone hidromorfe din Frana a fost iniiat i pus la punct un amplu program prin care s-au selectat exemplarele cele mai bune din cadrul populaiilor artificiale hibride cu testare n teren. n acest fel, s-au rentabilizat i solurile hidromorfe datorit varietilor adaptate la aceste condiii, varieti care produc totodat i lemn de derulaj de bun calitate. S-a adoptat, pentru mai mult siguran privind adaptabilitatea, sistemul culturii n parcele policlonale i cu o densitate mai mare, respectiv de 500-600 exemplare la ha. n ceea ce privete cireul slbatic, tot n Frana, au fost iniiate i perfecionate programe n ceea ce privete micropropagarea, dup rentinerire, prin drajonare. Modelul congolez privind cultura vegetativ n sistem industrial a eucaliptului a fost reluat n Frana, unde s-au instalat cca. 25.000 de ha de parcele monoclonale, n imediata vecintate a uzinelor de celuloz i hrtie, cu rotaie a culturilor de 8-10 ani i producie de cca. 20 t/an/ha. 5.2.3. Riscuri i limite n silvicultura clonal Adoptarea oricrei strategii sau program de silvicultur n sistem clonal presupune adoptarea unor msuri prealabile necesare pentru a se evita apariia unor riscuri majore legate mai ales de ngustarea drastic a bazei genetice n cadrul populaiei de plecare. Reducerea bazei genetice implic cele mai mari riscuri, deoarece populaia n cauz i reduce enorm potenialul de adaptabilitate n cadrul staiunii respective, dovedind o tot mai mare lips de uniformitate n ceea ce privete reacia la aciunea diferiilor factori nocivi biotici i abiotici. Pe aceast linie, rezistena pe ansamblu a populaiei diminueaz vizibil, iar cele mai expuse pericolului de destabilizare a echilibrului genetic sunt parcelele monoclonale. Pentru a se prentmpina apariia acestor nedorite efecte, este necesar, ca la demararea oricrui program de ameliorare bazat pe sistem silvic clonal, s se in cont de unele msuri extrem de utile n acest sens: - alegerea celor mai bune staiuni i situri mecanizabile; - utilizarea numai a fazei juvenile a creterii speciilor; - utilizarea de genotipuri cu un grad foarte mare de heterozigote, posednd gene de la mai multe proveniene sau specii; - asigurarea unei diversiti genetice i a unui numr de clone direct proporional cu suprafaa plantat i cu vrsta de exploatabilitate; - selecia iniial n ce privete rezistena orizontal (tolerana poligenic la mai multe adversiti); - selecia final n ce privete rezistena vertical (la un patogen precis i care depinde de puine gene); - ameliorarea genetic permanent, prin introducerea de noi clone la fiecare rotaie, mai performante, mai productive i mai rezistente; - suprafa total relativ redus (Lucu, 1998).

61

VI. CONSERVAREA RESURSELOR GENETICE FORESTIERE 6.1 Definiie, generaliti i grupe de resurse genetice la principalele specii de arbori Resursele genetice vegetale cuprind aproape toate formele de plante superioare (de la cele slbatice sau primitive pn la cele ameliorate), care pot aduce cea mai mare contribuie la sporirea adaptabilitii i a rezistenei la agresiunea mereu crescnd a factorilor biotici i abiotici. Toate aceste forme de plante asigur amelioratorilor (creatori de noi soiuri, hibrizi i varieti) materialul de plecare necesar derulrii i realizrii cu succes a unor programe complexe i eficiente de ameliorare. ansele realizrii acestor programe cresc cu ct acest material biologic este mai diversificat, mai bine evaluat i, cel mai important, mai bine conservat. Resursele genetice forestiere (RGF) sunt reprezentate de acele fonduri de gene (germoplasm forestier) care pot exprima la nivelul unei populaii (unitate de baz n genetica populaiilor) o diversitate genetic intraspecific larg, nsuiri cantitative (auxologice - specifice bioacumulrilor) i calitative deosebite i, nu n ultimul rnd, o mare capacitate de adaptare i rezisten sporit la factorii abiotici i biotici. Acest concept cuprinde asociaii de arbori arborete naturale i unele artificiale, cu specii autohtone sau exotice, pe suprafee mai mari sau mai mici, toate reprezentnd culturi forestiere de mare interes tiinific, economic i practic pentru prezent, dar mai ales pentru viitor. Valoarea strategic (de perspectiv) a acestor comuniti de arbori ce conin fonduri de gene deosebit de valoroase nu exclude, de multe ori, valoarea practic imediat sau economic. Este cazul unor arborete din care, cu anumite limite, se recolteaz periodic anumite cantiti de semine. La noi n ar, fondul valoros de germoplasm forestier ocup un loc de prim rang n ceea ce privete fondul strategic de perspectiv al continentului european (tab. 3). Cele mai importante specii forestiere din ara noastr prezint populaii mari de arbori, cu o structur genotipic foarte complex, relieful carpatic armonios permind transformri i readaptri continue ale tuturor populaiilor de arbori autohtoni. Prin urmare, aceste arborete sunt deosebit de dotate sub aspectul creterilor i bioacumulrilor, nsuirilor calitative ale tulpinilor, coroanelor i lemnului, capacitate ridicat de regenerare i adaptare la diverse condiii ecologice. Molidul n ara noastr aparine varietii montana i, din multe puncte de vedere, se prezint ca o grup destul de unitar. n mod deosebit, formele din Carpaii Orientali se remarc printr-o vitalitate sporit, o mare capacitate de biosintez, lemn cu caliti deosebite i un mare grad de variabilitate. Capacitatea de regenerare este maxim la molidiurile din Valea Bistriei i Depresiunea Ciucului (Stnescu, 1998). Tot n Carpaii Orientali (Bucovina, Maramure) dar i n bazinul superior al Mureului i are exclusivitatea molidul de rezonan, form la care lemnul, cu inelele sale regulate i cretere uniform n direcia longitudinal, posed proprieti de ordin acustic excepionale. Manifestarea acestor nsuiri ale lemnului de rezonan este sub control poligenic i este puternic influenat de anumite condiii staionale caracteristice acestei zone.

62

Tabelul 3
Situaia actual a resurselor genetice la principalele specii forestiere din ara noastr Suprafa (ha) Denumirea tiinific Denumirea popular 2715,9 molid Picea abies 1315,8 brad Abies alba 3268,1 fag Fagus sylvatica 1728,2 gorun Quercus petraea 776,6 stejar Quercus robur 313,1 cer Quercus cerris 221,6 stejar brumriu Quercus frainetto 194,4 stejar pufos Quercus pedunculiflora 166,1 tei argintiu Tilia tomentosa 154,0 frasin comun Fraxinus excelsior 24,5 anin negru Alnus glutinosa 31,8 plop alb Populus alba 21,2 salcm Robinia pseudacacia 19,9 paltin de munte Acer pseudoplatanus 218,6 carpen Carpinus betulus 30,1 jugastru Acer campestre dup Lalu, citat de Stnescu, V., 1998

Dei este relativ unitar sub aspect morfologic, prezena anumitor obstacole ecologice a determinat totui i la molidul carpatic apariia mai multor forme i ecotipuri de ordin climatic i edafic, ca de exemplu molidul din zona munilor Apuseni ras climatic specific unei zone cu clim mai cald i umed, molidul din zonele cu discontinuiti de areal din Vile Jiului i Oltului (evoluie de natur ecologic) sau molidul cu o oarecare izolare reproductiv din depresiunile intramontane din bazinele superioare ale rurilor Mure i Olt, aceste regiuni fiind caracterizate de un climat rece, srac n precipitaii i cu ngheuri timpurii frecvente. De asemenea, n zona Carpailor de Curbur, molidul este cantonat n populaii reprezentative aflate ntr-un climat bogat n precipitaii i cu ierni lungi. Bradul (Abies alba Mill.) avea n zona rii noastre un areal mult mai ntins n perioada interglaciar, retrgndu-se apoi treptat, astfel c n urma ultimei glaciaiuni s rmn cantonat n regiuni de cmpie sau cu mici i izolate refugii carpatice (Moldova, Muntenia, Transilvania, Banat i Oltenia)(Pop, 1932, citat de Stnescu 1998). Din punct de vedere morfologic, comparativ cu molidul, bradul prezint o variabilitate mult mai redus, deosebindu-se tipuri doar sub aspectul unor caractere distincte ale conurilor, scoarei (cu sau fr ritidom) sau ale lemnului (brad cu lemn rou sau alb). Sub aspectul creterilor active, coroane bine dezvoltate i dimensiuni excepionale, au provenienele de brad din Maramure, Bucovina, acestea fiind i cele mai reprezentative. Ca tipuri ecoclimatice, se remarc provenienele de brad din Munii Apuseni, din zona Banatului (forme relativ termofile), din bazinul superior al rului Mure, din zona Carpailor de Curbur i din vestul rii (Stnescu 1998). Un caz aparte n problematica identificrii i conservrii surselor de germoplasm la rinoase l ocup zmbrul (Pinus cembra), specie forestier caracteristic limitei superioare (subalpin) a etajului forestier. Astzi, aceast specie ocup n ara noastr zone foarte restrnse i constituie un relict al glaciaiunii cuaternare. Practic, l gsim n mici grupuri (populaii reduse i izolate) n Munii Climani i Rodnei din Carpaii Orientali dar i n masive din Carpaii Meridionali (Bucegi, Retezat, Parng, Fgra). Gradul destul de accentuat de 63

consangvinizare n cadrul acestor grupuri mici i izolate de zmbru, se caracterizeaz prin apariia unui mare numr de semine nefertile i o redus putere de adaptare la introducerea n culturi n zone mai extinse. Sub acest ultim aspect, mai viguroase se prezint numai formele de zmbru cantonate n zona munilor Climani, Rodnei i Retezat, unde specia supravieuiete pe arii mai extinse. nfiinarea, n ultimii ani, de noi zone (arii) cu statut de rezervaii (chiar parcuri naionale, cum este cazul n munii Climani) va crea posibilitatea ca unele dintre populaiile de zmbru din zon s devin surse extrem de valoroase de germoplasm, utile i nesesare refacerii zonei de limit superioar a pdurilor din arcul carpatic. Fagul (Fagus sylvatica) reprezint una dintre cele mai importante specii forestiere de la noi din ar, ocupnd unul din cele mai ntinse arealuri (aproape egal cu cel al molidului). n sistem de rezervaii de semine, aceast specie cuprinde peste 3.300 de astfel de arborete (conform datelor cartrii seminologice 1976-1978) n care este prioritar sistemul de regenerare natural (Giurgiu 1978, citat de Stnescu 1998). Acest tip de regenerare natural in situ a condus la pstrarea unui fond genetic foarte puin (chiar deloc) alterat, la acesta contribuind i lipsa unor culturi artificiale cu surse strine de germoplasm. n regim de rezervaii sunt conservate numai cteva populaii (arborete) cu un nalt grad de reprezentativitate (cca. 5% din fondul forestier la fag) i care trebuie exceptate de la tieri. Dintre aceste tipuri, se detaeaz n mod deosebit fgetele din zona de nord a Dobrogei, grupuri restrnse i izolate de arbori ce trebuie s constituie obiectul unor msuri stricte de conservare. Stejarul pedunculat (Quercus robur) deine la nivelul ntregii ri cca. 3800 ha arborete surse de semine, aceasta ca urmare a diminurii puternice a suprafeelor arboretelor de stejar din ultimii 40-50 de ani. n aceste condiii, arboretele rmase ar trebui ncadrate de urgen n categoria pdurilor de protecie (Giurgiu 1978, citat de Stnescu). Principalele rezervaii forestiere de stejar n ara noastr se gsesc n judeele Mure (Mociar), Braov (Prejmer), Neam (Vntori), Buzu (Frasin), Tulcea (Letea). Masivele de stejar pedunculat nc existente n Muntenia (Comana-Piteti-Alexandria), partea de nord a Moldovei sau n centrul Transilvaniei, impun luarea imediat a unor msuri stricte n sensul prelungirii vrstei pentru tieri spre limita exploatabilitii fizice, coroborat cu instituirea unui sistem eficient de regenerare (Giurgiu 1978, citat de Stnescu 1986). Gorunul (Quercus petraea), n momentul actual, n ara noastr, se ntlnete pe arii ceva mai extinse comparativ cu stejarul pedunculat, fiind catalogate peste 13.500 ha arborete surse de semine. Exist arborete surse de semine de categoria A (cu o mare precocitate), cu preponderen n regiunile de deal i coline ale rii noastre. Cele cu caracter marginal sunt reprezentate de populaiile de gorun din zone silvostepice (Moldova de Nord) i populaii de altitudine (Harghita, Postvarul, Perani sau Munii Dobrogei). 6.2. Importana studiului diversitii biologice n perspectiva identificrii, conservrii i utilizrii durabile a resurselor genetice forestiere Fondul de gene (gene pool) reprezinttotalitatea genelor care exist la un moment dat ntr-o populaie i care se gsesc ntr-un echilibru dinamic (Dobjansky, 1951). Genotipul este individul luat ca o unitate n care genele manifest interaciuni alelice i nealelice, alelism multiplu, polialelie sau pleiotropie. Pe de alt parte, selecia natural, acionnd asupra fenotipurilor, tinde spre o stabilizare (homeostazie genetic), fenomen 64

cunoscut i sub denumirea de coadaptare a genelor. Prin urmare, genele nu acioneaz izolat, iar fenotipurile sunt determinate n populaie de constelaia de gene existent. Homeostazia genetic nu este altceva dect o problem de coadaptare a genelor. Variabilitatea genetic este ns opusul homeostaziei genetice. Avnd ca surs primar mutaiile ce se acumuleaz de-a lungul generaiilor i ca surs secundar recombinarea genetic (redistribuirea alelelor mutante ntr-un numr enorm de combinaii), variabilitatea genetic se manifest printr-un numr foarte mare de programe genetice, diferite unul de cellalt. La organismele cu reproducere asexuat, sursa unic de variabilitate genetic o reprezint mutaia. Fenomenul sexualitii i variabilitatea genetic au o importan cu totul excepional, ele reprezentnd o garanie a adaptrii organismelor la condiiile mereu schimbtoare ale mediului nconjurtor. De aceea, studiul variabilitii genetice are o importan covritoare n situaia cnd se pune problema inventarierii i mai ales a identificrii unor categorii de arborete extrem de valoroase, respectiv clase sau categorii de resurse genetice forestiere de mare valoare (cu o mare capacitate de recombinare). Pdurile reprezint surse regenerabile extrem de valoroase, att ca furnizori de materii prime (lemn dar i produse nelemnoase) ct i pentru o serie de servicii (protecie a mediului ambiant, conservare a biodiversitii, odihn i recreere). Din pcate, n zilele noastre, tot mai ntinse suprafee mpdurite sunt supuse unor uriae presiuni i ameninri (defriri, poluri, calamiti naturale, atacuri masive de boli i duntori). De aceea, se impune cu tot mai intens acuitate problema lurii de msuri ct mai grabnice i hotrte privind protejarea i conservarea fondului forestier existent, de plantare a noi pduri cu specii de arbori mai productive i mai rezistente, precum i exploatarea ecologic i judicioas a pdurilor. O problem de foarte mare importan pentru noul mileniu, n care abia am intrat, o constituie aceea privind stabilirea i punerea n aplicare a unei strategii optime comune dintre economie i ecologie, n beneficiul societii umane. Degradarea accentuat a mediului nconjurtor la nivel planetar a constituit un subiect foarte important de dezbatere n numeroase ntruniri la nivel internaional. Fr ndoial, componenta cea mai important a naturii o reprezint vegetaia, de aceast component depinznd viaa tuturor celorlalte vieuitoare de pe pmnt, inclusiv viaa omului. Formele de plante slbatice i cele introduse n vechime n cultur, sub aciunea permanent a factorilor de mediu n foarte ndelungatul proces al evoluiei, conin n structura lor ereditar nsuiri de adaptare de mare importan pentru supravieuire. Toat aceast biodiversitate vegetal conine surse de gene extrem de valoroase, nu numai pentru supravieuirea plantelor respective dar i pentru nsi existena omului. Ecosistemele forestiere trebuie s rspund deci, la cerine din cele mai complexe, ele nsele constituind ecosisteme foarte complexe care gzduiesc o flor i o faun specific. Aceste ecosisteme dein rolul absolut majoritar n ceea ce privete purificarea i pstrarea calitii aerului, apelor i solului. Pe baza acestor considerente, se poate lesne deduce faptul c investigarea variabilitii genetice a speciilor forestiere i prezervarea pe termen lung a acestei biodiversiti reprezint, n prezent, o problem de mare importan care se ridic n faa silviculturii mondiale.

65

6.3 Conservarea germoplasmei forestiere Conservarea resurselor genetice forestiere constituie mijlocul cel mai eficient de a garanta disponibilitatea acestora pentru generaiile prezente i, mai ales, viitoare. n aceast sfer este inclus un mare numr de activiti specializate cum ar fi prospectarea, colectarea, gestiunea i schimbul de germoplasm. n situaia n care nimeni nu poate prevedea necesitile viitoare privind mediul nconjurtor i ale omului, este foarte important de a se conserva o ct mai larg variabilitate genetic n cadrul fiecrei specii. Cu ct este conservat mai mult variabilitate, cu att exist anse mai mari de a se gsi, de ctre utilizatori, caracterele (trsturile) necesare dezvoltrii unor programe eficiente de ameliorare genetic. Resursele genetice forestiere se pot conserva n cadrul habitatului lor natural conservare in situ sau n afara acestuia conservare ex situ. Ambele metode de conservare au avantaje dar i inconveniente. De aceea, pentru o sporire a eficienei activitii de conservare a resurselor genetice forestiere este necesar de a se asocia metode in situ cu alte metode ex situ. 6.3.1 Conservarea in situ a resurselor genetice forestiere Modalitile de conservare in situ implic meninerea arborilor i plantelor, n general, n habitatul original sau n sisteme agricole tradiionale. Conservarea in situ este metoda preferat n cazul mai multor esene forestiere, cu deosebire a celor din zona tropical. Comparativ cu speciile agricole care cresc n medii destul de bine controlate, majoritatea arborilor se dezvolt n medii slbatice i au cicluri lungi de via. n consecin, arborii trebuie conservai ca parte integrant a ecosistemului stabilit, medii n care se pot adapta i evolua. Cele mai importante msuri ce pot lua pe linia unei conservri in situ sigure i eficiente a celor mai valoroase surse de germoplasm forestier constau n crearea de parcuri i rezervaii naturale, rezervaii semincere, interzicerea accesului total nengrdit sau exploatare preferenial de arbori valoroi din punct de vedere fenotipic i genotipic. 6.3.1.1. Crearea de parcuri i rezervaii naturale Aceast modalitate de conservare in situ reprezint, n mod cert, aciunea de cea mai mare responsabilitate civic pe linia pstrrii patrimoniului genetic al unor populaii naturale deosebit de valoroase, aciune care solicit eforturi economice i administrative mari i un imens volum de munc privind documentarea, cercetarea i evaluarea fondului de germoplasm existent n cadrul acestor arii protejate. La noi n ar, Parcul Naional Retezat, Parcul Naional Munii Rodnei, Parcul Naional Climani i Parcul Naional Ceahlu sunt patru dintre cele mai reprezentative arii protejate, cu caracter predominant forestier i o anumit specificitate eco-geografic. Prin specificul i unicitatea lor, aceste zone constituie arii deosebit de valoroase, primele dou fiind incluse, nc din anul 1992, n dosarele MAB/UNESCO ca rezerve ale Biosferei (WCMC, citat de Enescu,1997). A. Parcul Naional Retezat, n actuala configuraie organizatoric, are o suprafa de peste 38000 ha, din care suprafaa aflat sub protecie absolut deine 9503 ha, restul fiind considerat zon tampon. (fig.7). nfiinat n anul 1935, n urma constituirii Comisiei pentru protecia monumentelor naturii, sub patronajul Academiei Romne i pe baza Legii privind protecia Naturii din Romnia, Parcul Naional Retezat se ntindea iniial pe o suprafa de 13.700 ha, extinderea 66

considerabil fiind efectuat n ultimele dou decenii prin ncorporarea unei vaste zone mpdurite. Aceste pduri dein ponderea majoritar n cele trei rezervaii ale parcului, respectiv Zlata, Piatra Iorgovanului i Gugu Piatra Mului, toate nsumnd peste 9000 ha. Vegetaia, prin distribuia i structurarea unitilor taxonomice, prezint mari variaii n special pe orizontal, reflectnd din plin marea varietate topic a zonei (roc, expoziie i forme de relief). Pdurile acoper aproape jumtate din suprafaa parcului (48.5%), n timp ce alte formaii sunt mai puin reprezentative (jnepeniuri 16,9%, pajiti alpine i stncrii 21,4%) (Botnariuc et al.,1984). Parcul, n general, are aspect de pdure ntins, iar o schematizare pe vertical a zonei se poate prezenta n linii mari astfel: - fgete pure 700 1250 m altitudine; - fgete de amestec cu rinoase (brad, molid) 1250 1450 m altitudine; - molidiuri climax 1450 1650 m altitudine; - molidiuri de limit pre i subalpine 1500 1780 m altitudine; - jnepeniuri 1780 2200 m altitudine; - vegetaie ierboas i tufriuri boreale 2150 2400 m altitudine. Sub limita de 700 m, n amestec cu fgetele, sunt prezente i amestecuri de pin cu gorun. Pdurile parcului au fost identificate ca fcnd parte din urmtoarele formaii vegetale: 15 fgete, 15 molidiuri, 13 amestecuri de fag cu rinoase i 3 pduri extrazonale (montane i de lunci nalte), majoritatea aparinnd clasei de productivitate mijlocii (Doni, citat de Enescu 1997). B. Parcul Naional Munii Rodnei, cu cele peste 46.000 de hectare cuprinse n suprafa, reprezint una dintre cele mai mari arii protejate din ar. Mai mult de 3.300 ha sunt declarate ca rezervaie a biosferei, iar parcul, pe ansamblul su, adpostete multe specii endemice din faun i flor, unele adevrate relicte glaciare. Din punct de vedere teritorial-administrativ, aceast arie protejat se situeaz pe teritorii aparinnd judeelor Maramure, Bistria-Nsud i Suceava, n grupa de nord a Carpailor Orientali, din care Munii Rodnei au cele mari cele mai mari altitudini (Vf. Pietrosul cu peste 2.300 m) i care pstreaz foarte bine urmele ghearilor din cuaternar (circuri glaciare precum Pietrosu, Buhescu Mare, Negoescu) (fig.24). Climatul n aceast zon prezint influene baltice i, datorit marilor altitudini, este destul de aspru, temperatura medie anual la peste 2.000 m fiind sub limita de nghe (-1,5oC). n ceea ce privete vegetaia forestier, n Parcul Naional Munii Rodnei se pot delimita cteva formaiuni reprezentative, innd cont de structura i tectonica munilor precum i de evoluia climatic specific urmrilor glaciaiunilor cuaternare cu platformele de eroziune ce domin relieful actual. n partea superioar a versanilor predomin molidiuri pure iar pe pantele inferioare sunt evidente amestecurile cu fagul, bradul, paltinul de munte, aninul alb i mesteacnul. La limita superioar (cca. 1800 m), destul de frecvent ntlnim jnepenii (Pinus mugo) n asociaie cu ienuperii (Juniperus communis var. nana) i mai rar exemplare de zmbru (Pinus cembra) ca diseminaii dar care au atins vrste apreciabile (peste 300 ani) i nlimi de peste 30 m (Enescu et al.,1997). Tufriuri mai mult sau mai puin compacte de jnepeni i ienuperi au rol extrem de important n meninerea unui echilibru natural relativ stabil n zon, prin limitarea unor eroziuni excesive ale solului i de atenuare a daunelor provocate de numeroasele avalane produse n zon.

67

Vegetaia, prin distribuia i structurarea unitilor taxonomice, prezint mari variaii n special pe orizontal, reflectnd din plin marea varietate topic a zonei (roc, expoziie i forme de relief). Pdurile acoper aproape jumtate din suprafaa parcului (48.5%), n timp ce alte formaii sunt mai puin reprezentative (jnepeniuri 16,9%, pajiti alpine i stncrii 21,4%) (Botnariuc et al.,1984).

Figura 24. Configuraia actual a Parcului Naional Retezat (dup MMGA,2003) Parcul, n general, are aspect de pdure ntins, iar o schematizare pe vertical a zonei se poate prezenta n linii mari astfel: - fgete pure 700 1250 m altitudine; - fgete de amestec cu rinoase (brad, molid) 1250 1450 m altitudine; - molidiuri climax 1450 1650 m altitudine; - molidiuri de limit pre i subalpine 1500 1780 m altitudine; - jnepeniuri 1780 2200 m altitudine; - vegetaie ierboas i tufriuri boreale 2150 2400 m altitudine. Sub limita de 700 m, n amestec cu fgetele, sunt prezente i amestecuri de pin cu gorun. Pdurile parcului au fost identificate ca fcnd parte din urmtoarele formaii vegetale: 15 fgete, 15 molidiuri, 13 amestecuri de fag cu rinoase i 3 pduri extrazonale (montane i de lunci nalte), majoritatea aparinnd clasei de productivitate mijlocii (Doni, citat de Enescu 1997). B. Parcul Naional Munii Rodnei, cu cele peste 46.000 de hectare cuprinse n suprafa, reprezint una dintre cele mai mari arii protejate din ar. Mai mult de 3.300 ha sunt declarate ca rezervaie a biosferei, iar parcul, pe ansamblul su, adpostete multe specii endemice din faun i flor, unele adevrate relicte glaciare.

68

Din punct de vedere teritorial-administrativ, aceast arie protejat se situeaz pe teritorii aparinnd judeelor Maramure, Bistria-Nsud i Suceava, n grupa de nord a Carpailor Orientali, din care Munii Rodnei au cele mari cele mai mari altitudini (Vf. Pietrosul cu peste 2.300 m) i care pstreaz foarte bine urmele ghearilor din cuaternar (circuri glaciare precum Pietrosu, Buhescu Mare, Negoescu) (fig. 25). Climatul n aceast zon prezint influene baltice i, datorit marilor altitudini, este destul de aspru, temperatura medie anual la peste 2.000 m fiind sub limita de nghe (-1,5oC). n ceea ce privete vegetaia forestier, n Parcul Naional Munii Rodnei se pot delimita cteva formaiuni reprezentative, innd cont de structura i tectonica munilor precum i de evoluia climatic specific urmrilor glaciaiunilor cuaternare cu platformele de eroziune ce domin relieful actual. n partea superioar a versanilor predomin molidiuri pure iar pe pantele inferioare sunt evidente amestecurile cu fagul, bradul, paltinul de munte, aninul alb i mesteacnul. La limita superioar (cca. 1800 m), destul de frecvent ntlnim jnepenii (Pinus mugo) n asociaie cu ienuperii (Juniperus communis var. nana) i mai rar exemplare de zmbru (Pinus cembra) ca diseminaii dar care au atins vrste apreciabile (peste 300 ani) i nlimi de peste 30 m (Enescu et al.,1997). Tufriuri mai mult sau mai puin compacte de jnepeni i ienuperi au rol extrem de important n meninerea unui echilibru natural relativ stabil n zon, prin limitarea unor eroziuni excesive ale solului i de atenuare a daunelor provocate de numeroasele avalane produse n zon.

Figura 25. Configuraia actual a Parcului Naional Munii Rodnei (dup MMGA,2003) C. Parcul Naional Climani. Masivul Climani, cel mai extins masiv vulcanic din Romnia, se situeaz n partea nord vestic a grupei centrale a Carpailor Orientali i este 69

foarte bine conturat ca individualitate geologic prin frecvena deosebit de mare a rocilor eruptive i prezena craterelor vechilor vulcani. Parcul Naional Climani, cu cele peste 24.000 ha, ocup aproape ntreaga suprafa a masivului muntos Climani, acest masiv conferindu-i i forma actual. (fig. 26). Din punct de vedere teritorial administrativ, aceast arie protejat se situeaz pe teritoriul a 4 judee, respectiv Suceava, Harghita, Mure i Bistria-Nsud. n cadrul zonei, cele mai reprezentative i mai importante tipuri de pdure (arborete naturale) sunt cele de amestec de rinoase cu fag (cu flor de mull) i de molidiuri (cu Vaccinium myrtilis i Oxalis acetosella).

Figura 26. Configuraia actual a Parcului Naional Climani (dup MMGA,2003) O not aparte i foarte caracteristic n aceast arie protejat o reprezint vegetaia lemnoas de limit de altitudine, la peste 1700 m, constituit din arborete naturale de zmbru (Pinus cembra) sau din amestecuri de molid, jneapn i zmbru . Unele dintre aceste suprafee conin ecosisteme forestiere ameninate sau periclitate, cum ar fi complexe de rariti cu zmbru sau tufriuri subalpine de jneapn i tufriuri de smrdar (Rhododendron kotschyi)(Cenu, 2005).

70

D. Parcul Naional Ceahlul reprezint una dintre cele mai importante ariile protejate ale zonei central-nordice din Carpaii Orientali datorit bogiei faunei dar mai ales a vegetaiei ierboase i lemnoase. Frumuseea inegalabil a peisajelor din zona nalt a masivului confer o not cu totul aparte acestei zone de o inegalabil frumusee i neasemuit pitoresc. Situat n parte vestic a judeului Neam, la poalele staiunii Duru la nord, lacul de acumulare Izvorul Muntelui la est i localitatea cu acelai nume la sud, avnd zona central stabilit ca Parc Naional, masivul Ceahlu este format din roci sedimentare, cu gresii i blocuri de calcar n sistem de conglomerate i intercalaii (MAPAM, 2003)(fig. 30). n cadrul ecosistemelor forestiere, predomin tipurile molideto-brdet normal cu flor de mull, molideto-laricet cu Oxalis acetosella, molideto-fget cu flor de mull, brdeto-fget cu flor de mull i amestec normal de rinoase cu fag. n ceea ce privete compoziia pe specii lemnoase, molidul deine 45%, fagul 28%, bradul 24%, restul de 3% fiind reprezentat de unele specii de amestec.

Figura 30. Configuraia actual a Parcului Naional Ceahlu (dup MMGA,2003) Un loc cu totul aparte n cadrul vegetaiei lemnoase din Parcul Naional Ceahlu l reprezint arboretele naturale de larice Larix decidua var. carpathica, acestea ocupnd brnele (polie) calcaroase nsorite de pe versantul sudic al masivului, la circa 1400 m altitudine. Exemplarele de zad din aceste arborete unicat ating dimensiuni impresionante (peste 30 m nlime i aproape 1 m n diametru), iar formaiunea (cca. 370 h) s-a constituit n renumitul monument al naturii Polia cu crini, denumirea provenind de la numele local al laricelui. 6.3.1.2. Rezervaiile de semine Interesul constant manifestat de ctre specialitii din silvicultur n obinerea unor cantiti nsemnate de semine ameliorate (capacitate de germinaie de peste 60%), necesit 71

luarea unor msuri de protejare i conservare a arborilor remarcabili, dincolo de vrsta de exploatabilitate economic, pn la vrsta de exploatabilitate fiziologic, stadiu apropiat de deperisarea fizic a arborilor. Conservarea acestor arbori deosebit de valoroi se face n cadrul rezervaiilor de semine populaii superioare a cror conservare n generaia urmtoare se poate face prin regenerare natural sau chiar prin crearea de plantaii conservatoare in situ. Rezervaiile de semine sunt arborete pure sau de amestec, preponderent naturale i care, n cadrul aceleai regiuni de provenien, se deosebesc distinct de celelalte arborete cu aceeai compoziie specific (Enescu et al, 1997). Lucrrile de baz desfurate n aceste populaii sunt cele de igienizare i de curire, lucrri specifice seleciei negative al criteriului valorii relative a arborilor, prin care sunt eliminai arborii mai slab dotai, cei mai buni fiind pstrai i ngrijii pentru a produce cantiti ct mari de semine de calitate superioar. Selecia i delimitarea principalelor arborete ca rezervaii de semine la noi n ar s-a efectuat pe baza unui sistem original de cartare seminologic de ctre specialiti din cadrul ICAS, n perioada 1965-1996. Desfurarea acestei aciuni de mare importan i de o anvergur fr precedent n ara noastr s-a bazat pe respectarea ctorva principii clare, spre exemplu cel privind evitarea de la reproducere a arboretelor slabe ca productivitate i cu semine de calitate inferioar, acordarea unei prioriti absolute provenienelor locale n iniierea de experimente cu limitarea drastic a transferrilor de material biologic de reproducere i, nu n ultimul rnd, prezervarea arboretelor deosebit de valoroase pn la limita longevitii fiziologice. n urma efecturii acestei aciuni, la noi n ar au fost delimitate peste 2300 rezervaii de semine care acoper peste 70.000 ha (peste 32.000 ha rinoase i peste 37.000 ha foioase) i care includ toate speciile principale forestiere (tabel 4). Tabelul 4 Rezervaiile de semine nscrise n catalogul naional din 1986
Nr crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Specia Molid Brad Larice Pin silvestru Pin negru austriac Pin negru de Banat Pin strob Zmbru Duglas verde Duglas brumriu Chiparos de balt Tuia occidental Fag Gorun Cer Grni Stejar brumriu Stejar pufos Stejar rou american Suprafa efectiv (ha) 13.849,1 8.268,6 507,3 2643,4 668,8 4,3 24,1 3,1 38,5 3,2 5,8 0,6 7980,9 13.875,4 4253,2 711,8 1395,2 673,6 19,8 25,0 Suprafa total (ha) 16.887,9 10.830,1 966,4 3403,2 663,2 21,7 26,2 3,9 64,5 4,5 9,4 0,6 8121,2 17409,4 5194,5 880,9 1851,9 870,4 23,7 44,8 Observaii

artificial i natural artificial i natural artificial natural artificial natural artificial artificial artificial artificial natural natural natural natural natural natural artificial artificial

72

21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29.

Stejar de balt Tei pucios Tei cu frunz mare Tei argintiu Frasin Anin negru Castan comestibil Plop alb Salcm

27,6 383,2 148,8 708,7 820,4 74,9 155,8 21,8 594,4

54,5 396,1 171,4 841,1 887,1 78,3 197,2 32,0 598,0

natural natural natural natural natural natural natural artificial artificial

dup Enescu, 1986 i adptat Toate aceste arborete constituie cele mai valoroase fonduri de germoplasm forestier de la noi din ar, cu baz ereditar intact i caracter permanent, cu cel mai mare numr de arbori plus i care sunt excluse de la tieri. ndeprtarea exemplarelor de slab calitate, prin efectuarea de rriri adecvate, conduce la realizarea unei consistene optime a rezervaiei (obinuit 0,7-0.6), consisten care se atinge treptat prin mai multe cicluri de selecie. Aceste populaii de arbori reprezint baza populaiilor de ameliorare, ca arbori seminceri alegndu-se exemplarele din categoria arborilor plus, exemplare situate ntotdeauna n plafonul dominant i considerate drept adevrate centre de gene ale speciilor lemnoase (Stnescu, 1984). 6.3.1.3. Interzicerea accesului i a exploatrii prefereniale a arborilor valoroi Aceste msuri constituie msuri clasice ce trebuie luate urgent i aplicate imediat, pot avea caracter temporar sau permanent i se aplic n vederea opririi pierderilor genetice, precum i a evitrii perturbrii unor lucrri extrem de importante cum ar fi, de exemplu, rriturile sau tierile de regenerare (Lucu, 1998). Eficacitatea seleciei este mult mrit prin aplicarea acestor msuri i, drept urmare, are loc o reinstalare progresiv a unui patrimoniu genetic valoros, perturbat iniial prin extrageri masive, necontrolate, de arbori valoroi. Tot pe aceast linie, este recomandabil a se cunoate, pe ct posibil, limitele eritabilitii celor mai importante caractere (calitative i cantitative) i expresia ctigului genetic pe fondul lucrrilor legate de ciclurile de selecie Mai este de reinut i faptul c, spre deosebire de msurile menionate anterior, aceast metod este mult mai uor de aplicat, are un caracter imediat, este mult mai puin costisitoare i contribuie din plin la salvarea integral a fondului de germoplasm deinut de rezervaia respectiv. 6.3.2 Conservarea ex situ a resurselor genetice forestiere n cadrul acestui concept sunt reunite modalitile de conservare a fondurilor valoroase de germoplasm forestier n afara locului de unde provin, respectiv n afara arealului lor natural. Prin aplicarea acestei metode, de multe ori se ncearc i se reuete reproducerea la o scar redus a unor populaii originale ce conin o larg variabilitate genetic intraspecific datorat unei ample panmixii. n cadrul acestor plantaii grupate, producerea controlat de smn este relativ uor de realizat, aceasta facilitnd producerea de puiei n mas. Aceast modalitate s-a dovedit extrem de util la unele plantaii de molid n afara arealului natural, exemplarele din aceste culturi dovedindu-i din plin valoarea genetic i adaptativ. Tot n categoria de resurse genetice forestiere valoroase conservate ex situ se includ i unele culturi comparative de proveniene, hibrizi sau clone cu cert semnificaie biologic, tiinific i practic.

73

Spre deosebire de conservarea resurselor genetice forestiere in situ, conservarea ex situ preconizeaz abordarea mult mai multor modaliti privind prezervarea celor mai valoroase fonduri de germoplasm forestier, pornind de la crearea de arboretum-uri, parcuri dendrologice, colecii de clone sau grdini botanice i terminnd cu bncile de gene ce includ colecii de semine, polen, culturi in vitro i chiar secvene ADN. Majoritatea acestor activiti constituie, n fapt, obiectul a numeroase i complexe programe de ameliorare genetic forestier, iar faptul c unele se bazeaz pe durata lung a vieii arborilor (arboretum-urile sau parcuri dendrologice), aceasta nu face dect s permit i o conservare eficient a resurselor existente, unele provenind de la populaii naturale (aa numitele populaii de plecare) cu o foarte larg baz genetic. 6.3.2.1. Arboretum-urile i parcurile dendrologice Acestea reprezint plantaii grupate care cuprind anumite specii, iar fiecare specie este reprezentat de un numr limitat de indivizi. De regul, provin dintr-o singur surs geografic i constituie mijlocul de baz prin care se face selecia unor specii privind capacitatea acestora de a se adapta i de a crete n condiii noi. Este foarte important ca fiecare specie s aib la baz din cel puin dou proveniene, cu origine cunoscut i structur ereditar aproape intact, iar instalarea unei reele de subarboretum-uri mai mici, perfect adaptate ecologic n niele respective, ar fi mult mai util ca n cazul crerii de plantaii mari (Bauvarel citat de Enescu, 1997). Aceste subansambluri forestiere, n care o gen rar i valoroas poate avea o frecven mai mare dect la specie pe ansamblu, constituie, de fapt, puncte de plecare ale celei mai eficiente metode de selecie n cadrul ameliorrii arborilor, respectiv varianta seleciei reciproce recurente. Aceasta face posibil valorificarea efectelor combinaiilor de gene legate de manifestarea diferitelor caractere (creterea ctigului genetic), precum i gruparea acestor combinaii de gene i asociaii de caractere ntr-un genotip (individ) selecionat. Pe de alt parte, longevitatea vieii exemplarelor din aceste plantaii permite i o conservare genetic eficient a zestrei genetice dobndite i totul ia alura unui proces dinamic, specific ameliorrii pe termen lung, dar care, din pcate, necesit i costuri ridicate. Cu toate acestea, arboretum-urile i parcurile dendrologice constituie o form extrem de eficient i util n cadrul activitii de conservare ex situ a fondurilor valoroase de germoplasm forestier, iar interesul tiinific, didactic, cultural i chiar estetic din partea specialitilor i a publicului larg, n aceast privin, se manifest tot mai intens. 6.3.2.2. Culturile comparative de proveniene i hibrizi Aceste culturi au un caracter deosebit i o semnificaie biologic i tiinific multilateral i se nfiineaz n scopul estimrii influenei geografice asupra capacitii de cretere, asupra calitii lemnului i asupra rezistenei la aciunea nociv a factorilor biotici i abiotici. Pe de alt parte, aceste plantaii permit testarea diferitelor combinaii hibride intra i interspecifice, comparativ cu genitorii. Pornind de la aceste considerente, ct i pentru faptul c sunt nfiinate pentru un timp relativ ndelungat, aceste culturi permit conservarea unui material genetic foarte diversificat, crend totodat condiii de conservare i a unor proveniene rare, pe cale de dispariie sau chiar unicat. 6.3.2.3. Parcurile de clone Parcurile de clone sunt cultivare ce conin genotipuri valoroase provenite din material vegetativ, cel mai adesea butai (plop, salcie) sau prin altoire (rinoase i foioase). n cadrul acestor colecii s-au creat numeroase varieti multiclonale, de mare productivitate i cu o mare vitez de cretere.

74

Capacitatea celulei vegetale de a reconstitui o nou plant, copie fidel din punct de vedere genetic cu planta mam (totipotena celulei vegetale) a fcut posibil includerea n cadrul acestor colecii i a exemplarelor multiplicate in vitro, prin micropropagare intensiv (cire slbatic). Sursa principal de material biologic vegetativ o constituie arborii plus, exemplare din etajul dominant care se deosebesc de vecinii lor prin creteri excepionale, vigoare deosebit i, nu n ultimul rnd, prin fructificaie abundent i semine cu capacitate de germinaie superioar. n ceea ce privete conservarea genetic, plantajele de clone dein un fond valoros de germoplasm prin exemplarele care le alctuiesc i care sunt copii vegetative, sistemul clonal pstrnd intact zestrea ereditar iniial a populaiei de origine. 6.3.2.4. Livezile de semine Livezile de semine (plantaii de semine sau plantaje) sunt plantaii speciale de arbori (clone sau descendene selecionate), ct mai bine izolate pentru reducerea la minimum a polenizrilor exogene nedorite, create n scopul producerii frecvente a unor cantiti mari de semine de calitate superioar i uor de recoltat la vrste ct mai mici. Exemplarele din aceste culturi sunt de provenien cunoscut, fiind identificai prin descendena lor sau prin clona de care aparin. Chiar dac aceti arbori nu ating vrstele exemplarelor din cadrul arboretum-urilor sau parcurilor dendrologice, aceste formaiuni forestiere pot ndeplini i funcia de conservare a unor fonduri valoroase de germoplasm prin pstrarea unor genotipuri i clone performante i bine adaptate. 6.3.2.5. Bncile de gene n ultimii 25-30 ani, activitatea de identificare, colectare i conservare a resurselor genetice vegetale, inclusiv a celor forestiere, a cunoscut o tot mai accentuat preocupare. Din ce n ce mai multe state, organisme guvernamentale i nonguvernamentale, instituii i personaliti tiinifice de prestigiu, etc., se implic tot mai activ n aceast activitate pentru a se evita sau limita pierderile irecuperabile de material genetic extrem de valoros, pierderi catalogate de ctre biologul J.R. Harlan ca genetica dezastrului. Crearea unei reele de bnci de gene la nivel mondial, sub coordonarea Institutului Internaional de Resurse Genetice Vegetale (I.P.G.R.I.) i a Comisiei de Resurse Genetice F.A.O., constituie un uria succes n ceea ce privete asigurarea unei protecii sigure a surselor de germoplasm mpotriva eroziunii genetice. Aceste instituii, dotate cu echipament modern de conservare i baz complet de date, au fost nfiinate n scopul prospectrii, colectrii, evalurii i conservrii celor mai valoroase dar i a celor mai ameninate categorii de resurse genetice vegetale. Inaugurarea Bncii de Resurse Genetice Vegetale din Suceava, n anul 1991, se nscrie perfect pe coordonatele imperativului major de salvare i ocrotire a ceea ce a mai rmas valoros din fondul existent de germoplasm vegetal de la noi din ar, prioritate de top avnd formele rare sau ameninate cu dispariia (fig. 15). Metoda cea mai utilizat de conservare a germoplasmei vegetale ntr-o banc de gene este cea de prezervare a materialului biologic sub form de eantioane, mostre de material viu, respectiv probe de semine cu coninut redus de umiditate (max.6%), stocate la temperaturi sczute (+4, -20oC).

75

Conservarea prin culturi de esuturi n pofida faptului c nc necesit costuri destul de ridicate, conservarea germoplasmei forestiere, prin culturi in vitro, este o modalitate modern de conservare, aflat n plin expansiune datorit aplicabilitii acesteia la un numr tot mai mare de specii i forme de arbori i arbuti cum ar fi unele varieti hibride performante dar care se reproduc foarte greu n condiii normale, cele cu nmulire exclusiv vegetativ sau la specii cu semine recalcitrante (tropicale i temperate). La cireul slbatic, spre exemplu, datorit aptitudinii sale deosebite de regenerare i micropropagare (minibutire in vitro), s-au elaborat i sunt n derulare, n Frana, programe interesante de silvicultur clonal (Lucu, 1998). Trebuie remarcat, n primul rnd, eficiena deosebit a acestei metode, concretizat prin faptul c dintr-un singur meristem apical caulinar (material biologic iniial) se pot obine, n mai puin de 1 an, cteva milioane de copii identice din punct de vedere genetic cu planta mam donatoare. Pe de alt parte, n lucru este introdus un esut aproape perfect sntos (liber de virui), acest fapt oferind certe garanii asupra calitii materialului biologic utilizat i multiplicat prin micropropagare. n prezent, bncile de gene moderne, pe lng semine sau fragmente de plante, conin i colecii de inoculi cultivai in vitro. Principiul de baz n crearea i meninerea unei colecii in vitro active este acela c tot materialul biologic (plantule) rezult dintr-un proces ciclic, ce are la baz multiplicarea culturilor, iar meninerea ntregii colecii se face prin operarea de subculturi. Procesele vitale, n acest caz, sunt mult diminuate prin asigurarea unor condiii de cretere lent (temperaturi pozitive sczute, iluminat cu intensitate redus, reducerea la jumtate a concentraiei componentei minerale n mediul de conservare i adaos de inhibitori osmotici i de cretere). Tot materialul obinut i conservat este testat i controlat periodic. Conservarea in vitro, prin meninerea plantulelor n condiii de cretere lent i operarea de subculturi la intervale ct mai lungi de timp, constituie o tehnic aplicat pe scar larg i la unele specii de arbori i arbuti. Stocarea surselor valoroase de germoplasm prin imersarea materialului biologic (semine, vrfuri de cretere) n azot lichid, la 196oC, are ca rezultat stoparea complet a creterii culturilor i conservarea acestora pe perioade lungi i foarte lungi de timp (zeci i peste 100 ani) sau chiar pe termen nelimitat. Conservarea germoplasmei forestiere prin obinerea de embrioni somatici (proces analog embriogenezei zigotice) are la baz procesul de inducere i difereniere a unei singure celule sau a unui grup restrns de celule vegetative (axe hipocotile, cotiledoane, pri ale inflorescenei, esuturi tinere din punctele de cretere) i formarea aa numitelor semine artificiale. Astzi este cunoscut faptul c regenerarea prin embriogenez somatic s-a putut realiza la peste 50 de specii lemnoase, din care 20 angiosperme (ex. la stejar) i cel puin 30 de gimnosperme (specii ale genurilor Picea, Abies, Pinus, Larix, Pseudotsuga i Sequoia). Succesul acestei iniiative n silvicultur, n ciuda costurilor ridicate, este garantat n cazul utilizrii acestor metode la unele varieti hibride cu genotip greu de reprodus prin metode clasice, deosebit de performante i foarte greu de obinut pe cale natural. Aceste genotipuri, de multe ori, se dovedesc extrem de rezistente la factorii nocivi biotici i abiotici sau prezint o toleran crescut la produii chimici acumulai n sol. Pe de alt parte, la anumite conifere (pin, molid, larice) embriogeneza somatic constituie mijlocul de baz de rspndire n mas a materialului performant rezultat din diferite programe de ameliorare genetic forestier. 76

Conservarea polenului pe o durat limitat de timp (cteva sptmni) nu implic luarea unor msuri speciale de pstrare, ci important este ca s se asigure pstrarea integritii structurii membranare, formaiuni care adpostesc majoritatea sistemelor enzimatice cu rol important n declanarea i evoluia ulterioar a procesului germinativ. Pstrarea fondurilor de germoplasm vegetal (inclusiv cea forestier) prin stocarea ADN sau a secvenelor de ADN (gene responsabile ale manifestrii unor caractere extrem de utile n procesul de ameliorare), constituie modalitatea cea mai modern i, totodat, cea mai performant n cadrul activitii de conservare a resurselor genetice vegetale. Progresul rapid i spectaculos nregistrat n ultimii ani, pe linia perfecionrii i utilizrii unor tehnici tot mai performante i sofisticate ale biotehnologiei vegetale, este o realitate evident n prezent, dar cu un imens potenial pentru viitor. Tehnicile de secvenionalizare a ADN (principalul deintor al informaiei genetice), bazate pe funcionarea unor analizoare de mare finee i extrem de performante precum marquerii genetici ADN (amprente genetice) utilizai n cuantificarea variabilitii intra i interpopulaionale pentru conservare, reprezint unele dintre cele mai importante tehnologii specifice celor mai moderne bnci de gene. Caracterizarea la nivel subcelular (molecular) reprezint o alternativ ultramodern la evaluarea morfologic i a caracterelor cantitative, suscitnd un interes deosebit al specialitilor prin faptul c aceti indici, pe lng relevana i precizia privind exprimarea i interpretarea rezultatelor investigrii, sunt foarte puin influenai de factorii de mediu sau de stadiul de dezvoltare al indivizilor. Strauss, Bousquet et all. (1992) au stabilit 2 categorii importante de marcheri moleculari: marcheri biochimici, reprezentai de produii direci ai activitii genelor cum sunt izoenzimele, terpenele .a. i marcheri genetici moleculari ca derivai proprii din analiza secvenelor polimorfice de ADN. Marcherii biochimici Izoenzimele, definind la modul general, reprezint acele enzime care difer ca structur dar catalizeaz aceeai reacie metabolic. Aceste deosebiri de structur n cazul izoenzimelor sunt rezultatul unui polimorfism alelic. Existena a cel puin dou alele la nivelul locusului specific unei aloenzime, situaie ntlnit la indivizii heterozigoi, creeaz premizele apariiei mai multor tipuri de lanuri polipeptidice, identice ns din punct de vedere funcional. n acest caz, aloenzimele reprezint marcheri codominani. Tehnica electroforetic n cercetarea forestier a nceput s fie aplicat, pe scar larg, la sfritul anilor 70, n Germania (Gtingen), Suedia i Statele Unite ale Americii. Apariia mutaiilor la nivelul cromozomilor complic situaia n sensul c, n cadrul sistemelor enzimatice, apar benzi duble, triple i n cazul homozigoilor, rezultnd aa numitele enzime hibride interloci. Prin aceast tehnic nu se pot evidenia genele nule sau cele silenioase din genomul multor specii forestiere, fapt ce denatureaz calculul statistic privind frecvena genic i proporia exact a heterozigoilor ntr-o populaie de arbori. Cu toate acestea, metoda electroforetic privind studiul izoenzimelor prezint o deosebit importan pentru genetica populaional, pentru analiza structurii genotipice dar i pentru evaluarea gradului de heterozigoie existent intr-o populaie natural de arbori. De asemenea, se poate face o estimare a ratei autofecundrii i, implicit, a fluxului de gene n cadrul unei populaii forestiere artificiale. Terpenele. Studii privind compoziia rinii la conifere n monoterpene ( i -pinenul, mircenul, -felandrenul,etc.), produi cu determinism monogenic i caracter dominant, s-au 77

efectuat n special pe specii ale genului Pinus, n Frana i n Statele Unite ale Americii. Pe baza studiilor privind concentraia de monoterpene n scoara de Pinus elliotti, s-a putut face o difereniere a provenienelor pe axa nord-sud (clinal) i s-a elucidat modalitatea de rspndire postglaciar a speciei Pinus caribaea var. bahamensis n Florida i introgresiunea genetic parial cu Pinus elliotti. Efectuarea unor astfel de analize pe diferite ecotipuri naturale de Pinus pinaster a fcut posibil reconstituirea principalelor ci de recolonizare postglaciar a acestei specii n sudestul Europei. Tot pe baza studiului monoterpenelor, s-a putut estima gradul de contaminare alopolenic n unele livezi de semine i, de aici, posibilitatea evalurii consecinelor acestui fenomen asupra ctigului genetic. Marcheri genetici moleculari Dup 1990, la concuren cu analizele electroforetice ale marcherilor biochimici, s-au dezvoltat impetuos tehnicile de utilizare a marcherilor genetici moleculari ce ptrund n intimitatea structurii macromoleculei de ADN, secvenele fiind legate de un locus anume al materialului genetic (locus marcher). Reacia de polimerizare n lan (PCR - Polymerase Chain Reaction) reprezint tehnica de multiplicare enzimatic in vitro a unei secvene din macromolecula de ADN alctuit din cteva perechi de nucleotide (oligonucleotide specifice primeri cu max. 20 de perechi de baze azotate). Enzima specific acestei reacii este ADN-polimeraza, enzim termostabil (+95oC) i denumit Taq polimeraz. Reacia implic parcurgerea ctorva etape importante: denaturarea ADN-ului, fixarea iniiatorului (de la nivelul enzimei) i elongaia catenelor. Cele 2 fragmente sunt apoi replicate de foarte multe ori (milioane de copii), pe parcursul mai multor cicluri, fiecare de cte 20-50 de ori. De fiecare dat se dubleaz numrul copiilor de fragmente, analiza acestora urmnd s fie fcut electroforetic. Aceast metod (reacie) st la baza tuturor celorlalte tehnici mai performante privind marcherii genetici moleculari. Polimorfismul lungimii lanurilor de restricie (RFLPs Restriction Fragment Length Polymorphism) este o tehnic extrem de performant i de vrf n genetica molecular, bazat pe hidroliza (digestia) ADN cu ajutorul unei enzime specifice acestei reacii (endonucleaz de restricie). Polimorfismul este relevat dup o hibridare a fragmentului de ADN, deja separat electroforetic, cu o sond marcat cu izotopi radioactivi i transferarea ulterioar pe membran (tehnica Southern). Endonucleaza de restricie taie fragmentul din macromolecula ADN pn la o secven de baz de recunoatere (4-8 perechi de baze azotate). Sunt deja identificate cteva sute de endonucleaze, fiecare cu specificitate proprie legat de recunoaterea secvenei de baz. Numrul i lungimea fragmentelor rezultate depind de numrul i distribuia siturilor de recunoatere. Comparativ cu izoenzimele, marcherii RFLP sunt cu mult mai numeroi i, prin aceasta, metoda deschide o arie de investigaie mult mai larg n ceea ce privete analiza variabilitii genetice n cadrul populaiilor naturale, chiar dac aceast tehnic este mai laborioas i mai costisitoare. Amplificarea nedirijat de ADN polimorfic (RAPD Random Amplified Polymorphic DNA) este o tehnic ce implic utilizarea unui iniiator (primer oligonucleotid scurt ce include maximum 10 perechi de baze) ce poate ncepe amplificarea ca i n cazul tehnicii PCR. Amplificarea fragmentelor se face la ntmplare n cadrul unui genom, n urma 78

procesului rezultnd cel puin 10 astfel de fragmente de iniiere (aa-numitele amprente), dup care are loc separarea electroforetic pe gel de agaroz sau poliacrilamid. n final, secvenele rezultate n urma amplificrii sunt colorate cu bromur de etidium i pot fi analizate n cmp de radiaii UV. Pe baza acestei tehnici se poate estima gradul de polimorfism existent ntr-o populaie, analiza populaiei i chiar identificarea indivizilor. Ca i n cazul RFLP, marcherii RAPD sunt marcheri dominani i, n principiu, pot rezulta n numr nelimitat. n acest caz, ns, avantajul const n faptul c nu se utilizeaz izotopi radioactivi i nu sunt necesari iniiatori (primeri) pentru fiecare specie. Din aceste motive, metoda utilizrii marcherilor RADP este mai simpl, mai rapid i mai puin costisitoare ca cea a marcherilor RFLP. Ca dezavantaj menionm c aceast tehnic permite numai detectarea genelor dominante, nepermind determinarea structurii genotipice a unei populaii, pe ansamblu (AA, Aa, aa), mai ales n ceea ce privete proporia heterozigoilor. Microsateliii sunt secvene ale macromoleculei de ADN rezultai n urma repetiiei n tandem a unei secvene simple din ntregul genom. Sunt formai doar din dou nucleotide, sunt foarte comuni i, totodat, polimorfici. Segmentul care ncorporeaz microsatelitul poate fi replicat, iar lungimea acestuia se va determina electroforetic. Microsateliii sunt microformaiuni de natur multialelic i codominant, sunt foarte numeroi i bine repartizai n genom i au un nalt grad de polimorfism. Analiza lor poate fi uor automatizabil, nefiind necesar o mare cantitate de material i nici prezena de izotopi radioactivi. Ca dezavantaj ar fi doar faptul c la separarea electroforetic este necesar utilizarea unui gel cu un grad mare de rezoluie (din cauza separrii unor fragmente foarte mici), ceea ce implic o mai mare atenie n pregtirea substratului i un cost mai ridicat al operaiunii. Trebuie remarcat faptul c, prin analiza microsateliilor, s-au putut descifra genomurile i stabili majoritatea hrilor genetice, aceste microformaiuni constituind marcherii predileci ai geneticii animale i umane. De asemenea, pe baza analizelor microsateliilor, s-a putut efectua studiul complet al introgresiunii genetice ntre 2 specii forestiere foarte importante, respectiv stejarul i gorunul. Principalele domenii de utilizare a marcherilor moleculari n ameliorare i conservare genetic sunt: a) Cuantificarea diversitii genetice Utilizarea marcherilor biochimici i moleculari (izoenzime, produi de metabolism sau marcheri ADN) pentru determinarea gradului de variabilitate genetic n interiorul unei populaii sau ntre populaiile de arbori constituie astzi, n multe ri, o prioritate n activitile complexe de evaluare i conservare a resurselor genetice forestiere. De menionat, totui, c rezultatele acestor studii bazate pe utilizarea de marcheri genetici moleculari trebuie luate n calcul i interpretate cu pruden deoarece, nu de puine ori, s-a constatat un nivel sczut privind corelaia cu variabilitatea unor caractere legate de adaptabilitate, trsturi foarte importante n practica forestier. b) Verificarea genotipurilor Marcherii moleculari sunt foarte mult utilizai n identificarea genotipurilor, n diferite studii taxonomice i biologice (care includ i tehnica amprentelor genetice). Este cert faptul c derularea cu succes a diferitelor programe de ameliorare i conservare forestier presupune existena unei taxonomii clare. De asemenea, prin utilizarea marcherilor biochimici (studiul terpenelor), s-au nregistrat progrese remarcabile n ceea ce privete studiul de dispersie a 79

seminelor sau de mprtiere a polenului, aceasta pentru dezvoltarea i perfecionarea metodelor de polenizare dirijat (controlat). Rezultatele diferitelor studii ce utilizeaz marcheri moleculari au o deosebit nsemntate practic n ceea ce privete reuita unor programe de ameliorare, cu precdere n practica amenajrii i gestionrii diferitelor populaii de arbori sau livezi de semine (constituite din clone sau rsaduri provenite de la arbori valoroi selecionai), cultivate pentru producii rapide i abundente de semine de calitate superioar pentru rempduriri. c) Hri genetice i selecia asistat de marcheri moleculari Hrile genetice de linkage se pot folosi pentru a localiza gene rspunztoare de manifestarea unor caractere cantitative (QTL) cu un deosebit impact economic, precum producia de mas lemnoas sau cantitatea de past. Detectarea QTL din genomul diferitelor specii forestiere presupune constituirea unor hri genetice bazate pe consegregarea marcherilor (zone identificate prin marcare molecular ADN) n ncruciri controlate (n generaia a doua prin retroncruciare). Studiul de perspectiv al seleciei asistate de marcheri moleculari la speciile forestiere presupune, n principal, construirea unei reele de marcheri polimorfici, repartizai relativ uniform n cromozomi, care s se constituie n hri genetice.

80