109 009261K SP

EDVOTEK P.O.
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The Biotechnology Education Company
Anlisis de la Huella Gentica del ADN
EDVO-Kit #
109
Identificacin del ADN basada en Patrones de Fragmentacin con Enzimas de Restriccin

Almacenar el experimento completo en la heladera
Objetivo del Experimento

Crear un conocimiento bsico acerca del mtodo de la huella gentica del ADN al analizar las variaciones en las patrones de fragmentacin con enzimas de restriccin en diferentes molculas de ADN e identificar la procedencia de una muestra desconocida de ADN usando la lgica del anlisis de la huella gentica del ADN.
1-800-EDVOTEK (301) 251-5990 24-hour FAX: (301) 340-0582 http://www.edvotek.com email: edvotek@aol.com
Todos los componentes de este kit deben utilizarse con fines didcticos unicamente. No deben ser usados con fines diagnsticos o como droga, ni deben ser administrados a humanos o animales.
EVT 009261K
EDVO-Kit # 109: Anlisis de la Huella Gentica del ADN
EDVOTEK The Biotechnology Education Company
Indice
Pgina Componentes del Experimento Materiales Necesarios para el Experimento Informacin Bsica Preparacin del Gel de Agarosa Prctica del Depsito de las Muestras en el Gel Ejecucin de la Electroforesis en Gel de Agarosa Tincin y Visualizacin del ADN Preguntas de Estudio Gua para el Instructor Informacin general Preparacin de grandes volumenes de gel Preparacin de Reactivos Ayuda para la electroforesis Esquema Ideal de los Resultados Respuestas a las Preguntas de Estudio 2 3 4 9 13 14 16 19
21 22 23 25 27 28
Componentes del Experimento

Contenidos
Almacenamiento: Almacenar el experimento completo en la heladera
A Muestra de ADN de la escena del crimen cortada con enzima 1 B Muestra de ADN de la escena del crimen cortada con enzima 2 C Muestra de ADN del sospechoso #1 cortada con enzima 1 D Muestra de ADN del sospechoso #1 cortada con enzima 2 E Muestra de ADN del sospechoso #2 cortada con enzima 1 F Muestra de ADN del sospechoso #2 cortada con enzima 2 Solucin de Prctica para carga de las muestras en el gel Agarosa en polvo UltraSpec-Agarose Solucin tampn o buffer para electroforesis de concentracin 50x Tintura Azul de Metileno InstaStain Methylene Blue Tintura Azul de Metileno concentrado Methylene Blue Plus Pipetas de 1 ml. Cilindro graduado de 100 ml (empaque para las muestras) Pipetas de transferencia con puntas finas
La duplicacin de este documento, as como el uso de los reactivos que lo acompaan, est permitido en laboratorios de aprendizaje solamente. Este documento, o cualquier parte del mismo, no puede ser reproducido ni distribuido para ningn otro propsito sin el consentimiento escrito de EDVOTEK, Inc. Derechos de copia (Copyright) 2001, EDVOTEK, Inc., todos los derechos reservados. EVT 009261K

Componentes del Experimento Los componentes del experimento contienen suficiente muestra para correr seis geles si se usan micropipetas automticas para depositar la muestra en el gel. El uso de pipetas de transferencia dar un menor rendimiento con respecto al nmero de geles obtenidos. Las cantidades de reactivos para seis geles estn calculadas en base al uso del aparato para electroforesis horizontal Modelo # M12.
Antes de utilizar el kit, verificar los volumenes de las muestras A-F. La evaporacin puede haber causado que las muestras estn ms concentradas. Usted necesitar un mnimo de 250 microlitros. Si es necesario, colocar los tubos en una centrfuga, luego agregar agua destilada hasta el el nivel marcado como 1.5 ml y mezclar. 250 l
UltraSpec-Agarose and Methylene Blue Plus son marcas registradas de EDVOTEK, Inc.
Materiales Necesarios para el Experimento

Aparato para electroforesis horizontal Fuente de corriente continua Micropipetas automticas con las puntas recomendadas Bao de agua a 65C Bandeja para tincin y red Microondas, plancha caliente o mechero Ayuda para pipetas Vasos de precipitado o erlenmeyers de 250 ml Guantes aislantes y guantes de seguridad Sistema para visualizacin del ADN (luz blanca) Agua destilada o desionizada.
1.5 cm
4.7 cm
Informacin Bsica
El Mtodo de Tipificacin del ADN (tambin llamado anlisis del perfil gentico o huella gentica del ADN) es un mtodo desarrollado recientemente que permite la identificacin positiva del origen de muestras desconocidas de ADN. El mtodo se ha convertido en un factor muy importante en laboratorios bioqumicos forenses donde ha sido usado para proveer evidencia en casos criminales y de paternidad. En contraste con metodologas ms convencionales, tales como tipo sanguneo, las cuales slo pueden excluir a un sospechoso, el mtodo de la huella gentica del ADN puede proporcionar identificacin positiva con gran precisin. La identificacin gentica de invididuos por ADN incluye el anlisis electrofortico de fragmentos de ADN de diferentes tamaos generados por enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin utilizadas son endonucleosas que catalizan la ruptura de los enlaces fosfodiester en ambas cadenas de ADN. Los puntos de ruptura ocurren dentro o cerca de secuencias de bases muy especficas llamadas sitios de reconocimiento, que generalmente tienen de 4 a 8 pares de bases de longitud. Las dos enzimas de restriccin usadas ms comunmente para el anlisis de la huella gentica del ADN son Hae II y HinfI, enzimas de restriccin que reconocen secuencias de 4 y 5 bases respectivamente. Los siguientes ejemplos muestran los sitios de reconocimiento de varias enzimas de restriccin. Bam HI 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 5'-CTGCAG-3' 3'-GACGTC-5' Hae III 5'-GGCC-3' 3'-CCGG-5' 5'-GANTC-3' 3'-CTNAG-5'
Pst I
Hinf I
El tamao de los fragmentos de ADN generados depende de la distancia entre los sitios de reconocimiento. Por lo general, cuanto ms larga la molcula de ADN, mayor ser la probabilidad de que exista algn sitio de reconocimiento. El ADN de un cromosoma humano promedio es muy largo, contiene ms de l00 millones de pares de bases. Una enzima de restriccin que reconoce secuencias de 6 pares de bases, Eco RI por ejemplo, cortar el ADN humano en aproximadamente 750,000 fragmentos diferentes.

Informacin Bsica Dos individuos no tienen exactamente el mismo patrn de sitios de reconocimiento de las enzimas de restriccin. Hay diferentes razones para este hecho. Existe un gran nmero de alelos en la poblacin. Los alelos son formas alternas de un gen. Los alelos resultan en expresiones alternas de rasgos genticos que pueden ser dominantes o recesivos. Los cromosomas existen en pares, uno de origen materno y otro de origen paterno. Sitio de reconocimiento Las dos copias de un gen (que pueden ser de EcoR1: alelos) en cierto sitio cromosmico, las Eco RI site cuales representan la mezcla de los genes | | ADN codificante ACG AAT TCC 3' Coding DNA del padre y de la madre, constituyen el genotipo nico de la descendencia. Protena Thr - Asn - Ser COOH Protein Adems, los alelos son diferentes en sus * Codn modificado ACG AAC TCC 3' Codon changed secuencias de bases, lo que crea diferencias por by mutation mutacin en la distribucin y frecuencia de los sitios de reconocimiento de las enzimas de Thr - Asn - Ser COOH Protein Protena rectriccin. Otras diferencias en las secuencias de bases entre individuos Figura 1 pueden ocurrir por mutaciones y omisiones. Tales cambios tambin pueden crear o eliminar un sitio de reconocimiento. El ejemplo en la Figura 1 muestra como una mutacin silenciosa puede eliminar un sitio de reconocimiento pero dejar la protena producto intacta. Las variaciones individuales en las distancias entre los sitios de reconocimientos son frecuentemente causadas por la presencia de secuencias de bases repetidas intercaladas en el ADN cromosmico. Las secuencias de bases repetidas constituyen una gran parte del genoma de los mamferos y no tienen ninguna funcin gentica conocida. Estas secuencias pueden estar ubicadas entre genes o adyacentes a ellos. Tambin se pueden encontrar dentro de los intrones. Del diez al quince por ciento del ADN de los mamferos consiste de series de secuencias repetidas cortas de bases que se encuentran ordenadas en forma consecutiva formando arreglos. La longitud de estos arreglos (la cantidad de series repetidas) vara entre individuos en diferentes sitios (locus) cromosmicos. TGTTTA | TGTTTA | TGTTTA |.... nmero variable
5' H 2N 5' H 2N
Cuando estos arreglos estn contenidos dentro de sitios de reconocimiento, la longitud de la repeticin determina el tamao de los fragmentos generados por la enzima de restriccin. Hay diferentes tipos de estas secuencias cortas repetidas que han sido clonadas y purificadas.

Informacin Bsica Las variaciones en las secuencias de ADN entre individuos, determinadas por diferencias en el patrn de ruptura de las enzimas de restriccin, son conocidas como Polimorfismos de la Longitud del Fragmento de la Restriccin (RFLPs Restriction Fragment Length Polymorphisms). Los RFLPs son una manifestacin del perfil gentico molecular nico de un individuo o huella gentica del ADN de un individuo. La electroforesis en gel de agarosa es un proceso usado para analizar los fragmentos de ADN generados por las ) ( ) ( enzimas de restriccin. El gel de agarosa est formado por poros microscpicos que larger Restriction actan como cernidor molecuFragments lar. Las muestras de ADN son colocadas en las perforaciones smaller o celdas formados en el gel = recognition site durante su preparacin. Como = repetitious sequence array (variable length) el ADN tiene una fuerte carga negativa a pH neutro, ste Figura 2 migrar a travs del gel hacia el electrodo positivo durante la electroforesis. Los fragmentos Figura 2. Las flechas indican los sitios de ADN son separados por el gel de acuerdo a su tamao. Cuanto de reconocimiento y las zonas negras ms pequeo el fragmento, ms rpido migra. Despus de la sombreadas indican los arreglos de electroforesis, el ADN puede ser visualizado mediante la tincin del secuencias repetidas de longitud gel. La fragmentacin con enzimas de restriccin de molculas de ADN variable. relativamente pequeas, tales como plsmidos y ADN virales, generalmente resulta, despus de la electroforesis, en discretos patrones de bandas correspondientes a los fragmentos de ADN. Sin embargo, la fragmentacin de molculas de ADN grandes y complejas, tales como cromosomas humanos, genera tantos fragmentos de diferentes tamaos que esto excede la capacidad de resolucin del gel. Consecuentemente, la fragmentacin del ADN se observa como una mancha despus de la tincin del gel y no posee patrones de bandas. Alelo 1 Allele 1 Alelo 2 Allele 2 El anlisis de RFLPs de ADN genmico se facilita utilizando la tcnica Southern blot. Despus de la electroforesis, los fragmentos de DNA adheridos al gel son desnaturalizados al sumergir el gel en una solucin alcalina. Esto causa que los fragmentos de cadena doble se conviertan en fragmentos de cadena simple (dejan de existir como bases apareadas en la doble hlice de ADN). Se hace una rplica del patrn electrofortico de los fragmentos de ADN en el gel al transferirlos (blotting) a una lmina de nitrocelulosa o membrana de nylon. Esto se hace colocando la membrana sobre el gel despus de la electroforesis y transfiriendo los fragmentos a la membrana por accin capilar o succin

Informacin Bsica por vaco. El ADN, el cual no es visible, queda adherido permanentemente a la membrana, la cual puede ser manipulada mucho ms facilmente que los geles. El anlisis del ADN adherido a la membrana se hace mediante hibridizacin con una sonda de ADN marcada (probe). En anlisis forense de RFLP, la sonda es un fragmento de ADN que contiene secuencias de bases que son complementarias a los arreglos de secuencias repetidas de bases que se encuentran en los cromosomas humanos. Estas sondas se pueden marcar isotpica o noisotpicamente con molculas reporteras que son usadas para la deteccin del ADN. La membrana que contiene los fragmentos de ADN de cadena simple (desnaturalizados) es incubada con una solucin que contiene la sonda de cadena simple. Bajo condiciones apropiadas, la sonda solo se hibridizar (aparear) con aquellos fragmentos que contienen las secuencias repetidas complementarias. Despus se lava la membrana para eliminar el exceso de solucin de sonda del ADN. Si la sonda utilizada esta marcada isotpicamente, entonces la membrana se coloca sobre una pelcula para rayos X por varias horas. Este proceso se conoce como autoradiografa. Slo los fragmentos de ADN que han hibridizado con la sonda revelarn sus posiciones en la pelcula debido a que las reas localizadas de radioactividad causarn exposicin. Los fragmentos hibridizados aparecen como bandas discretas (huellas) en la pelcula y estarn en la misma posicin relativa en que estaban en el gel de agarosa despus de la electroforesis. Solamente fragmentos especficos de ADN, entre cientos de miles de fragmentos presentes, se hibridizarn con la sonda por la naturaleza selectiva del proceso de hibridizacin. Como la autoradiografa es una tcnica extremadamente sensitiva, slo se requieren pequeas cantidades de muestras de ADN. En casos forenses, las muestras de ADN pueden ser extradas y purificadas de muestras pequeas de piel, sangre, semen, o races del cabello recogidas en la escena del crimen. El ADN usado en anlisis genticos puede ser obtenido de manchas secas de semen y sangre. Los anlisis de RFLPs de estas muestras son comparados luego con las muestras obtenidas del sospechoso. Si los patrones de RFLPs concuerdan, sin lugar a duda el sospechoso estuvo en la escena del crimen. En la prctica, se utilizan varias sondas que contienen diferentes tipos de secuencias de bases repetidas. Esto se hace para satisfacer ciertos criterios estadsticos para la identificacin absoluta y positiva del individuo. El uso de diferentes enzimas de restriccin permite lograr una exactitud mayor a uno en cien millones en las identificaciones positivas. En aos recientes, la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction), mtodo que amplifica el ADN, ha hecho posible que muy pequeas cantidades de ADN encontradas en la escena del crimen sean amplificadas para el posterior anlisis de la huella gentica del ADN. Usando sondas especficas como cebadores (primers) de la ADN polimerasa, varias copias de las reas de inters del ADN pueden ser sintetizadas in vitro y analizadas posteriormente.

Informacin Bsica En este experimento, los fragmentos de ADN son cortados con enzimas de restriccin y los patrones de fragmentacin representan la huella gentica del individuo. Los patrones de fragmentacin del ADN son lo suficientemente simples como para ser analizados directamente en el gel de agarosa teido, lo que elimina la necesidad de hacer un Southern blot. En este caso hipottico, el ADN obtenido de dos sospechosos es cortado con enzimas electroforesis en gel de agarosa de restriccin en reacciones separadas. El objetivo es analizar los patrones de fragmentacin de ADN despus de la electroforesis y determinar si el sospechoso 1 o el sospechoso 2 estuvo en Prepare agarose gel in casting tray la escena del crimen.
Remove end blocks, comb and submerge gel under buffer in electrophoresis chamber
Resumen de la
ESTE EXPERIMENTO NO CONTIENE ADN HUMANO
(-)
(+)
Prepared DNA Samples

Load each sample in consecutive wells
A B C D
(-)
(+)
Pasos:
Snap on safety cover, connect leads to power source and initiate electrophoresis
1. 2.
Preparar el gel de agarosa en un soporte. Retirar las barreras de goma, el peine y sumergir el gel en solucin tampn para electroforesis en la cmara destinada a tal fin. Tener las muestras de ADN preparadas. Depositar cada muestra en los pocillos del gel en orden consecutivo. Colocar la tapa de seguridad, conectar los cables a la fuente de poder e iniciar la electroforesis. Retirar el gel de la cmara y teirlo con InstaStain Methylene Blue para visualizar el ADN. Desteir para analizar los resultados
3.
(-) 1 2 3 4 5 6
4.
Remove gel and stain for visualization with DNA Blue InstaStain
Destain to analyze gel results
5.
(+)
1999 EDVOTEK, Inc.
6.
7.
Procedimientos Experimentales
Objetivo del Experimento:

Crear un conocimiento bsico acerca del mtodo de la huella gentica del ADN al analizar las variaciones en las patrones de fragmentacin con enzimas de restriccin en diferentes molculas de ADN e identificar la procedencia de una muestra desconocida de ADN usando la lgica del anlisis de la huella gentica del ADN.
Seguridad en el Laboratorio:
Guantes y anteojos de seguridad deben ser usados como buena prctica de laboratorio.
Preparacin del Gel de Agarosa

Preparacin del soporte para el gel
Si usa soportes de 7 x 7 cm: 1. Usando barreras de goma o cinta adhesiva, cierre los extremos abiertos del soporte del gel, el cual debe estar limpio y seco. A. Si usa barreras de goma: Coloque una barrera de goma en cada extremo del soporte. Asegrese que sta permanezca firmemente en contacto con los costados y la base del soporte. B. Si usa cinta adhesiva: Extienda la cinta (1.9 cm de ancho aproximadamente) sobre los costados y la base del soporte del gel. Doble los bordes de la cinta hacia atrs, sobre los costados y la base del soporte. Presione firmemente los puntos de contacto para asegurar un buen sellado. 2. Coloque el molde para formar los pocillos (peine) en el primer set de ranuras, el cual se encuentra ms cerca del extremo del soporte. Asegrese que el peine apoye firmemente sobre el soporte y atraviese en forma plana el mismo.
10

Si usa el soportes de 7 x 15 cm para dos geles:

1. Usando barreras de goma o cinta adhesiva, cierre los extremos abiertos del soporte del gel, el cual debe estar limpio y seco. A. Si usa barreras de goma: Coloque una barrera de goma en cada extremo del soporte. Asegrese que sta permanezca firmemente en contacto con los costados y la base del soporte. B. Si usa cinta adhesiva: Extienda la cinta (1.9 cm de ancho) sobre los costados y la base del soporte del gel. Doble los bordes de la cinta hacia atrs, sobre los costados y la base del soporte. Presione firmemente los puntos de contacto para asegurar un buen sellado. 2. Coloque el molde para formar los pocillos (peine) en el primer set de ranuras, el cual se encuentra ms cerca del extremo del soporte. Coloque un segundo peine en el set de ranuras del medio. Asegrese que el peine apoye firmemente sobre el soporte y atraviese en forma plana el mismo.
Guantes y anteojos de seguridad deben ser usados
Preparacin del gel

Este experimento requiere un gel de concentracin 0.8%. Preparacin de geles individuales al 0.8 % preparados con UltraSpec-Agarose
Cantidad de Agarosa (gramos) Volumen de Volumen de Tampn 50x Agua Destilada Volumen Total
Tabla A:
Tamao del Soporte del Gel
3. Use un erlenmeyer de 250 ml para preparar la solucin tampn diluda. Con una pipeta de 1 ml, mida el tampn concentrado y agregue agua destilada como se indica en la Tabla A.
7 x 7 cm 7 x 15 cm 10.5 x 14 cm
0.24 gr 0.48 gr 0.8 gr
0.6 ml 1.2 ml 2.0 ml
29.4 ml 58.8 ml 98.0 ml
30 ml 60 ml 100 ml
4. Aada la cantidad adecuada de agarosa en polvo. Agite en forma circular la mezcla para deshacer los grumos de agarosa.
11

Preparacin del Gel de Agarosa 5.
Con un marcador, indique el nivel del volumen de la solucin en el exterior del erlenmeyer. Hierva la mezcla para disolver la agarosa en polvo. La solucin final debe ser limpia, como agua, sin partculas no disueltas en suspensin. A. Mtodo utilizando Horno Microondas: Cubra el erlenmeyer con papel plstico para minimizar la evaporacin. Caliente la mezcla en la potencia mxima por un minuto. Agite circularmente la mezcla y caliente en potencia mxima con descargas de 25 segundos hasta que toda la agarosa est completamente disuelta. B. Mtodo utilizando una plancha caliente o mechero: Cubra el erlenmeyer con papel de aluminio para minimizar la evaporacin. Caliente la mezcla sobre un mechero hasta que hierva, agitando circularmente de vez en cuando. Hierva hasta que toda la agarosa se haya disuelto completamente.
6.
Consejo!
Consejo: a altas altitudes, es recomendable usar horno microondas para alcanzar temperaturas de ebullicin.
7.
Advertencia!
No vuelque agarosa hirviendo en el soporte porque sto puede daar irreversiblemente el soporte del gel.
Enfre la solucin de agarosa a 55C realizando movimientos circulares constantemente para disipar el calor en forma homognea. Si ocurre evaporacin detectable, aada agua destilada hasta llevar la solucin al volumen original como se marc en el exterior del erlenmeyer en el paso 5.
55C
Despus que el gel se haya enfriado a 55C: Si usa barreras de goma, vaya al paso 9. Si usa cinta adhesiva, contine con el paso 8. 8. Selle la interfase entre el soporte del gel y la cinta para prevenir fugas de la solucin de agarosa. Use una pipeta de transferencia para depositar una pequea cantidad de agarosa fra en ambos extremos internos del soporte. Espere aproximadamente un minuto para que solidifique la agarosa. Vuelque la solucin de agarosa fra dentro del soporte. Asegrese que el soporte est sobre una superficie nivelada.
9.
10. Permita que el gel se solidifique completamente. El gel estar fro y firme despus de aproximadamente 20 minutos.
12

Preparacin del gel para la electroforesis

11. Retire las barreras de goma o la cinta adhesiva despacio y cuidadosamente.
Consejo!
Consejo: tenga cuidado de no daar el gel cuando retira las barreras de goma. Un cuchillo de plstico delgado o esptula se puede insertar entre el gel y las barreras para romper la posible tensin superficial.
12. Retire el peine tirando lentamente hacia arriba. Haga sto cuidadosamente para prevenir rupturas en los pocillos del gel. 13. Coloque el gel con su soporte en la cmara para electroforesis, correctamente orientado, centrado y nivelado sobre la plataforma. 14. Llene la cmara de electroforesis con el volumen requerido de tampn diludo, de acuerdo a la Tabla B.
Tabla B:
EDVOTEK Modelo # M6 M6 + M12, M20 M36
Dilucin del tampn para electroforesis y volumen requerido para llenar la cmara para electroforesis
Volumen de Tampn 50x Volumen de Agua Destilada Volumen Total
4 ml 6 ml 8 ml 10 ml
196 ml 294 ml 392 ml 490 ml
200 ml 300 ml 400 ml 500 ml
15. El gel de agarosa es llamado gel submarino porque el gel debe estar sumergido en tampn para luego proceder al depsito de las muestras y la separacin electrofortica. Asegrese que el gel est completamente cubierto con solucin tampn. 16. Deposite las muestras en los pocillos y lleve a cabo la electroforesis de acuerdo a las instrucciones experimentales que comienzan en la pgina 14.
13
Prctica del Depsito de las Muestras en el Gel

Para depositar volumenes precisos y reproducibles de muestra, se usa una micropipeta automtica. En el caso de geles que van a ser teidos usando Azul de Metileno, depositar 25 microlitros de muestra en cada pocillo. Pregunte a su instructor la cantidad de muestra que deber depositar. Con el sistema EDVOTEK, se puede usar un sistema alternativo para depositar las muestras, usando pipetas de transferencia con puntas finas descartables. Las pipetas de transferencia no son precisas, y como sus volumenes no pueden ser controlados exactamente, su uso puede resultar en una cantidad significativa de muestra desperdiciada. Si usa pipetas de transferencia, deposite la muestra hasta que el pocillo est lleno. Para facilitar el depsito de pequeos volumenes de muestra con pipetas de transferencia, utilizar la pipeta solamente, no utilizar el bulbo de ayuda de la pipeta. Este Kit contiene una solucin para practicar el depsito de las muestras. Si usted no est familiarizado con el depsito de muestras en geles de agarosa, se le sugiere que practique aplicando esta solucin en los pocillos antes de llevar a cabo el experimento. Tambin se recomienda la preparacin de un gel de prctica por separado. Pasos a seguir para practicar como depositar muestras en el gel: 1. Preparar un gel con el nmero mximo de pocillos y colocarlo cubierto de tampn en un aparato de electroforesis. Otra alternativa es cortar el gel en pedazos y colocar los distintos pedazos en pequeos recipientes llenos con agua destilada. Esto simula un gel sumergido en la cmara de electroforesis. Practicar el depsito de la solucin de prctica en los pocillos. Tener cuidado de no daar los pocillos con la punta de la pipeta. Si usted necesita ms prctica, retirar la solucin de prctica de los pocillos. Esto se puede hacer agregando solucin tampn dentro de los pocillos usando una pipeta de transferencia. Reemplace el gel de prctica por un gel nuevo para realizar el experimento verdadero. La solucin de prctica est diluda en el tampn y por lo tanto no interferir con el experimento.
2. 3.
4.
14
Ejecucin de la Electroforesis en Gel de Agarosa

Colocar los tubos conteniendo las muestras de ADN en el bao de agua a 65C antes de depositar las muestras en el gel. A 65C, uniones no especficas debido a la presencia de extremos cohesivos generados por la digestin con enzimas de restriccin desaparecern. Esto facilita la aparicin de bandas individuales de ADN ms ntidas luego de la separacin electrofortica.
Recordar: durante la electroforesis, las muestras de ADN migran hacia el electrodo positivo. Antes de depositar las muestras, asegurarse que el gel est correctamente orientado en la cmara para electroforesis
Black Sample wells
Depsito de las muestras de ADN

1. Caliente las muestras de ADN A-F por dos minutos a 65C. Deje enfriar las muestras durante unos pocos minutos. Deposite cada una de las muestras en los tubos A-F en los pocillos en orden consecutivo. La cantidad de muestra que debe ser depositada es 35-38 microlitros.
+ Red
2.
Corrida del gel

1. Despus que las muestras han sido depositadas en los pocillos, cuidadosamente coloque la tapa sobre los terminales de los electrodos. Asegrese que los indicadores positivos y negativos que se encuentran en la tapa y en la cmara del aparato de electroforesis estn correctamente orientados. 2. Conecte el cable negro en la entrada negativa (negra) de la fuente de poder. Conecte el cable rojo en la entrada positiva (roja) de la fuente de poder. Ajuste la fuente de energa al voltaje requerido y corra la electroforesis por el tiempo apropiado. La Tabla C presenta instrucciones generales. Revise que la corriente circule adecuadamente. Si as es, deben observarse burbujas formndose sobre los electrodos.
Tabla C:
Voltaje (voltios)
Tiempo y voltaje recomendado

Tiempo mximo recomendado
Tiempo mnimo recomendado
3.
50 70 125
60 min 40 min 30 min
2.0 hrs 1.5 hrs 45 min 4.
* El modelo M6 de EDVOTEK no deber ser corrido a ms de 70 voltios
15
Ejecucin de la Electroforesis en Gel de Agarosa
5.
Permita que la tintura de seguimiento migre 3.5 a 4 cm desde los pocillos para una adecuada separacin de las bandas de ADN. Cuando haya finalizado la electroforesis, apague y desconecte la fuente de poder, desconecte los conductores y saque la tapa. Saque el gel del soporte. Coloque sus manos sobre cada extremo del gel para evitar que ste se deslice fuera del soporte. Transfiera el gel desde el soporte a la bandeja de tincin para luego visualizar el ADN con DNA InstaStain Methylene Blue o Methylene Blue Plus.
6.
7.
8.
16
Tincin y Visualizacin del ADN

Los experimentos de electroforesis de EDVOTEK Series 100 contienen un nuevo mtodo para tincin de ADN en geles de agarosa. Basado en tecnologa de avanzada, InstaStain Methylene Blue es seguro, rpido y minimiza los incovenvenientos que provoca la tincin con Azul de Metileno.
Tincin con InstaStain Methylene Blue

1. Despus que la electroforesis haya terminado, colocar el gel sobre una superficie plana. Humedezca el gel con varias gotas de solucin tampn. Usando guantes, colocar el lado azul de la lmina de InstaStain Methylene Blue sobre el gel humedecido. Presionar con los dedos sobre toda la superficie de la lmina de InstaStain Methylene Blue. Hago sto varias veces. Coloque el gel y el InstaStain Methylene Blue sobre papel de plstico. Luego coloque el soporte del gel y un pequeo vaso de precipitado sobre sto. Esto asegura que la lmina de InstaStain Methylene Blue se mantenga en contacto con el gel. Deje transcurrir 15 minutos.
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2.
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3.
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4.
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Desteimiento del gel y visualizacin del ADN

5. Despus de 15 minutos, retire la lmina de InstaStain Methylene Blue y transfiera el gel a un recipiente plstico pequeo. Realizar el desteimiento con agua destilada que ha sido calentada previamente a 37C. Primer desteimiento: sumergir el gel en una pequea cantidad de agua destilada a 37C durante 15 minutos agitando de vez en cuando. Segundo desteimiento: sumergir el gel en una pequea cantidad de agua destilada a 37C durante 15 minutos agitando de vez en cuando. Atencin: no exceder los
37C. Temperaturas ms
6.
Ventajas de InstaStain Methylene Blue comparado con tincin lquida:

Seguro y simple de usar Tincin rpida en 15 minutos tincin uniforme Desperdicio de lquido mnimo 8. 7.
Despus del primer altas ablandarn el gel y desteimiento, las bandas de puede llegar a romperse. ADN ms grandes sern visibles como bandas azul oscuro sobre un fondo azul ms claro. Cuando el gel haya (-) sido desteido completamente, las bandas azul oscuro se aclararn y el fondo quedar azul claro. Sacar cuidadosamente el gel de la bandeja de tincin y examinar el gel sobre un sistema de visualizacin de gel usando luz visible. Para una mejor visibilidad, usar el filtro de mbar que acompaa el equipo EDVOTEK.
(+)
9.
Si el gel es muy claro y las bandas son difciles de visualizar, repetir la tincin y el desteimiento.
Almacenamiento y Eliminacin del Gel:

Un gel teido con InstaStain Methylene Blue puede ser guardado en la heladera por varias semanas. Colocar el gel en una bolsa plstica cerrada y llena con lquido para desteir. NO CONGELAR EN EL FREEZER LOS GELES DE AGAROSA Geles teidos pueden ser descartados con los residuos slidos.
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Mtodo tradicional de tincin utilizando Azul de Metileno marca Methylene Blue Plus
1. Retirar el gel del soporte y colocarlo en una bandeja conteniendo 600 ml de Methylene Blue Plus diludo. No teir el gel en el aparato de electroforesis. 2.
Teir el gel por un mnimo de 30 minutos agitando de vez en cuando. Realizar el desteimiento con agua destilada calentada previamente a 37C. Primer desteimiento: sumergir el gel en 600 ml de agua destilada a 37C durante 15 minutos agitando de vez en cuando. Luego tirar el agua destilada. Segundo desteimiento: sumergir el gel en 600 ml de agua destilada a 37C durante 15 minutos agitando de vez en cuando.
Atencin: no exceder los 37C. Temperaturas ms altas ablandarn el gel y puede llegar a romperse.
3.
Diluir la solucin 10x de Methylene Blue Plus a 1x combinando 1 parte de tintura con 9 partes de agua destilada o desionozada.
4.
Las bandas sern visibles luego del segundo desteimiento. Tambin puede dejarse el gel destiendo toda la noche.
5.
Sacar cuidadosamente el gel de la bandeja de tincin y examinarlo sobre un sistema de visualizacin de gel usando luz visible. Para una mejor visibilidad, usar el filtro de mbar que acompaa el equipo EDVOTEK. Si el gel es muy claro y las bandas son difciles de visualizar, repetir la tincin y el desteimiento.
6.
Almacenamiento y Eliminacin del Gel

Un gel teido con Methylene Blue Plus puede ser guardado en la heladera por varias semanas. Colocar el gel en una bolsa plstica cerrada y llena con lquido para desteir. NO CONGELAR EN EL FREEZER LOS GELES DE AGAROSA Geles teidos pueden ser eliminados con los residuos slidos.
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Preguntas de Estudio
1. 2. Defina RFLPs y explique su importancia. D una lista de los pasos necesarios para obtener la huella gentica del ADN desde la extraccin del ADN hasta la autoradiografa. Explique la importancia de las secuencias de ADN repetidas. Quines son los nicos individuos que poseen la misma huella gentica del ADN? Qu clase de clulas humanas pueden ser utilizadas para esta tcnica?
3. 4.
5.
20
21
Gua para el instructor
Informacin general
Una variedad de factores, tales como tamao de la clase, duracin de las sesiones de laboratorio y disponibilidad de equipos, determinarn la implementacin de este experimento. Esta gua puede ser adaptada para cubrir sus necesidades especficas.
Preparacin de muestras de ADN pre-digeridas con enzimas de restriccin:

Este experimento incluye muestras de ADN que han sido pre-digeridas con enzimas. Luego de verificar el volumen de las muestras para asegurarse que no ocurri evaporacin, las muestras estn listas para ser dispensadas. Preparar un bao de agua a 65C para calentar las muestras que contienen los fragmentos de ADN. Los alumnos pueden hacer sto antes de depositar las muestras en el gel. Se recomienda preparar alcuotas de 25 microlitros de muestra en tubos de 0.5 o 1.5 ml. Si se cuenta con una centrfuga: centrifugar brevemente los tubos con la muestra antes de depositar la muestra en el gel. Si no se cuenta con una centrfuga: dar golpes suaves al tubo con el fin de tener toda la muestra en la base del tubo y as cargar en el gel la mayor cantidad de muestra posible.
Preparacin de geles para practicar el depsito de la muestra en el gel:

Prepare un gel con el nmero mximo de pocillos. Corte el gel en pequeos trozos y colquelos en un recipiente lleno con agua destilada. Esto simular un gel sumergido en tampn en una cmara de electroforesis.
Consejo!
Recuerde: un gel solidificado puede ser guardado en la heladera, sumergido en tampn, hasta dos semanas.
Preparacin de geles para electroforesis:

Si usted prefiere que cada estudiante prepare su propio gel, las instrucciones comienzan en la pgina 9. Para facilidad y conveniencia, se pueden preparar grandes volumenes de agarosa para ser usada por toda la clase, como se indica ms abajo.
22

Informacin general
Tiempo requerido:
1. Preparacin del gel: este procedimiento requiere aproximadamente entre 30 y 40 mintuos. Generalmente, 20 minutos de dicho tiempo son necesarios para la solidificacin del gel. El tiempo aproximado para la electroforesis vara de 30 minutos a 2 horas.
2.
Preparacin de grandes volumenes de gel

1. Use un erlenmeyer de 500 ml para preparar la solucin diluda del tampn. Aada 7.5 ml de tampn concentrado Aada 367.5 ml de agua destilada Vuelque todo el contenido del frasco de UltraSpec-Agarose ( 3 gramos) en el tampn diludo. Agitar circularmente para dispersar los grumos. Con un marcador, indique el nivel de la solucin en el exterior del erlenmeyer. Caliente la solucin de agarosa como se indica en la preparacin individual de geles. El tiempo de calentamiento se ajustar de acuerdo al volumen total de la solucin tampn Enfre la solucin de agarosa a 55C con movimientos circulares para promover la disipasin homognea del calor. Aada agua destilada hasta llevar la solucin al volumen original de 375 ml como se marc en el exterior del erlenmeyer en el paso 3. 6.
2.
3.
4.
5.
55C
Tabla D:
Preparacin de grandes volumenes de gel

Cantidad de Agarosa (gramos)
Coloque el volumen adecuado de agarosa fra en cada soporte. El volumen depende del tamao del soporte del gel (vea la Tabla A).
3.0 gm
7.5 ml
367.5 ml
375 ml
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Preparacin de Reactivos
Solucin tampn para electroforesis
En el caso del anlisis del ADN, para preparar tanto la solucin tampn para el gel de agarosa como el tampn para la cmara de electroforesis se usa la misma solucin tampn para electroforesis EDVOTEK 50x.
El tampn recomendado es Tris-acetato-EDTA ( 20 mM tris, 6 mM acetato de sodio, 1 mM de cido etilendiamino tetractico) pH 7.8. Prepare el tampn de acuerdo a las instrucciones en la Tabla B de abajo. Para diluir el tampn concentrado 50 x EDVOTEK, agregar 1 parte de tampn concentrado por cada 49 partes de agua destilada o desionizada. La misma solucin tampn es utilizada para preparar el gel y para llenar la cmara de electroforesis. No utilizar agua corriente.
Tabla B:
EDVOTEK Modelo # M6 M6 + M12, M20 M36
Dilucin del tampn para electroforesis y volumen requerido para llenar la cmara para electroforesis
4 ml 6 ml 8 ml 10 ml
196 ml 294 ml 392 ml 490 ml
200 ml 300 ml 400 ml 500 ml
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Preparacin de Reactivos
Almacenamiento y Eliminacin del Gel

Si usa InstaStain Methylene Blue
Un gel teido con InstaStain Methylene Blue puede ser guardado en la heladera por varias semanas. Coloque el gel en una bolsa plstica cerrada y llena con lquido para desteir. NO CONGELAR EN EL FREEZER LOS GELES DE AGAROSA
Las lminas usadas de InstaStain Methylene Blue y los geles desteidos puede ser eliminados con los residuos slidos. Las soluciones usadas para desteir los geles pueden ser tiradas en las piletas.
Diluir la solucin 10x de Methylene Blue Plus a 1x combinando 1 parte de tintura con 9 partes de agua destilada o desionozada.
Si usa Methylene Blue Plus:

Un gel teido con Methylene Blue Plus puede ser guardado en la heladera por varias semanas. Coloque el gel en una bolsa plstica cerrada y llena con lquido para desteir. NO CONGELAR EN EL FREEZER LOS GELES DE AGAROSA Los geles desteidos puede ser eliminados con los residuos slidos. Las soluciones usadas para desteir los geles pueden ser tiradas en las piletas.
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Ayuda para la electroforesis

Consideraciones a tener en cuenta durante una electroforesis:
1. No mover el aparato de electroforesis inmediatamente despus que las muestras hayan sido depositadas en los pocillos. Esto provocara que las muestras difundan desde los pocillos hacia la solucin tampn y sto afectara los resultados. Si es necesario mover el aparato, hacerlo despus que la tintura de seguimiento haya migrado al menos 1 cm desde los pocillos hacia el interior del gel. Para obtener una separacin ptima de los fragmentos de ADN, no usar voltajes mayores a 125 voltios porque sto podra sobrecalentar y fundir el gel. Las muestras de ADN contienen una tintura de seguimiento que migrar ms rpido que el ADN y por lo tanto por delante del mismo. La migracin de la tintura de seguimiento ser claramente visible luego de 10 a 15 minutos de iniciada la electroforesis. 4. Si los fragmentos de ADN son de tamaos similares, stos migrarn cerca uno del otro. En general, corridas electroforticas ms largas aumentarn la separacin entre fragmentos de tamao similar. Los experimentos que requieren la medida del tamao o peso de los fragmentos deberan ser corridos de acuerdo al tiempo ptimo recomendado para asegurar una separacin adecuada.
2.
3.
(-)
pocillos WELLS
Migration 3.5 - 4.0 cm
5.
TRACKING tintura de DYE seguimiento
La electroforesis debera terminar cuando la tintura de seguimiento haya migrado al menos 3.5 a 4 centmetros desde los pocillos y antes de que sta migre afuera del gel. Para resultados ptimos, teir el gel inmediatamente despus de haber finalizado la electroforesis. Para conveniencia, la fuente de poder puede ser conectada a un cronmetro casero automtico y as evitar que las muestras corran afuera del gel.
(+)
26

Cuidado y mantenimiento del aparato para electroforesis:

1. La temperatura de la agarosa que se vierte en el soporte durante la preparacin del gel no debe superar los 55C. La solucin de agarosa caliente puede daar irreversiblemente el soporte del gel.
55C
2.
Evite tocar los frgiles electrodos de platino del aparato de electroforesis. Cuando se retira la tapa del aparato, la fuente de poder debe estar apagada y los cables deben estar desconectados. Para limpiar la cmara del aparato, el soporte del gel y los peines, enjuague bien con agua corriente. Si el agua corriente tiene alto contenido de minerales, enjuagar todo con agua destilada. Deje que los componentes se sequen a temperatura ambiente. No use detergentes de ninguna clase ni exponga el aparato a alcoholes. Si alguno de los aparatos se daa o se produce una rajadura, inmediatamente desconecte la fuente de poder. No use el aparato.
3.
4.
5.
Como evitar errores comunes:

Para asegurarse que las bandas de tinturas sean bien resueltas, asegrese que la frmula del gel sea la correcta (ver Tabla A) y que el gel sea corrido durante el tiempo adecuado. Diluir correctamente el tampn concentrado para la preparacin del gel y de la solucin tampn para la cmara de electroforesis. Recordar que si el gel no contiene el tampn, no habr movilidad de las tinturas o de ADN. Usar slo agua destilada para preparar la solucin tampn. No usar agua corriente. Para obtener resultados ptimos, usar tampn para electroforesis fresco, preparado recientemente y de acuerdo a las instrucciones. Antes de realizar el experimento real, practique las tcnicas para depositar las muestras en el gel para evitar la dilucin de la muestra con el tampn durante el depsito de las muestras en el gel. Para evitar la prdida de fragmentos de ADN en la solucin tampn, asegurarse de que el gel est orientado correctamente de manera que las muestras no corran en la direccin incorrecta y fuera del gel.
27

Para evitar obtener geles que no contienen los fragmentos ms pequeos de ADN (los fragmentos pequeos corren ms rpido), recordar que la tintura en la muestra corre por delante de los fragmentos ms pequeos de ADN, por lo tanto, terminar la electroforesis antes que la tintura corra fuera del gel. Si las bandas de ADN aparecen muy claras o desvanecientes despus de la tincin y del desteimiento, repetir el procedimiento. Teir durante un perodo de tiempo ms largo no daar el gel pero en este caso el desteimiento puede requerir ms tiempo.
Esquema Ideal de los Resultados
(-) 1 2 3 4 5 6
La figura es un esquema ideal que muestra las posiciones relativas de los fragmentos de ADN. Los resultados reales producirn bandas ms anchas de diferentes intensidades. Los fragmentos mas pequeos se teirn menos eficientemente y aparecern como bandas mas tenues. El esquema ideal muestra la posicin relativa de las bandas, pero no est representado en escala. Lnea 1 2 3 4 Tubo A B C D E F
(+)
5 6
Muestra de ADN de la escena del crimen cortada con la enzima 1 Muestra de ADN de la escena del crimen cortada con la enzima 2 Muestra de ADN del sospechoso #1 cortada con la enzima 1 Muestra de ADN del sospechoso #1 cortada con la enzima 2 Muestra de ADN del sospechoso #2 cortada con la enzima 1 Muestra de ADN del sospechoso #2 cortada con la enzima 2
Pregunta: Podran haber sido distinguidas estas muestras de ADN si solamente se hubiera utilizado la enzima nmero 1?
28
Respuestas a las Preguntas de Estudio

1. RFLPs (Polimorfismos de la Longitud del Fragmento de la Restriccin) son las variaciones en las secuencias de ADN entre individuos determinadas por las diferencias en el patrn de fragmentacin con enzimas de restriccin. Pasos necesarios par el anlisis de la huella gentica del ADN: Extraccin de ADN de cadena doble de alto peso molecular de la sangre, semen, piel o races del cabello y purificacin; Digestin con enzimas de restriccin para obtener fragmentos de diferentes tamaos; Electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos de acuerdo al tamao; Desnaturalizacin del ADN para separar las dos cadenas de ADN; Southern blot para transferir los resultados a una membrana de nylon o nitrocelulosa; Agregado de una sonda marcada radioactivamente la cual se hibridizar al ADN complementario de tal modo que los resultados podrn ser expuestos a la pelcula para rayos X y ser detectados por autoradiografa.
2.
3.
Existen series de secuencias de bases repetidas en forma consecutiva las cuales varan en nmero de un individuo a otro. Estas secuencias repetidas pueden estar ubicadas entre genes o adyacentes a ellos, constituyen una porcin grande del genoma de los mamferos y no se conoce su funcin. Por consiguiente, cuando las enzimas de restriccin cortan el ADN, se producen una variedad fragmentos de diferentes tamaos de acuerdo a un patrn nico para cada persona. Gemelos idnticos son los nicos individuos que poseen la misma huella gentica del ADN. El ADN que se encuentra en clulas de la sangre, semen, piel y races de cabello es utilizado en el anlisis de la huella gentica del ADN.
4.
5.

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Anlisis de la Huella Gentica del ADN

Identificacin del ADN basada en Patrones de Fragmentacin con Enzimas de Restriccin

Objetivo del Experimento

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Componentes del Experimento

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Materiales Necesarios para el Experimento

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ESTE EXPERIMENTO NO CONTIENE ADN HUMANO

Prepared DNA Samples

Destain to analyze gel results

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Objetivo del Experimento:

Preparacin del Gel de Agarosa

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Si usa el soportes de 7 x 15 cm para dos geles:

Guantes y anteojos de seguridad deben ser usados

Preparacin del gel

0.24 gr 0.48 gr 0.8 gr

0.6 ml 1.2 ml 2.0 ml

29.4 ml 58.8 ml 98.0 ml

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Preparacin del gel para la electroforesis

196 ml 294 ml 392 ml 490 ml

200 ml 300 ml 400 ml 500 ml

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Prctica del Depsito de las Muestras en el Gel

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Ejecucin de la Electroforesis en Gel de Agarosa

Depsito de las muestras de ADN

Corrida del gel

Tiempo y voltaje recomendado

Tiempo mnimo recomendado

60 min 40 min 30 min

2.0 hrs 1.5 hrs 45 min 4.

* El modelo M6 de EDVOTEK no deber ser corrido a ms de 70 voltios

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Ejecucin de la Electroforesis en Gel de Agarosa

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Tincin y Visualizacin del ADN