UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CINCIAS AGRRIAS E VETERINRIAS CMPUS DE JABOTICABAL

INFLUNCIA DO TEMPO, TEMPERATURA E RECIPIENTE DE ESTOCAGEM NAS CARACTERSTICAS DO HEMOGRAMA DE CES ADULTOS HGIDOS

Patrcia Sampaio Coelho Mdica Veterinria

JABOTICABAL SO PAULO - BRASIL Agosto de 2006

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CINCIAS AGRRIAS E VETERINRIAS CMPUS DE JABOTICABAL

INFLUNCIA DO TEMPO, TEMPERATURA E RECIPIENTE DE ESTOCAGEM NAS CARACTERSTICAS DO HEMOGRAMA DE CES ADULTOS HGIDOS

Ps-Graduanda: Patrcia Sampaio Coelho Orientador: Prof. Dr. Aureo Evangelista Santana

Dissertao apresentada Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias UNESP, Cmpus de Jaboticabal, como parte das exigncias para a obteno do ttulo de Mestre em Medicina Veterinria (Patologia Animal).

JABOTICABAL SO PAULO BRASIL Agosto de 2006

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DADOS CURRICULARES DO AUTOR PATRCIA SAMPAIO COELHO - nasceu em So Paulo, no dia 29 de Agosto de 1980. Filha de Srgio Lima Sampaio Coelho e Maria Helena Andra Szilgyi, concluiu os cursos ginasial e colegial no Colgio Pueri Domus, em So Paulo, SP. Tornou-se graduada em Medicina Veterinria no ano de 2002, pela Universidade Paulista e ingressou no Programa de Ps-graduao em Medicina Veterinria, curso de mestrado, em agosto de 2004.

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envergonharUm homem nunca deve envergonhar-se por reconhecer que se enganou, pois isso equivale a dizer que hoje mais sbio do que era ontem.
Jonatham Swift

Procure ser uma pessoa de valor, em vez de procurar ser uma pessoa de sucesso. O procurar sucesso conseqncia.
Albert Einstein

Planta no teu caminho sementes de bondade e amor, e no te preocupes com os resultados.

C. Pastorino

Ofereo e Dedico
minha me Maria Helena e meu padrasto Victor, que eu amo tanto e so as pessoas responsveis por tudo que sou hoje. Esta conquista no s minha, mas de vocs tambm. Ao meu noivo Adislau, pelo amor dedicado, companheirismo e pacincia e por ser uma pessoa to especial e presente na minha vida.

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As pessoas entram na nossa vida por acaso, mas no por acaso que elas permanecem.
Llian Tonet

Agradeo
Ao meu orientador Prof. Dr. Aureo Evangelista Santana pela sabedoria, pacincia e por acreditar em mim, possibilitando concluir mais esta etapa da minha vida acadmica. Ao programa de Ps-graduao em Medicina Veterinria da FCAV/UNESP, Cmpus de Jaboticabal, por ter me concedido a chance de realizar este mestrado. Coordenao de Aferfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES), pela bolsa de estudos concedida. Ao Hospital Veterinrio Governador Laudo Natel por me acolher e possibilitar a realizao do presente trabalho.

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Aos Professores Mirela Tinucci Costa e Antnio Carlos Alessi pelo enriquecimento de minha dissertao, com seus conhecimentos no exame de qualificao. Ao Prof. Alberto Carnelutti Filho pelo auxlio com as anlises estatsticas Aos docentes e funcionrios que contriburam para que fosse possvel a realizao deste trabalho, em especial ao Eugnio, Matheus e Alosio, funcionrios do Laboratrio de Patologia Clnica do Hospital Veterinrio Governador Laudo Natel. Aos residentes e ps-graduandos Renato, Thiago e Gustavo por terem me ajudado na fase inicial deste trabalho. s amiga eternas Simone e Pati por serem as to bondosas, companheiras e sinceras, e por todos os momentos maravilhosos que passamos e ainda vamos passar juntas. Ao meu pai pelos bons momentos que passamos juntos, aqueles que sempre valero a pena recordar. Ao meu irmo, que mesmo muito longe, esteve sempre preocupado comigo e minha vida profissional. Fernanda Gomes Velasque Gama por ser mais que uma companheira de trabalho, uma grande amiga e pessoa iluminada, na qual eu me espelho profissionalmente e pessoalmente. Paula Nunes Rosato por ser uma amiga e companheira de trabalho to dedicada e sincera.

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s ps-graduandas Maria Lusa Buffo, Flvia Coleta, Paula di Filipo e Ana Paula Nakage pelo apoio durante estes anos de trabalho. grande amiga Jane, uma pessoa meiga e sempre disposta a judar. s amigas Ester, Marcinha, Flvia, Sabrina (Recife), Sabrina (Curitiba), Ricardo, Durva, Viva, Mal, Fabiano e Consolo, por todos os momentos especiais que passamos juntos. Sabrina (Recife), Fernanda, Paula e Simone pela boa vontade e pacincia para me ajudar com as dvidas que surgiram durante este trabalho. s amigas Gabriela, Mariana, Carina, Juliana, Diana, Carla e Roberta que, apesar da distncia, so e sempre sero muito importantes na minha vida. Aos meus familiares Tia Muth, Fbio, Ana, Lucas, Av Ruth, Av Suzana, Cunhada Pri, Thas e Vitinho, pelo apoio, carinho e momentos de distrao durante minhas visitas a So Paulo. Dona Maria por ter cuidado de mim como se fosse sua filha. minha cadela Laila por ser um presente de Deus, a cadela mais meiga, amiga, companheira e amorosa. um privilgio ter um ser to especial ao meu lado.

ix SUMRIO

Pgina LISTA DE FIGURAS................................................................................................xi LISTA DE APNDICES...........................................................................................xv 1. INTRODUO E REVISO DE LITERATURA...................................................1 1.1 Importncia Clnica do Hemograma........................................................2 1.1.1 Eritrograma................................................................................2 1.1.1.1Contagem Global de Hemcias, Concentrao de Hemoglobina e Hematcrito..........................................2 1.1.1.2 Hemoglobina Livre........................................................4 1.1.1.3 ndices Eritrocticos Absolutos......................................4 1.1.1.4 Reticulcitos..................................................................5 1.1.2 Leucograma................................................................................6 1.1.2.1 Contagem Global de Leuccitos...................................6 1.1.2.2 Contagem Diferencial de Leuccitos............................7 1.1.2.2.1 Basfilos..........................................................7 1.1.2.2.2 Eosinfilos.......................................................7 1.1.2.2.3 Neutrfilos.......................................................8 1.1.2.2.4 Linfcitos.........................................................9 1.1.2.2.5 Moncitos......................................................10 1.1.3 Trombograma..........................................................................10 1.1.3.1 Contagem de Plaquetas..............................................10 1.1.3.2 Volume Plaquetrio Mdio..........................................11 1.1.3.3 PDW............................................................................12 1.2 Avaliao da Influncia do Perodo de Estocagem nos Parmetros do Eritrograma............................................................................................12 1.3 Avaliao da Influncia do Perodo de Estocagem nos Parmetros do Leucograma..........................................................................................13

x 1.4 Avaliao da Influncia do Perodo de Estocagem nos Parmetros do Trombograma........................................................................................14 2. OBJETIVOS......................................................................................................16 3. MATERIAL E MTODOS..................................................................................16 3.1 Parcelas Experimentais..........................................................................16 3.2 Colheita do Sangue Perifrico................................................................16 3.3 Processamento da Amostras.................................................................17 3.4 Anlise Estatstica..................................................................................18 4. RESULTADOS E DISCUSSO.........................................................................19 4.1 Eritrograma...........................................................................................19 4.1.1 Contagem Global de Hemcias................................................19 4.1.2 Hemoglobina.............................................................................20 4.1.3 Hemoglobina Livre....................................................................21 4.1.4 Hematcrito..............................................................................22 4.1.5 VCM..........................................................................................23 4.1.6 HCM..........................................................................................24 4.1.7 CHCM.......................................................................................25 4.1.8 Reticulcitos.............................................................................26 4.2 Leucograma...........................................................................................28 4.2.1 Contagem Global de Leuccitos...............................................28 4.2.2 Basfilos...................................................................................29 4.2.3 Eosinfilos................................................................................30 4.2.4 Neutrfilos Bastonetes..............................................................31 4.2.5 Neutrfilos Segmentados.........................................................32 4.2.6 Linfcitos...................................................................................33 4.2.7 Moncitos.................................................................................34 4.2.8 Leuccitos Degenerados..........................................................36 4.3 Trombograma.........................................................................................39 4.3.1 Contagem de Plaquetas...........................................................39 4.3.2 VPM..........................................................................................42 4.3.3 PDW.........................................................................................43

xi 5. CONCLUSES...................................................................................................45 6. REFERNCIAS..................................................................................................46 Apndices...............................................................................................................51

xii LISTA DE FIGURAS

1. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para contagem global de hemcias em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.........................................................................................................19 2. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para concentrao de hemoglobina em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.........................................................................................................20 3. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para hemoglobina livre em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006....................................................................................................................21 4. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para hematcrito em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006...................................................................................................................22 5. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para VCM em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006...................................................................................................................23 6. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para HCM em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a

xiii 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006...................................................................................................................24 7. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para CHCM em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006...................................................................................................................25 8. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para contagem de reticulcitos em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.........................................................................................................26 9. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para contagem global de leuccitos em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.........................................................................................................28 10. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para basfilos em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006..................................................................................................................30 11. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para eosinfilos em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006..................................................................................................................31 12. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para neutrfilos bastonetes em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo

xiv a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006........................................................................................................32 13. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para neutrfilos segmentados em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006........................................................................................................33 14. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para linfcitos em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006..................................................................................................................34 15. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para moncitos em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006..................................................................................................................35 16. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para leuccitos degenerados em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006........................................................................................................36 17. Leuccitos degenerados...................................................................................38 18. Leuccitos degenerados...................................................................................38 19. Leuccito em picnose.......................................................................................38 20. Leuccito em picnose.......................................................................................38 21. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para contagem de plaquetas em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes

xv momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006........................................................................................................39 22. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para contagem de plaquetas em ces do grupo G1 (seringa a 4C) e G2 (tubo a vcuo a 4C) na avaliao das amostras aps cinco e trinta minutos de retiradas da refrigerao, nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006..................................................................................................................41 23. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para VPM em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006..................................................................................................................42 24. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para PDW em ces do grupo G1(seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006..................................................................................................................44

xvi LISTA DE APNDICES

1. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem global de hemcias dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006....................52 2. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para concentrao de hemoglobina dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.......52 3. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para hemoglobina livre dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.........................52 4. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para hematcrito dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.....................................................53 5. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para VCM dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.....................................................53 6. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para HCM dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.....................................................53 7. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para CHCM dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4

xvii (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.....................................................54 8. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de reticulcitos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.......54 9. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem global de leuccitos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006....................54 10. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para basfilos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.....................................................55 11. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para eosinfilos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006......................55 12. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para neutrfilos bastonetes dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.....55 13. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para neutrfilos segmentados dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.....56 14. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para linfcitos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006............................................56

xviii 15. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para moncitos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006............................................56 16. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para leuccitos degenerados dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.....57 17. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de plaquetas dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.................57 18. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de plaquetas dos ces do grupo G1 (seringa a 4C) e G2 (tubo a vcuo a 4C) na avaliao das amostras aps cinco e trinta minutos de retiradas da refrigerao nos diferentes momentos (horas) de conservao, Jaboticabal (SP), 2006........................................................................................................57 19. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para VPM dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006...................................................58 20. Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para PDW dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006...................................................58 21. Valores hematolgicos de referncia para ces normais.................................59

xix INFLUNCIA DO TEMPO, TEMPERATURA E RECIPIENTE DE ESTOCAGEM NAS CARACTERSTICAS DO HEMOGRAMA DE CES ADULTOS HGIDOS

RESUMO Os exames laboratoriais so reconhecidos como importantes meios de auxlio diagnstico na prtica mdico-veterinria, especialmente no esclarecimento de diversas enfermidades que acometem animais de companhia, particularmente ces. Dentre tais exames, o hemograma o mais solicitado na rotina laboratorial, devido a sua praticidade, baixo custo e utilidade na prtica clnica. Diante da importncia e da grande demanda pelo supracitado exame na rotina da clnica de pequenos animais, da falta de estudos com relao viabilidade dos constituintes celulares e moleculares do sangue e da necessidade da estocagem do sangue perifrico, em diversas situaes, planejou-se o presente ensaio com o escopo de se verificar a estabilidade dos parmetros do hemograma frente a diferentes temperaturas e tempos de estocagem. Para tanto, foram analisadas amostras de sangue perifrico de 20 ces sadios, as quais foram submetidas s contagens globais de hemcias, leuccitos e plaquetas, assim como determinao do volume globular, concentrao de hemoglobina, hemoglobina livre, volume corpuscular mdio, hemoglobina corpuscular mdia, concentrao de

hemoglobina corpuscular mdia, volume plaquetrio mdio, PDW (platelet distribution width), contagem diferencial de leuccitos em esfregaos sanguneos e contagem de reticulcitos. Desta forma, as amostras de sangue foram estocadas em diferentes materiais (seringa e tubo a vcuo), submetidas a duas temperaturas (4 e 25 e analisadas em diferentes perodos (logo aps a colheita, 3 horas, 6 C C)

xx horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas e 96 horas). Dentre os resultados obtidos foi possvel verificar que a contagem de hemcias, leuccitos e basfilos e concentrao de hemoglobina foram estveis durante todo o protocolo experimental e os demais parmetros avaliados no presente estudo mostraram-se estveis at 12 horas temperatura ambiente e at 96 horas a 4 na seringa e C, no tubo a vcuo. A refrigerao retarda ou evita as alteraes nos parmetros do hemograma durante a estocagem de sangue perifrico de ces.

Palavras-chave: Hemograma, sangue perifrico, estocagem, temperaturas, co.

xxi INFLUENCE OF TIME, TEMPERATURE AND STORAGE RECIPIENT ON CHARACTERISTICS OF COMPLETE BLOOD COUNT OF HEALTHY ADULT DOGS

SUMMARY Laboratorial exams are recognized as important means of diagnosis in veterinary practice, especially in the explanation of several diseases that attack companion animals, particularly dogs. Among all exams, complete blood count (CBC) is the most requested analysis in routine practice, due to its practicability, low cost and usefulness in clinical practice. Taking into account the importance and great demand of this exam in the routine of small animal clinics, the lack of studies concerning the viability of cellular and molecular components of blood and the need of peripheral blood storage in several situations, the aim of the present study was to verify the stability of the CBC parameters in different temperatures and storage periods. For this purpose, peripheral blood samples of 20 healthy dogs were analyzed for RBC (red blood count), WBC (white blood count), platelets and as well as for determination of the packed cell volume, hemoglobin concentration, free hemoglobin and calculation of MCV (mean corpuscular volume), MCH (mean corpuscular hemoglobin) and MCHC (mean corpuscular hemoglobin

concentration), PDW (platelet distribution width), differential leukocyte count in blood smears and reticulocyte count. Thus, blood samples were stocked in different materials (syringe or vacuum tube), submitted to two temperatures (4 C and 25 and analyzed in different periods (right after collection, 3 hours, 6 hours, C) 12 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours, 72 hours and 96 hours after collection).

xxii The results allowed us to verify the RBC, WBC, basophils and hemoglobin concentration were stable during the whole study and the other parameters were stable up to 12 hours at room temperature and up to 96 hours at 4C, in the syringe and vacuum tube. Refrigeration of specimens slows down, or avoids the parameters changes during the storage.

Key-words: Complete blood count, peripheral blood, storage, temperatures, dog.

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1. INTRODUO E REVISO DE LITERATURA O hemograma um procedimento laboratorial amplamente utilizado na medicina veterinria (FURLANELLO et al., 2006), porm, a estabilidade dos constituintes hematolgicos pouco documentada (MDAILLE et al., 2006). Em muitos casos, corre-se o risco de obteno de resultados no confiveis, uma vez que as amostras colhidas na rotina clnica de pequenos animais, na maioria das vezes, tm que ser enviadas aos laboratrios e o tempo at a anlise pode ser longo, principalmente quando as amostras so colhidas no final da semana para serem analisadas na segunda-feira. O co hoje o principal animal de companhia no Brasil, a espcie mais atendida nas clnicas do pas e, conseqentemente, a maior parte dos exames hematolgicos enviados aos laboratrios so da espcie canina. Entretanto, existem poucos estudos sobre estocagem de sangue perifrico de ces e, todos os estudos foram realizados fora do Brasil, em pases de clima temperado, onde a temperatura ambiente inferior quela verificada na maior parte do territrio brasileiro. Alm disso, nos referidos estudos utilizaram-se poucos animais (no mximo 10) e, geralmente, no foram avaliados todos os parmetros do hemograma. Assim, o objetivo principal deste projeto consistiu na colheita de sangue perifrico de 20 ces adultos hgidos, sua posterior estocagem e posterior avaliao em diferentes momentos, a fim de contribuir para uma melhor compreenso da estabilidade dos constituintes do hemograma, sob diferentes temperaturas e tempos de estocagem.

24 1.1 Importncia Clnica do Hemograma O hemograma o exame de sangue mais solicitado na rotina laboratorial, devido a sua praticidade, baixo custo e utilidade na prtica clnica e compreende fundamentalmente, eritrograma, leucograma e trombograma (KERR, 2003). Tal exame fornece uma viso instantnea do sistema hematopotico em um momento especfico e oferece uma viso geral sobre o estado do paciente, uma vez que o sangue perifrico serve como meio de transporte muito eficiente para toda economia orgnica (REBAR et al., 2003). O hemograma solicitado em diversas circunstncias, dentre as quais para avaliar a sade do animal, auxiliar na determinao do diagnstico, verificar a habilidade de suporte do organismo s infeces e avaliar o progresso de certas doenas. 1.1.1 Eritrograma O eritrograma compreende a contagem global de eritrcitos, a concentrao de hemoglobina, o hematcrito ou volume globular e os ndices eritrocitrios que, por sua vez, englobam o volume corpuscular mdio (VCM), a hemoglobina corpuscular mdia (HCM) e a concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (CHCM). Inclui-se tambm no eritrograma a reticulocitometria. (MEYER et al., 1995; REBAR et al., 2003, KERR, 2003).

1.1.1.1 Contagem Global de Eritrcitos, Concentrao de Hemoglobina e Hematcrito A contagem contagem global de eritrcitos, taxa de hemoglobina e hematcrito so medidas da massa de clulas vermelhas ou capacidade de carrear oxignio do sangue (REBAR, 1998) Os parmetros supracitados so responsveis pela determinao de anemia e policitemia, j que anemia definida como presena de eritrcitos, concentrao de hemoglobina e/ou hematcrito abaixo dos valores de referncia e policitemia ou eritrocitose quando os mesmos parmetros encontram-se acima

25 dos valores de referncia (JAIN, 1993; FELDMAN et al., 2000; FIGHERA, 2001; KERR, 2003). A anemia pode ser classificada como relativa ou absoluta. A anemia relativa pode se desenvolver pela expanso do volume plasmtico, como em fmeas gestantes e neonatos ou aps fluidoterapia. A anemia absoluta clinicamente importante e merece ampla investigao (JAIN, 1993); a forma mais comum de anemia e pode ser classificada de acordo com a morfologia dos eritrcitos, mecanismos patognicos e resposta eritride da medula ssea (JAIN, 1993; MEYER et al., 1995; FIGHERA, 2001). A policitemia pode ser relativa ou absoluta. A policitemia relativa a forma mais comumente observada em ces e ocorre como resultado da reduo do volume plasmtico em decorrncia da desidratao ou por aumento transitrio da massa de clulas vermelhas secundrio a contrao esplnica (JAIN, 1993; REBAR, 1998; FELDMAN, 2000; THRALL et al., 2004). A contrao esplnica pode ocorrer aps exerccio ou por resposta a epinefrina liberada em animais excitados, com medo ou dor (THRALL et al., 2004). A policitemia absoluta uma elevao no nmero de eritrcitos circulantes decorrente de um aumento na produo destas clulas, porm, neste caso, o volume plasmtico se apresenta normal e pode ser ainda classificada como primria quando ocorre uma desordem mieloproliferativa, caracterizada por uma proliferao exacerbada de clulas eritrides, e secundria quando ocorre um aumento da taxa de eritropoetina (JAIN, 1993; FELDMAN, 2000). Os valores da contagem de eritrcitos e concentrao de hemoglobina geralmente variam com o hematcrito e, sendo o hematcrito mais facilmente obtido laboratorialmente, este deve ser a escolha clnica (MEYER et al., 1995; FELDMAN et al., 2000). Os valores da contagem de eritrcitos, concentrao de hemoglobina e hematcrito em ces adultos esto situados entre 5.5 e 8.5 x106/L, 12 e 18 g/dL e 37 e 55 %, respectivamente (FELDMAN et al., 2000).

26 1.1.1.2 Hemoglobina Livre Em amostras de sangue estocadas por longos perodos geralmente desenvolve-se o fenmeno hemoltico com conseqente diminuio de hematcrito e liberao de hemoglobina para o plasma. A liberao de hemoglobina progressiva e foi relatada por BAILEY & BOVE (1975), FAGLIOLO et al (1986), LATHAM et al. (1982), TANAKA et al. (1988), ELLIOT et al. (2003) e WIDMAN (1985). 1.1.1.3 ndices Eritrocticos Absolutos O VCM e o CHCM so os ndices eritrocitrios mais utilizados clinicamente e possibilitam a classificao morfolgica das anemias, levando-se em considerao o tamanho e a saturao de hemoglobina das hemcias. Esta classificao no especfica para a etiologia da anemia, mas muito til quanto ao mecanismo fisiopatolgico, o que auxilia na seleo do protocolo de tratamento (MEYER et al., 1995). O VCM traduzido como sendo o volume corpuscular mdio de uma hemcia e obtido por simples relao matemtica entre o hematcrito e a contagem de hemcias (DUNCAN et al., 1994; KERR, 2003). Este ndice permite a classificao das anemias em macrocticas, quando o VCM estiver acima dos valores normais; normoctica, quando o VCM se apresentar dentro dos valores fisiolgicos e microctica, quando estiver abaixo dos valores considerados normais para a espcie (MEYER et al., 1995). Os valores normais variam bastante entre as espcies e so independentes do tamanho do animal, contudo, animais jovens tendem a ter hemcias maiores em relao aos animais adultos (JAIN, 1993; FELDMAN et al., 2000; KERR, 2003). Em ces adultos, os valores normais so de 60 a 77 fL (FELDMAN et al., 2000). O CHCM definido como o grau de saturao de hemoglobina em uma hemcia e obtido por simples relao matemtica entre hemoglobina e hematcrito (DUNCAN et al., 1994; KERR, 2003). O ndice em questo permite a classificao das anemias em normocrmicas, quando o valor do CHCM estiver dentro da faixa de referncia e hipocrmicas quando estiver abaixo do valor de

27 referncia. O valor normal independe da espcie ou do tamanho das hemcias (KERR, 2003) e um aumento verdadeiro no CHCM no ocorre em condies normais, uma vez que os eritrcitos so saturveis com hemoglobina em um determinado patamar (DUNCAN et al., 1994; MEYER et al., 1995; KERR, 2003), entretanto, valores acima do fisiolgico podem ser obtidos se a amostra de sangue estiver hemolisada (DUNCAN et al., 1994; KERR, 2003), ocorrer diminuio no tamanho das hemcias por presso osmtica excessiva quando a quantidade de EDTA na amostra maior que a recomendada e se houver algum erro laboratorial na determinao do hematcrito ou na mensurao da hemoglobina (KERR, 2003). O valor normal de CHCM para os ces est compreendido entre 32 e 36 % (FELDMAN et al., 2000). O HCM um parmetro que varia com o tamanho das hemcias e com a espcie e no , portanto, freqentemente utilizado em medicina veterinria. O valor normal para ces est situado entre 19,5 e 24,5 pg (JAIN, 1993). 1.1.1.4 Reticulcitos Os reticulcitos so clulas vermelhas imaturas, com citoplasma repleto de organelas, como mitocndrias, ribossomos e complexo de golgi que lhes confere uma colorao azulada sob a ao de corantes rotineiramente utilizados, sendo chamados de policromatfilos e a presena destas clulas referida como policromasia ou policromatofilia. Para a contagem dos reticulcitos necessria a utilizao de corantes supravitais, como o novo azul de metileno ou azul brilhante de cresil, que precipitam as organelas e a clula se mostra com cordes ou pontos basoflicos (FELDMAN et al., 2000; FIGHERA, 2001). Existem dois tipos de reticulcitos, agregados e pontilhados. Os agregados so clulas grandes, com as organelas fortemente agrupadas e os pontilhados so clulas mais maduras que apresentam pontos e grnulos de RNA residual. Estas clulas so freqentemente maiores que as clulas vermelhas maduras, sendo responsveis por macrocitose e anisocitose verificadas ao exame do esfregao sangneo (FELDMAN et al., 2000). Da mesma forma que os humanos, os ces respondem vigorosamente com reticulocitose de agregados em anemias

28 regenerativas. Os reticulcitos pontilhados tambm so observados em ces, mas o nmero muito pequeno para requerer contagem separada de agregados e pontilhados (FELDMAN et al., 2000). Os reticulcitos so liberados da medula ssea sob ao da eritropoetina em resposta hipoxia tecidual e, durante intensa eritropoese, so prematuramente liberados na circulao (FELDMAN et al., 2000). Reticulocitose e policromasia so indicadores de intensa eritropoese e sua presena ou ausncia permite a classificao das anemias em regenerativas ou arregenerativas, de acordo com a resposta medular. Tal qual o homem, o co responde fortemente com reticulocitose de agregados em anemias regenerativas, j os reticulcitos pontilhados so observados em pequeno nmero em ces. A contagem de reticulcitos acima de 1 % ou 60.000/L indicativa de anemia regenerativa (FELDMAN et al., 2000). 1.1.2 Leucograma O leucograma a parte do hemograma que pesquisa alteraes quantitativas e/ou morfolgicas da srie leucocitria e compreende as contagens total e diferencial dos leuccitos (REBAR et al., 2003). O leucograma normalmente realizado para detectar e monitorar processos inflamatrios (MEYER et al., 1995).

1.1.2.1 Contagem Global de Leuccitos O termo leuccito inclui todas as clulas brancas e seus precursores. Estas clulas utilizam a corrente sangnea como meio de transporte a partir da medula ssea at os tecidos, seu destino final. A quantidade de leuccitos circulantes, portanto, reflete o equilbrio entre sua produo e consumo. A contagem global de leuccitos engloba todas as variedades leucocitrias, que podem ser agrupadas em granulcitos, que incluem os neutrfilos, eosinfilos e basfilos e agranulcitos, que incluem os linfcitos e moncitos (KERR, 2003).

29 Do ponto de vista funcional, os leuccitos circulantes pertencem a dois sistemas de defesa, sistema fagoctico e sistema imunoctico. O sistema fagoctico constitudo por granulcitos e moncitos/macrfagos e o sistema imunoctico engloba linfcitos T e B circulantes. Os fagcitos so a primeira linha de defesa contra microorganismos. Tais clulas so atradas para os stios de infeco e por um processo de fagocitose, englobam e destroem a bactria ou outro agente invasor. O sistema imunoctico o sistema imune especfico e suas clulas efetoras so responsveis pela consecuo da imunidade humoral, na forma de anticorpos produzidos contra agentes especficos, e imunidade mediada por clulas, atravs da produo de citocinas especficas (REBAR, 1998). Os valores normais da contagem global de leuccitos para ces situam-se entre 6.000 e 17.000/L (FELDMAN et al., 2000). 1.1.2.2 Contagem Diferencial de Leuccitos 1.1.2.2.1 Basfilos Os basfilos so clulas pouco estudadas pois so raras na medula ssea e no sangue circulante (JAIN, 1993). As referidas clulas so produzidas na medula ssea e compartilham a mesma clula progenitora dos mastcitos tissulares. Os basfilos no se diferenciam em mastcitos, mas ambas as clulas desempenham funes similares e possuem histamina, que desempenha papel fundamental nas reaes de hipersensibilidade imediata, heparina, que tem efeito anticoagulante importante no processo inflamatrio e algumas espcies de serotonina em seus grnulos. Alm disso, os basfilos ativos so capazes de sintetizar diversas citocinas que iniciam ou modulam a resposta inflamatria (REBAR et al., 2003). A basofilia e a eosinofilia algumas vezes ocorrem simultaneamente, devido interao destas clulas (JAIN, 1993). 1.1.2.2.2 Eosinfilos Os eosinfilos so produzidos na medula ssea, cujos progenitores so estimulados pela Interleucina-5, que produzida por linfcitos T sensibilizados. Os

30 eosinfilos so reconhecveis no estgio de mielcitos, pelo aparecimento de granulao eosinoflica caracterstica (REBAR et al., 2003). Os eosinfilos tm participao na regulao da resposta alrgica e resposta inflamatria, atravs da modulao da atividade dos mastcitos, de suas propriedades anti-histamnicas e anti-inflamatrias e da ao de substncias de seus grnulos, como a serotonina e a bradicinina que inibem a induo de edema (JAIN, 1993). Alm disso, tais clulas tm capacidade de fagocitar partculas estranhas, includo bactrias, sofrendo degranulao e atuam no controle de infeces parasitrias atravs de sua ao parasiticida que ocorre por intermdio da interao com mastcitos e linfcitos (JAIN, 1993; REBAR, 1998). Os valores normais de eosinfilos em ces adultos so de 100 a 1.250/L (FELDMAN et al., 2000). 1.1.2.2.3 Neutrfilos Os neutrfilos so produzidos na medula ssea e liberados para a corrente sangnea, na qual circulam por aproximadamente 10 horas e migram para os tecidos de forma aleatria e unidirecional. Leso ou invaso dos tecidos por bactrias resultam na produo e liberao de fatores estimuladores de colnia que so responsveis pela proliferao e maturao dos neutrfilos na medula ssea (REBAR et al., 2003). Os neutrfilos so os granulcitos circulantes predominantes e, apesar de sua funo primria ser a fagocitose de microorganismos, sabido que estas clulas tambm exercem funo secretria, atravs da liberao de molculas biologicamente ativas para o microambiente, participando da resposta inflamatria sistmica (REBAR, 1998; THRALL et al., 2004). O aumento (neutrofilia) e diminuio (neutropenia) no nmero de neutrfilos so clinicamente significantes, particularmente em doenas inflamatrias (REBAR, 1998). Em condies normais, os neutrfilos bastonetes que so as clulas imaturas, so raramente observados. O aumento na liberao de neutrfilos imaturos para a circulao clinicamente relevante e ocorre quando aumenta a demanda funcional de neutrfilos para os tecidos ou em casos de leucemias

31 mielgenas ou mielomonocticas agudas ou crnicas (REBAR, 1998; THRALL et al., 2004). A presena de neutrfilos imaturos no sangue acima do nmero normal constitui um desvio esquerda e a extenso deste desvio indica a severidade da doena, entretanto, a magnitude da contagem de clulas reflete a habilidade da medula ssea para suprir a demanda (BAKER, 2004). As contagens normais de neutrfilos segmentados e bastonetes em ces esto situadas entre 3.000 e 11.500/L e 0 e 300/L, respectivamente (FELDMAN et al., 2000). 1.1.2.2.4 Linfcitos Os linfcitos do sangue perifrico originam-se tanto da medula ssea quanto do timo e, diferentemente dos granulcitos e moncitos, que se movem unidirecionalmente da medula ssea para o sangue e tecido, os linfcitos recirculam. O padro de trfego dos linfcitos do sangue para os linfonodos, linfa e novamente para o sangue (REBAR et al., 2003). Os linfcitos so agrupados em duas subpopulaes; sejam linfcitos B, que so responsveis pela imunidade humoral e linfcitos T, que so responsveis pela imunidade mediada por clulas. As subpopulaes linfocitrias no podem ser distinguidas atravs da avaliao morfolgica em microscopia ptica de luz (THRALL et al., 2004). Desta forma, o aumento no nmero de linfcitos circulantes (linfocitose) pode ocorrer por estimulao antignica, no hipoadrenocorticismo e tambm em linfossarcomas e leucemias linfocticas, sendo, nestes dois ltimos casos, eventos tardios. Por sua vez, a diminuio no nmero de linfcitos (linfopenia) ocorre pela presena de nveis elevados de glicocorticides na circulao, interrupo da circulao linftica, como ocorre em efuses quilosas, diminuio da linfopoese, em linfossarcomas como resultado da incapacidade dos linfcitos de migrarem do tecido linfide comprometido e na fase aguda de infees virais (FELDMAN, et al., 2000; REBAR et al., 2003). Os valores de linfcitos para ces normais esto compreendidos entre 1.000 e 4.800/L (FELDMAN et al., 2000).

32 1.1.2.2.5 Moncitos Os moncitos originam-se na medula ssea, so liberados na circulao perifrica e migram para os tecidos onde continuam a se desenvolver e se diferenciam em macrfagos (REBAR et al., 2003; THRALL et al., 2004). A contnua transformao de moncitos em macrfagos representa a segunda maior linha de defesa do sistema de fagcitos e a funo destas clulas, alm da fagocitose de microorganismos, a regulao da resposta inflamatria atravs da liberao de mediadores inflamatrios, processamento de antgenos para apresentao aos linfcitos, produo de citocinas e fatores estimuladores de colnia requeridos na hematopoese, reparao tecidual e participao na regulao dos estoques de ferro do organismo (FELDMAN et al., 2000; REBAR et al., 2003). O valor de referncia destas clulas para ces situa-se entre 150 a 1.350/L (FELDMAN et al., 2000).

1.1.3 Trombograma 1.1.3.1 Contagem de Plaquetas As plaquetas so produzidas na medula ssea, atravs da fragmentao do citoplasma dos megacaricitos (JAIN, 1993; FELDMAN et al., 2000). A funo primria destas clulas a manuteno da hemostasia, desta forma, as plaquetas so a primeira linha de defesa quando os vasos sangneos so danificados e atuam atravs da aderncia ao subendotlio, agregao, recrutamento de plaquetas adicionais para a rea, facilitando a formao local de trombina e fibrina em um microambiente que assegura a rpida formao do trombo. Alm disso, as plaquetas desempenham uma funo importante na inflamao atravs da liberao de mediadores solveis que modulam a atividade de clulas sangneas e do endotlio vascular (FELDMAN et al., 2000). Mais de 90% dos sangramentos em ces resultam de anormalidades no nmero ou funo das plaquetas, portanto, a importncia clnica destas clulas no deve ser subestimada (REBAR, 1998).

33 As desordens plaquetrias so classificadas em quantitativas ou

qualitativas. As desordens quantitativas incluem a trombocitopenia, que a diminuio no nmero de plaquetas e se trata da anormalidade plaquetria mais comumente encontrada, sendo provavelmente a causa mais comum de ditese hemorrgica em humanos e ces e a trombocitose, que o aumento do nmero de plaquetas e ocorre com menor freqncia (JAIN, 1993). A trombocitopenia pode ocorrer como resultado da diminuio da produo das plaquetas por agentes infecciosos como a Ehrlichia canis, drogas como quimioterpicos, antibiticos e agentes anti-fngicos, processos neoplsicos ou desordens imunomediadas; aumento no consumo das plaquetas, que est associado coagulao intravascular disseminada, hemangiossarcomas, vasculites e outras injrias vasculares e aumento na destruio das plaquetas que resultante do aumento da fagocitose de plaquetas pelo sistema moncitomacrofgico ou mecanismos imunomediados, tendo como causa principal a trombocitopenia imunomediada (THRALL et al., 2004). Os valores normais da contagem de plaquetas para ces esto compreendidos entre 200.000 e 500.000/L (FELDMAN et al., 2000). 1.1.3.2 Volume Plaquetrio Mdio (VPM) O volume plaquetrio mdio o tamanho mdio estimado das plaquetas e inversamente proporcional ao nmero de plaquetas (FELDMAN et al., 2000). O aumento do VPM sugestivo de resposta trombopotica e ocorre como conseqncia da destruio plaquetria em algumas doenas mieloproliferativas e no hipertireoidismo. J falsos aumentos do VPM esto associados exposio ao EDTA, quando as plaquetas so mantidas em ambiente frio ou refrigeradas. A diminuio do VPM pode estar relacionada a trombocitopenia imunomediada na fase inicial e deficincia de trombopoese medular (JAIN, 1993; FELDMAN et al., 2000; REBAR et al., 2003). O valor normal em ces esta compreendido entre 6,1 e 10 fL (REBAR et al., 2003).

34 1.1.3.3 PDW - Platelet Distribution Width (amplitude de distribuio plaquetria com base no tamanho) O PDW um valor dado por alguns contadores automticos e representa a distribuio populacional das plaquetas com base no seu tamanho, ou seja, um ndice de variao no tamanho das plaquetas e pode ser til em laboratrios que no realizam rotineiramente a avaliao das plaquetas no esfregao sangneo (FELDMAN et al., 2000). 1.2 Avaliao da Influncia do Perodo de Estocagem nos Parmetros do Eritrograma FURLANELLO et al. (2006) realizaram estocagem de sangue total de cinco ces hgidos durante 48 horas e observaram que as alteraes no hematcrito, VCM e CHCM foram maiores temperatura ambiente que a 4C em todos os momentos analisados. PASTOR et al. (1997) avaliaram as alteraes nos parmetros do hemograma do sangue de 10 ces aps 72 horas de estocagem temperatura ambiente e 4C e observaram que a contagem global de hemcias e a taxa de hemoglobina se mantiveram estveis durante 72 horas. Os valores do hematcrito tenderam a aumentar com diferenas estatisticamente significativas observadas com 24 horas nas amostras estocadas temperatura ambiente. J, MDAILLE et al. (2006) submeteram as amostras de sangue total de ces estocagem por 48 horas temperatura ambiente e relataram diminuio significativa na contagem global de hemcias aps 24 e 48 horas de estocagem e, alm disso, que a taxa de hemoglobina se manteve estvel durante todo o estudo. FURLANELLO et al. (2006), observaram um pequeno aumento nos valores de hemoglobina e aumento significativo no hematcrito aps 12 horas de estocagem temperatura ambiente e 4C e que os referidos parmetros continuaram a aumentar at 48 horas.

35 O VCM aumentou com o tempo (PASTOR et. al., 1997; FURLANELLO et al., 2006; MDAILLE et al., 2006). PASTOR et al. (1997) observaram diferenas significativas aps 12 horas nas amostras estocadas temperatura ambiente e aps 24 horas nas amostras estocadas a 4C. De acordo com FURLANELLO et al. (2006), ocorreu aumento significativo a partir de 12 horas, tanto nas amostras estocadas a 4C, quanto nas estocadas temperatura ambiente. MDAILEE et al. (2006) relataram que, apesar do aumento constante do VCM durante as 48 horas de estocagem, apenas poucas amostras ultrapassaram os valores normais para a espcie canina. Os valores de HCM se mantiveram estveis durante o estudo (PASTOR et al., 1997). O CHCM diminuiu significativamente entre 12 e 24 horas e continuou a diminuir at 48 horas de estocagem, tanto temperatura ambiente quanto a 4C, contudo, a diminuio foi maior nas amostras temperatura ambiente que nas amostras refrigeradas (FURLANELLO et al., 2006). H recomendaes para que a contagem de reticulcitos seja realizada at seis horas aps a colheita do sangue nas amostras conservadas temperatura ambiente e at 72 horas nas amostras a 4C (National Committee for Clinical Laboratory Standards) BUTTARELLO (2004). 1.3 Avaliao da Influncia do Perodo de Estocagem nos Parmetros do Leucograma Segundo PASTOR et al., (1997) a contagem global de leuccitos aumentou significativamente aps 24 horas nas amostras estocadas temperatura ambiente e diminuiu significativamente a partir de 72 horas, nas amostras refrigeradas, porm as diferenas no foram clinicamente relevantes. J de acordo com FURLANELLO et al. (2006), ocorreu diminuio significativa na contagem de leuccitos aps 48 horas de estocagem nas amostras temperatura ambiente. Segundo MDAILLE et al. (2006), a mdia da contagem de leuccitos aumentou com 24 horas de estocagem, sem diferenas estatisticamente significativas, porm, as diferenas nas contagens de leuccitos variaram com a amostra,

36 independente do valor inicial. Green et al. (1976) observaram aumento significativo na contagem de leuccitos aps 72 horas de estocagem a 4C de sangue de ces. WOOD et al. (1999) realizaram estocagem de sangue humano por 48 horas e no observaram diferena significativa na contagem de leuccitos pelo mtodo da impedncia e relataram diminuio na contagem pelo mtodo ptico das amostras conservadas temperatura ambiente. GULATI et al. (2002) avaliaram as alteraes nas contagens global e diferencial de leuccitos durante a estocagem de sangue humano temperatura ambiente por sete dias e observaram alteraes na contagem diferencial de leuccitos durante as primeiras 24 horas, como aumento progressivo de neutrfilos, linfcitos e eosinfilos e diminuio numrica dos moncitos. J, WOOD et al. (1999) realizaram a contagem diferencial de leuccitos aps estocagem de sangue humano por 24 horas e observaram aumento no nmero de neutrfilos nas amostras estocadas a 4C. Nas amostras conservadas temperatura ambiente ocorreu diminuio no nmero de neutrfilos, moncitos e eosinfilos e aumento dos linfcitos. Os autores supracitados observaram ainda aumento no nmero de basfilos nas duas temperaturas de estocagem. De acordo com HOUWEN (2000), a preparao do esfregao sangneo para a contagem diferencial de leuccitos deve ser feita at 2 horas aps a colheita da amostra, apesar dos resultados serem aceitveis at 8 horas aps a colheita em amostras conservadas a 4C. 1.4 Avaliao da Influncia do Perodo de Estocagem nos Parmetros do Trombograma Os estudos realizados com ces divergem com relao ao momento em que as amostras devem ser processadas aps serem retiradas da refrigerao, para avaliao das plaquetas. Alguns autores realizaram a avaliao logo aps ou cinco minutos aps a retirada das amostras da temperatura de refrigerao, portanto, com as amostras refrigeradas (PASTOR et al., 1997; MDAILLE et al.,

37 2006) e outros avaliaram 30 minutos aps a retirada da refrigerao para permitir que as amostras retornassem temperatura ambiente antes da anlise (FURLANELLO et al., 2006). Os autores supracitados obtiveram resultados conflitantes na avaliao da contagem de plaquetas aps a estocagem a 4C. PASTOR et al. (1997) observaram que os valores de plaquetas diminuram com o tempo, sendo que, nas amostras refrigeradas, as diferenas foram significativas seis horas aps a colheita e nas amostras estocadas temperatura ambiente no houveram diferenas significativas, contudo, foi observada uma diminuio progressiva na contagem de plaquetas nesta temperatura de estocagem (a contagem de plaquetas s 6 horas 89% do valor inicial). Segundo MEDILLE et al. (2006), ocorreu diminuio significativa na contagem de plaquetas aps estocagem temperatura ambiente por 24 horas. J FURLANELLO et al. (2006) relataram que a contagem de plaquetas diminuiu significativamente aps 36 horas de estocagem temperatura ambiente e se manteve constante nas amostras refrigeradas. A maior parte dos estudos com sangue humano prenderam-se avaliao das amostras aps 15 a 30 minutos de retiradas da refrigerao (BRITTIN et al., 1969; COHLE et al., 1981; WOOD et al., 1999) e no observaram alteraes na contagem de plaquetas aps estocagem temperatura ambiente e a 4C. Alm disso, alguns autores realizaram a comparao das amostras imediatamente aps serem retiradas da refrigerao e trinta minutos aps, a fim de permitir que retornassem temperatura ambiente e no observaram alteraes em nenhum parmetro do hemograma (WARNER et al., 1991; AL-ISMAIL et al., 1995). FURLANELLO et al. (2006) observaram aumento no VPM aps 12 horas de estocagem temperatura ambiente e aumento no PDW aps 48 horas de estocagem a 4C. Porm, de acordo com PASTOR et al. (1997), no ocorreram diferenas significativas nos valores de VPM durante a estocagem por 72 horas temperatura ambiente e 4C e foi observado aumento no PDW aps 24 horas de estocagem.

38 2. OBJETIVOS Tendo como base a fundamentao bibliogrfica precedente, concebeu-se o ensaio em questo com o escopo de avaliar a estabilidade dos parmetros do hemograma em amostras de sangue perifrico de ces sadios, submetidas a diferentes temperaturas, recipientes e perodos de estocagem. 3. MATERIAL E MTODOS 3.1 Animais Para o desenvolvimento do protocolo experimental foram utilizados 20 ces hgidos, adultos, de diversas raas, machos ou fmeas, com peso superior a 20 Kg, obtidos junto ao canil central do Hospital Veterinrio da Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias da Universidade Estadual Paulista, Cmpus de Jaboticabal e ao canil da Polcia Militar de Ribeiro Preto-SP. Os animais foram alojados em canis individuais onde receberam gua e alimentao ad libtum e o bom estado de sade foi verificado com base nos resultados do exame clnico detalhado, testes hematolgicos, bioqumicos sricos, coproparasitolgicos, urinlise de rotina, alm de testes sorolgicos para toxoplasmose, erliquiose e leptospirose. 3.2 Colheita das Amostras de Sangue Perifrico Antes da colheita, os animais foram encaminhados ao canil central do Hospital Veterinrio da FCAV-UNESP, Cmpus de Jaboticabal. Aps anti-sepsia local, as amostras de sangue foram colhidas por venipuno jugular, com auxlio de agulhas (25 x 8), seringas de 10 ml e tubos a vcuo de 3 mL contendo cido etilenodiaminotetractico dissdico (EDTA 1 mg/mL) como anticoagulante. As amostras foram distribudas em alquotas durante a colheita, sendo utilizadas 2 seringas e 17 tubos a vcuo, em um total de 71 mL por animal. Imediatamente aps a colheita, as amostras foram destinadas ao Laboratrio de Patologia Clnica Veterinria Prof. Dr. Joaquim Martins Ferreira Neto do Hospital Veterinrio Governador Laudo Natel da FCAV-UNESP, Cmpus de Jaboticabal e

39 submetidas a diferentes condies de temperatura e tempo de armazenamento, como explicitado a seguir. 3.3 Processamento das Amostras As amostras de sangue de cada animal foram distribudas em quatro diferentes grupos, G1 a G4, referentes aos diferentes recipientes e temperaturas de conservao, para a avaliao em nove momentos, M1 a M9, referentes aos perodos de conservao, de tal modo que os 20 animais participaram de todos os grupos e cada grupo foi avaliado nos diferentes momentos, segundo o que se segue: Grupos G1: Estocagem a 4C em seringa G2: Estocagem a 4C em tubo a vcuo G3: Estocagem a 25C em seringa G4: Estocagem a 25C em tubo a vcuo Momentos M1: Logo aps a colheita M2: 3 horas aps a colheita M3: 6 horas aps a colheita M4: 12 horas aps a colheita M5: 24 horas aps a colheita M6: 36 horas aps a colheita M7: 48 horas aps a colheita M8: 72 horas aps a colheita M9: 96 horas aps a colheita Na estocagem a 4C (grupos G1 e G2), a avaliao dos parmetros do eritrograma, leucograma e trombograma foi realizada trinta minutos aps a retirada das amostras da temperatura de refrigerao, a fim de permitir que as amostras retornassem temperatura ambiente antes da anlise. Na contagem de plaquetas foi realizada ainda sua determinao logo aps ou cinco minutos aps as amostras serem retiradas da refrigerao, para avaliao das mesmas ainda refrigeradas e posterior comparao com as amostras que retornaram a temperatura ambiente.

40 Em cada momento as amostras foram submetidas a anlises hematolgicas, incluindo contagens globais de hemcias, leuccitos e plaquetas, assim como determinao do volume globular, concentrao de hemoglobina, volume corpuscular mdio, hemoglobina corpuscular mdia, concentrao de hemoglobina corpuscular mdia, volume plaquetrio mdio e PDW com o auxlio do contador automtico de clulas KX-21N SYSMEX; contagem diferencial de leuccitos e contagem de leuccitos degenerados em esfregaos sanguneos corados com uma mistura de Metanol May-Grunwald Giemsa (MGG) e contagem de reticulcitos corados com Azul Brilhante de Cresil. Finalmente, as amostras foram centrifugadas durante cinco minutos para posterior determinao da taxa plasmtica de hemoglobina livre, em espectrofotmetro semi-automtico da marca Labtest, modelo Labquest. 3.4 Anlise Estatstica A anlise estatstica foi conduzida segundo o delineamento inteiramente casualizado, com parcelas subdivididas para anlise de varincia e a comparao das mdias pelo teste de Tukey, ao nvel de 5% de probabilidade. As variveis com coeficiente de variao acima de 25% foram transformadas pela expresso
Y + 0,5 (SNEDECOR & COCHRAN, 1987).

41

4. RESULTADOS E DISCUSSO 4.1 Eritrograma 4.1.1 Contagem Global de Hemcias Os valores mdios obtidos para contagem global de hemcias (x106/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 1.

Hemcias
7,50 7,00
(x10 /L)

6,50 6,00 5,50 5,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

G1 G2 G3 G4

Figura 1. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para contagem global de hemcias em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. A partir dos dados apresentados na figura 1 (apndice 1), verifica-se que no houve diferena significativa na contagem de hemcias entre os grupos, no decorrer de todo o protocolo experimental. Este dado corrobora achados de PASTOR et al. (1997) e WOOD et al. (1999), que relataram estabilidade das hemcias na estocagem de sangue perifrico de ces por 72 horas e de sangue

42

perifrico humano por 48 horas, respectivamente e discorda dos achados reportados por MDAILLE et al. (2006), que observaram diminuio na contagem de hemcias aps 24 horas de estocagem de sangue de animais da espcie canina temperatura ambiente. 4.1.2 Hemoglobina Os valores mdios obtidos para concentrao de hemoglobina (g/dL) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 2.

Hemoglobina
18,50 18,00 17,50 (g/dL) 17,00 16,50 16,00 15,50 15,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas) G1 G2 G3 G4

Figura 2. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para concentrao de hemoglobina em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. Os dados obtidos para concentrao de hemoglobina no mostraram diferenas estatisticamente significativas em nenhum dos grupos ao longo do perodo de estocagem, mostrando-se um parmetro estvel at 96 horas. Tal fato

43

foi citado por PASTOR et al. (1997) e MDAILLE et al. (2006), porm discorda dos achados de FURLANELLO et al. (2006), os quais relatam aumento significativo nos valores de hemoglobina aps 12 horas de estocagem temperatura ambiente e 4C. 4.1.3 Hemoglobina Livre Os valores mdios obtidos para hemoglobia livre (g/dL) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 3.

1,00 0,80
(g/dL)

Hemoglobina Livre
G1 G2 G3 G4

0,60 0,40 0,20 0,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

Figura 3. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para hemoglobina livre em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. A partir dos dados apresentados na figura 3 (apndice 3), verifica-se que a hemoglobina livre aumentou significativamente aps 48 horas de estoque nas amostras conservadas a 25C e, aps 24 horas, nas amostras estocadas a 4C, porm, o aumento foi maior nas amostras estocadas a 25C. No foram

44

observadas diferenas estatsticas entre a estocagem na seringa e no tubo a vcuo. Estes aumentos refletem hemlise com conseqente liberao de hemoglobina para o plasma, que ocorre em amostras estocadas por longos perodos temperatura ambiente e 4C, como descrito por BAILEY & BOVE (1975), FAGLIOLO et al. (1986), LATHAM et al. (1982), TANAKA et al. (1988), ELLIOT et al. (2003) e WIDMAN (1985). 4.1.4 Hematcrito Os valores mdios obtidos para hematcrito (%) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C), e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 4.

65,00 60,00
(%)

Hematcrito
G1 G2 G3 G4

55,00 50,00 45,00 40,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

Figura 4. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para hematcrito em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. A partir dos dados demonstrados na figura 4 (apndice 4), verifica-se que o valor do hematcrito das amostras conservadas a 25C aumentou significativamente a partir de 36 horas de estocagem quando conservadas na

45

seringa e 48 horas de estocagem no tubo a vcuo, fato no observado a 4C, a qual no foi observada qualquer diferena estatstica durante o perodo de estocagem. Estes dados corroboram PASTOR et al. (1997), em parte, visto que estes autores citam a estabilidade do hematcrito a 4C e a elevao dos seus valores temperatura ambiente aps 24 horas no tubo a vcuo. 4.1.5 VCM Os valores mdios obtidos para VCM (fL) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na tabela e figura de nmero 5.

100,00 90,00
(fL)

VCM
G1 G2 G3 G4

80,00 70,00 60,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

Figura 5. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para VCM em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. O VCM aumentou significativamente aps 12 horas nas amostras estocadas a 25C, tanto na seringa quanto no tubo a vcuo, da mesma forma que em trabalhos prvios de PASTOR et al. (1997) e FURLANELLO et al. (2006) em amostras de sangue estocadas por 72 e 48 horas, respectivamente. Nas amostras

46

estocadas a 4C, a elevao significativa ocorreu a partir de 36 horas nos tubos a vcuo e 96 horas nas seringas, concordando, em parte, com achados de PASTOR et al. (1997), que observaram aumento do VCM aps 24 horas de estocagem e FURLANELLO et al. (2006) que relataram aumento aps 12 horas, ambos no tubo a vcuo. 4.1.6 HCM Os valores mdios obtidos para HCM (pg) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 6.

26,00 25,50
(pg)

HCM
G1 G2 G3 G4

25,00 24,50 24,00 23,50 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

Figura 6. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para HCM em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. Como verificado na figura 6 (apndice 6), ocorreu aumento significativo no valor de HCM a partir de 12 horas de estoque nas amostras a 25C, na seringa e no vcuo, porm os valores diminuram a partir de 48 horas de estocagem e no houve diferena significativa durante a estocagem das amostras a 4C. Tais

47

resultados discordam dos achados de PASTOR et al. (1997), os quais verificaram estabilidade do HCM temperatura ambiente e 4C durante 72 horas de estocagem de sangue de co. 4.1.7 CHCM Os valores mdios obtidos para CHCM (%) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 7.

CHCM
35,00 30,00 G1 G2 G3 G4

(%)
25,00 20,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.

Figura 7. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para CHCM em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9)

Os dados apresentados na figura 7 (apndice 7) indicam que ocorreu diminuio significativa do CHCM nas amostras estocadas a 25C a partir de 12 e 24 horas, na seringa e no vcuo, respectivamente. Nas amostras conservadas a 4C, foi observada diminuio aps 36 horas de estocagem no tubo a vcuo e no houve diferena significativa durante estocagem na seringa. Estes dados

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corroboram, em parte, os achados de FURLANELLO et al. (2006), os quais observaram diminuio do CHCM aps 12 horas tanto temperatura ambiente quanto a 4C e relataram maior diminuio nas amostras temperatura ambiente, como observado no estudo em tela. 4.1.8 Reticulcitos Os valores mdios obtidos para contagem de reticulcitos (x106/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 8.

0,04 0,03
(x10 /L)

Reticulcitos
G1 G2 G3 G4

0,03 0,02 0,02 0,01 0,01 0,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

Figura 8. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para contagem de reticulcitos em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. Os dados apresentados na figura 8 (apndice 8) indicam que os valores de reticulcitos diminuram durante todo o perodo de estocagem. Contudo, houve diminuio estatisticamente significativa com 96 horas de conservao a 25C no tubo a vcuo e no ocorreu diferena significativa durante a estocagem das

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amostras a 25C na seringa e a 4C na seringa e no tubo a vcuo. Tais achados discordam dos relatos de BUTTARELLO (2004), que observou diminuio dos reticulcitos aps seis horas de estocagem temperatura ambiente e 72 horas a 4C no tubo a vcuo. Adicionalmente com relao ao eritrograma, verificou-se que os valores do hematcrito ultrapassaram os limites fisiolgicos reportados por FELDMAN et al. (2000) aps estocagem temperatura ambiente. J os resultados do VCM das amostras estocadas a 4C no ultrapassaram a faixa de normalidade considerada por FELDMAN et al. (2000) durante todo o protocolo experimental e, temperatura ambiente, os valores foram superiores aos valores de referncia citados por FELDMAN et al. (2000) a partir de 12 horas de estocagem, discordando dos achados de MDAILLE et al. (2006), os quais relataram que poucas amostras estocadas temperatura ambiente por 48 horas ultrapassaram os valores normais para a espcie canina. Para o CHCM os valores das amostras no tubo a vcuo a 4C s ultrapassaram os limites considerados fisiolgicos por FELDMAN et al. (2000) com 96 horas de estocagem. O aumento da hemoglobina livre indicou a ocorrncia do fenmeno hemoltico durante a estocagem, contudo, este no foi relevante a ponto de causar diminuio significativa na contagem de hemcias. Segundo MDAILLE et al. (2006), a elevao do VCM durante a estocagem se deve ao aumento do contedo de fluido no interior das hemcias, levando a reduo do volume plasmtico. O aumento do volume eritrocitrio e diminuio do volume plasmtico so as possveis causas do aumento do hematcrito verificado no presente estudo. A diminuio da CHCM ocorre provavelmente devido ao aumento do hematcrito, uma vez que o hematcrito utilizado no clculo deste ndice eritrocitrio e, segundo KERR (2003), os parmetros supracitados so inversamente proporcionais. De acordo com COWGILL et al. (2003), observa-se maturao in vitro dos reticulcitos durante a estocagem de sangue perifrico e, segundo THRALL et. al. (2004), a maturao dos reticulcitos envolve uma contnua e progressiva perda

50

das organelas. medida que os reticulcitos perdem suas organelas, a identificao destas clulas dificultada, uma vez que diminuem os pontos basoflicos formados no citoplasma atravs da precipitao das organelas aps utilizao de corantes supravitais, o que condiz com a diminuio das referidas clulas neste estudo. 4.2 Leucograma 4.2.1 Contagem Global de Leuccitos Os valores mdios obtidos para contagem global de leuccitos (x103/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 9.

11,00 9,00 7,00 5,00 0 3 6

Leuccitos
G1 G2 G3 G4

(x10 /L)

12

24

36

48

72

96

Momentos (horas) Figura 9. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para contagem global de leuccitos em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006.

51

Os dados obtidos para a contagem global de leuccitos no evidenciaram diferenas significativas nos diferentes grupos e momentos experimentais, corroborando os achados de WOOD et al. (1999) e GULATI et al. (2002), cujos dados mostraram estabilidade dos leuccitos por 48 horas em amostras de sangue humano. Entretanto, os dados obtidos discordam de vrios autores, dentre os quais, PASTOR et al. (1997) e GREEN et al. (1976), que observaram aumento significativo da contagem global de leuccitos aps estocagem temperatura ambiente e 4C, respectivamente, e FURLANELLO et al. (2006) e PASTOR et al. (1997), que relataram diminuio significativa dos leuccitos das amostras conservadas temperatura ambiente e refrigerao, respectivamente. 4.2.2 Basfilos Os valores mdios obtidos para basfilos (x103/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 10.

52

0,04 0,03 0,03

Basfilos
G1 G2 G3 G4

(x10 /L)

0,02

0,02

0,01

0,01 0,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas) Figura 10. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para basfilos em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. Os dados apresentados na figura 10 (apndice 10) indicam que, estatisticamente, no houve diferena significativa nos grupos, durante todo o protocolo experimental, o que no condiz com os resultados de WOOD et al. (1999), que observaram aumento no nmero de basfilos temperatura de refrigerao e ambiente aps estocagem de sangue perifrico humano por 24 horas. 4.2.3 Eosinfilos Os valores mdios obtidos para eosinfilos (x103/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 11.

53

1,00 0,80

Eosinfilos
G1 G2 G3 G4

(x10 /L)

0,60 0,40 0,20 0,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

Figura 11. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para eosinfilos em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. A partir dos dados apresentados na figura 11 (apndice 11), verifica-se que ocorreu diminuio significativa na contagem de eosinfilos a partir de 72 horas nas amostras estocadas no tubo a vcuo a 25C e de 96 horas na seringa a 25C e no houve diferena significativa durante a estocagem das amostras a 4C. O fato supracitado concorda com os achados de WOOD et al. (1999), os quais relataram diminuio numrica dos eosinfilos das amostras estocadas temperatura ambiente e discorda de GULATI et al. (2002) que observaram aumento no nmero dos eosinfilos temperatura ambiente. 4.2.4 Neutrfilos Bastonetes Os valores mdios obtidos para neutrfilos bastonetes (x103/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 12.

54

Neutrfilos Bastonetes
0,25 0,20

(x10 /L)

0,15 0,10 0,05 0,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

G1 G2 G3 G4

Figura 12. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para neutrfilos bastonetes em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. Como apresentado na figura 12 (apndice 12) ocorreu diminuio significativa no valor de neutrfilos bastonetes a partir de 3 horas nas amostras estocadas no tubo a vcuo, tanto a 4C quanto a 25C e no houve diferena significativa durante a estocagem na seringa, nas duas temperaturas de estocagem utilizadas no experimento em tela. 4.2.5 Neutrfilos Segmentados Os valores mdios obtidos para neutrfilos segmentados (x103/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 13.

55

7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0

Neutrfilos Segmentados
G1 G2 G3 G4

(x10 /L)

12

24

36

48

72

96

Momentos (horas) Figura 13. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para neutrfilos segmentados em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. Os dados apresentados na figura 13 (apndice 13) indicam que houve diminuio significativa na contagem de neutrfilos segmentados nas amostras estocadas a 25C a partir de 72 e 96 horas, no vcuo e seringa, respectivamente. No foi observada diferena significativa durante estocagem das amostras a 4C. Os resultados obtidos corroboram, em parte, achados de WOOD et al. (1999) que detectaram diminuio da contagem de neutrfilos aps 24 horas de estocagem de sangue humano temperatura ambiente, contudo, relataram aumento dos neutrfilos a 4C e discordam dos dados de GULATI et al. (2002) que observaram aumento dos neutrfilos aps 24 horas de estocagem temperatura ambiente. 4.2.6 Linfcitos Os valores mdios obtidos para linfcitos (x103/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3

56

(seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 14.

2,50 2,00

Linfcitos
G1 G2 G3 G4

(x10 /L)

1,50 1,00 0,50 0,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

Figura 14. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para linfcitos em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. A contagem de linfcitos diminuiu significativamente nas amostras estocadas a 25C, a partir de 48 e 96 horas, no tubo a vcuo e seringa, respectivamente. No houve diferena significativa durante estocagem das amostras a 4C. Estes resultados no confirmam os descritos por WOOD et al. (1999) e GULATI et al. (2002), que observaram aumento da contagem de linfcitos aps 24 horas de conservao de sangue humano temperatura ambiente. 4.2.7 Moncitos Os valores mdios obtidos para moncitos (x103/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3

57

(seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 15.

0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 3 6

Moncitos
G1 G2 G3 G4

(x10 /L)

12

24

36

48

72

96

Momentos (horas) Figura 15. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para moncitos em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. A partir dos dados da figura 15 (apndice 15), verifica-se que ocorreu diminuio significativa na contagem de moncitos a partir de 48 horas nas amostras estocadas no tubo a vcuo, tanto a 4C quanto a 25C e diminuio significativa aps 72 horas de estocagem na seringa a 25C. No foi observada diferena significativa durante a estocagem na seringa a 4C. Os dados obtidos corroboram, em parte, achados de GULATI et al. (2002) e WOOD et al. (1999), que relataram diminuio do nmero de moncitos aps estocagem de sangue de humanos temperatura ambiente durante 24 horas, porm, os mesmos autores no observaram alteraes na contagem de moncitos na conservao das amostras a 4C.

58

4.2.8 Leuccitos Degenerados Os valores mdios obtidos para leuccitos degenerados (x103/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 16.

7,00 6,00
(x10 /L)

Leuccitos Degenerados
G1 G2 G3 G4

5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

Figura 16. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para leuccitos degenerados em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. Como explicitado na figura 16 (apndice 16) ocorreu aumento significativo na quantidade de leuccitos degenerados a partir de 24 horas nas amostras conservadas no tubo a vcuo a 25C, 48 horas no tubo a vcuo a 4C e 36 horas na estocagem na seringa, tanto a 4C quanto a 25 C. Segundo WOOD et al. (2006), as alteraes observadas na contagem diferencial manual de leuccitos, como diminuio do nmero de eosinfilos, neutrfilos, linfcitos e moncitos, se devem degenerao morfolgica das referidas clulas, concordando com o aumento de leuccitos degenerados no

59

presente estudo. Apesar da ocorrncia de alteraes morfolgicas que levaram reduo significativa da contagem diferencial dos leuccitos no decorrer do tempo de estocagem, no houve diminuio estatisticamente significativa da contagem global de leuccitos. De acordo com HOUWEN (2000), a preparao de esfregaos sangneos deve ser realizada at duas horas aps a colheita das amostras conservadas temperatura ambiente e at 8 horas das amostras a 4C, a fim de evitar a degenerao morfolgica dos leuccitos. A degenerao supracitada foi observada no estudo em tela, porm, o tempo de estabilidade das clulas foi superior ao citado por HOUWEN (2000) nas duas temperaturas de estocagem.

60

Figura 17. Leuccitos degenerados.

Figura 18. Leuccitos degenerados.

Figura 19. Leuccito em picnose.

Figura 20. Leuccito em picnose.

61

4.3 Trombograma 4.3.1 Contagem de Plaquetas Os valores mdios obtidos para contagem de plaquetas (x103/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 21.

300,00 250,00
(x10 /L)

Plaquetas
G1 G2 G3 G4

200,00 150,00 100,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas)

Figura 21. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para contagem de plaquetas em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. Os dados apresentados na figura 21 (apndice 17) indicam que houve diminuio significativa na contagem de plaquetas a partir de 96 horas nas amostras estocadas a 4C, na seringa e no tubo a vcuo, aps 24 horas no tubo a vcuo a 25C e no foi observada qualquer alterao significativa nas amostras conservadas na seringa a 25C. Os achados da conservao temperatura ambiente discordam dos resultados de PASTOR et al. (1997), os quais observaram estabilidade das plaquetas por 72 horas no tubo a vcuo; concordam

62

com achados de MDAILLE et al. (2006) que relataram diminuio das plaquetas aps 24 horas no tubo a vcuo e concordam, em parte, com FURLANELLO et al. (2006) que encontraram diminuio da contagem de plaquetas aps 36 horas no tubo a vcuo. Os resultados obtidos para contagens de plaquetas 30 minutos aps a retirada da temperatura de 4C discordam dos achados de PASTOR et al. (1997), que realizaram a avaliao das plaquetas cinco minutos aps a retirada das amostras da refrigerao e observaram diminuio da contagem de plaquetas aps 6 horas de estocagem. Os mesmos dados corroboram achados de FURLANELLO et al. (2006), os quais avaliaram as plaquetas 30 minutos aps a retirada da temperatura de 4C, para permitir que as amostras retornassem temperatura ambiente e relataram estabilidade das plaquetas estocadas na temperatura de refrigerao durante 48 horas. Diante da divergncia de resultados obtidos pelos autores supracitados, foi realizada, neste ensaio, avaliao das plaquetas tambm 5 minutos aps retiradas da refrigerao, a fim de comparar com os dados das amostras avaliadas aps 30 minutos. Os valores mdios obtidos para contagem de plaquetas (x103/L) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C) e G2 (tubo a vcuo a 4C) na avaliao das amostras aps cinco e trinta minutos de retiradas da refrigerao esto expressos na figura e apndice de nmero 22.

63

Plaquetas
300 250 200 150 100 50 0 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas) Figura 22. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para contagem de plaquetas em ces do grupo G1 (seringa a 4C) e G2 (tubo a vcuo a 4C) na avaliao das amostras aps cinco e trinta minutos de retiradas da refrigerao, nos diferentes momentos (M1 a M9) de conservao das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. A partir dos dados apresentados na figura 22 (apndice 18), verifica-se diferena significativa nas contagens de plaquetas entre os minutos de avaliao aps refrigerao, a partir de 24 horas no grupo G1 e de 36 horas no grupo G2, sendo que os valores encontrados em cinco minutos foram menores que em trinta minutos, determinando que a divergncia de resultados obtidos por PASTOR et al. (1997) e FURLANELLO et al. (2006) se deve s diferentes metodologias utilizadas pelos autores. PASTOR et al. (1997) afirmaram que a diminuio na contagem de plaquetas ocorre devido agregao plaquetria, um fenmeno que tm sido descrito em bovinos, eqinos, sunos, ces e humanos e OLSEN et al. (2001) complementou relatando que, em humanos, a formao destes agregados ocorre com menos freqncia nas amostras estocadas a temperatura ambiente que nas amostras refrigeradas, isto pois, tm sido proposto que as plaquetas so ativadas quando entram em contato com o EDTA a baixas temperaturas. No presente

G1/5 G1/30 G2/5 G2/30

(x10 /l)

64

estudo, os valores de plaquetas se apresentaram reduzidos na avaliao das amostras cinco minutos aps a retirada da refrigerao e aumentaram consideravelmente aps as amostras retornarem temperatura ambiente, ratificando a explicao descrita acima. 4.3.2 VPM Os valores mdios obtidos para VPM (fL) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 23.

VPM
13,00 12,00
(fL)

G1 G2 G3 G4 0 3 6 12 24 36 48 72 96

11,00 10,00 9,00 8,00 Momentos (horas)

Figura 23. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para VPM em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. A partir dos dados da figura 23 (apndice 19), verifica-se que ocorreu aumento significativo no valor do VPM, a partir de 12 horas nas amostras conservadas no tubo a vcuo, tanto a 4C quanto a 25C e de 24 horas na estocagem na seringa a 4C. No houve diferena significativa durante a

65

estocagem

na

seringa

25C.

Estes

dados

corroboram

achados

de

FURLANELLO et al. (2006), que observaram aumento do VPM aps 12 horas de estocagem temperatura ambiente no tubo a vcuo e discordam dos achados de PASTOR et al. (1997), os quais relataram estabilidade do VPM temperatura ambiente e 4C, no tubo a vcuo. Segundo JAIN (1993), FELDMAN et al. (2000) E REBAR et al. (2003), podem ocorrer falsos aumentos do VPM quando as plaquetas esto expostas ao EDTA e so mantidas em ambiente frio ou refrigeradas, fato tambm observado no presente estudo. Este resultado ressalta a presena de agregados plaquetrios nas amostras estocadas a 4C, visto que plaquetas agregadas so aparentemente maiores e estas podem ser contadas como uma unidade plaquetria, elevando o VPM. 4.3.3 PDW Os valores mdios obtidos para PDW (fL) nos diferentes momentos para os grupos G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) esto expressos na figura e apndice de nmero 24.

66

PDW
19,00 17,00 15,00 13,00 11,00 9,00 7,00 5,00 0 3 6 12 24 36 48 72 96 Momentos (horas) Figura 24. Representao grfica das variaes dos valores mdios obtidos para PDW em ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (M1 a M9) de estocagem das amostras de sangue, Jaboticabal (SP), 2006. O valor de PDW aumentou significativamente aps 48 horas de estocagem nas amostras conservadas a 4C, na seringa e no tubo a vcuo, aps 24 horas no vcuo a 25C e no houve diferena significativa durante a estocagem na seringa a 25C. Estes valores corroboram, em parte, FURLANELLO et al. (2006), que relataram aumento do PDW aps 48 horas de estocagem a 4C e no observaram alteraes na estocagem temperatura ambiente e PASTOR et al. (1997), os quais relataram aumento do PDW aps 24 horas de estocagem.

G1 G2 G3 G4

67

5. CONCLUSES Os resultados obtidos no presente estudo permitem as seguintes concluses: 1. Os parmetros contagem global de hemcias, concentrao de hemoglobina, contagem global de leuccitos e contagem de basfilos se mantiveram estveis durante todo o protocolo na estocagem temperatura ambiente e 4C, tanto na seringa, quanto no tubo a vcuo. 2. A determinao do hemograma das amostras estocadas na seringa a temperatura ambiente pode ser realizado at 12 horas para que no ocorra alterao em nenhum parmetro, com exceo das plaquetas que no sofrem alterao durante a estocagem nas referidas condies. 3. A avaliao das amostras estocadas no tubo a vcuo a temperatura ambiente deve ser efetuada at 12 horas, a fim de evitar alterao em qualquer parmetro do hemograma. 4. A determinao do hemograma aps estocagem na seringa a 4C pode ser realizada at 96 horas sem alterao em nenhum parmetro. 5. A avaliao do hemograma das amostras estocadas no tubo a vcuo a 4C pode ser feita at 96 horas, com exceo do VCM e CHCM que devem ser mensurados at 36 horas. 6. A avaliao das plaquetas cinco minutos aps a retirada da refrigerao causa diminuio do nmero delas, portanto, a avaliao das amostras aps retornarem temperatura ambiente mais confivel. 7. A refrigerao retarda ou evita as alteraes que ocorrem nos parmetros do hemograma durante a estocagem de sangue perifrico de ces. 8. A seringa um material mais apropriado que o tubo a vcuo para estocagem de sangue perifrico de ces e posterior avaliao das caractersticas do hemograma, uma vez que a estocagem na seringa permite estabilidade dos parmetros do hemograma por maior tempo que a estocagem no tubo a vcuo.

68

6. REFERNCIAS

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73

APNDICES

74

Apndice 1 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem global de hemcias dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).

Grupos
1 2 3 4 CV

(n=20)

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

0 6,880,68a 7,280,65a 6,880,68a 7,280,65a 9,63

3 6,880,66a 7,300,65a 6,750,67a 7,140,68a

6 6,890,64a 7,290,66a 6,690,65a 7,080,66a

12 6,900,56a 7,270,67a 6,580,65a 6,920,66a

Momentos (horas) 24 6,880,61a 7,240,69a 6,560,62a 6,820,62a

36 6,870,58a 7,210,66a 6,580,64a 6,820,60a

48 6,850,56a 7,140,69a 6,620,60a 6,830,64a

72 6,780,62a 7,020,67a 6,690,65a 6,980,68a

96 6,800,64a 7,090,68a 6,800,69a 7,160,66a

Apndice 2 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para concentrao de hemoglobina dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 16,911,53a 17,841,48a 16,911,53a 17,841,48a 8,58 3 16,851,50a 17,881,50a 16,771,45a 17,781,50a 6 16,901,31a 17,831,52a 16,891,43a 17,821,48a 12 16,931,27a 17,821,49a 16,771,44a 17,741,53a Momentos (horas) 24 17,011,22a 17,801,56a 16,851,50a 17,641,52a 36 17,001,19a 17,701,49a 16,841,48a 17,571,49a 48 17,041,24a 17,621,54a 16,841,46a 17,501,62a 72 16,881,46a 17,361,47a 16,851,44a 17,451,55a 96 17,061,44a 17,461,54a 16,751,40a 17,361,38a

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 3 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para hemoglobina livre dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 0,190,08d 0,190,08c 0,190,08d 0,190,08d 12,14 3 0,220,09cd 0,250,10bc 0,210,10d 0,200,09d 6 0,260,11bcd 0,270,11abc 0,220,11d 0,210,09d 12 0,250,12bcd 0,280,11abc 0,220,10d 0,220,09d Momentos (horas) 24 0,340,16abc 0,340,14ab 0,280,12cd 0,230,10cd 36 0,360,18ab 0,300,12abc 0,290,11cd 0,280,14cd 48 0,450,24a 0,360,15ab 0,360,17bc 0,360,16c 72 0,470,27a 0,360,15ab 0,480,20b 0,630,17b 96 0,490,24a 0,400,17a 0,720,27a 0,930,20a

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

75

Apndice 4 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para hematcrito dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/UnespJaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 50,074,81a 52,854,61a 50,074,81d 52,854,61c 10,16 3 50,124,47a 53,264,55a 50,454,75d 52,504,61c 6 50,424,55a 53,514,64a 50,014,54cd 52,714,30c 12 50,343,91a 53,554,84a 51,334,57cd 52,664,31c Momentos (horas) 24 36 50,414,20a 50,443,95a 54,084,90a 54,344,75a 53,144,64bcd 55,145,23bc 54,214,25bc 55,164,34abc 48 50,453,89a 54,285,07a 57,214,89ab 57,494,87ab 72 50,504,60a 54,005,15a 60,205,18a 59,065,33a 96 51,224,72a 55,355,24a 60,524,60a 57,785,62ab

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 5 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para VCM dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/UnespJaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 72,851,77b 72,691,85e 72,851,77g 72,691,85d 7,14 3 72,881,78ab 73,031,97de 74,852,00fg 73,571,95d 6 73,262,02ab 73,481,94de 76,342,13ef 74,552,05cd 12 72,941,81ab 73,762,05cde 78,042,24e 76,182,41c Momentos (horas) 24 36 73,341,91ab 73,501,90ab 74,782,10bcde 75,442,16bcd 81,042,58d 83,812,52c 79,583,02b 81,124,70b 48 73,772,06ab 76,122,32abc 86,972,95b 84,353,52a 72 74,512,04ab 76,952,94ab 90,142,95a 84,773,72a 96 75,362,28a 78,122,38a 89,253,92ab 80,793,85b

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 6 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para HCM dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/UnespJaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 24,610,84a 24,560,88a 24,610,84c 24,560,88cd 3,79 3 24,540,81a 24,510,77a 24,900,91abc 24,931,04bcd 6 24,570,83a 24,500,92a 25,170,87abc 25,200,97abc 12 24,530,85a 24,560,79a 25,500,89ab 25,660,80ab Momentos (horas) 24 36 24,780,97a 24,771,01a 24,620,89a 24,590,90a 25,690,75a 25,610,79a 25,850,68a 25,790,80a 48 24,931,03a 24,730,87a 25,460,69abc 25,660,78ab 72 24,930,85a 24,770,88a 25,210,78abc 25,020,79abcd 96 25,120,92a 24,660,91a 24,670,86bc 24,300,82d

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

76

Apndice 7 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para CHCM dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/UnespJaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 33,790,67a 33,790,77a 33,790,67a 33,790,77a 5,91 3 33,620,56a 33,570,59a 33,280,74ab 33,900,95a 6 33,560,76a 33,340,74ab 32,980,60ab 33,810,82a 12 33,640,80a 33,300,64ab 32,690,70b 33,680,69a Momentos (horas) 24 36 33,780,83a 33,730,83a 32,940,72abc 32,590,64bc 31,700,69c 30,570,84d 32,521,06b 31,912,17b 48 33,790,93a 32,490,78bc 29,270,85e 30,461,30c 72 33,460,69a 32,221,30cd 28,010,88f 29,561,18c 96 33,350,87a 31,590,95d 27,660,91f 30,111,29c

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas inhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 8 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de reticulcitos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 0,030,02a 0,030,03a 0,030,02a 0,030,03a 1,78 3 0,020,02a 0,030,03a 0,030,02a 0,030,02a 6 0,020,02a 0,030,02a 0,020,02a 0,030,02ab 12 0,020,02a 0,030,02a 0,020,02a 0,030,02ab Momentos (horas) 24 0,020,02a 0,020,02a 0,020,01a 0,020,02ab 36 0,020,01a 0,030,02a 0,020,01a 0,020,02ab 48 0,020,02a 0,020,02a 0,020,01a 0,020,02ab 72 0,020,01a 0,020,02a 0,010,01a 0,010,02ab 96 0,010,01a 0,020,02a 0,010,01a 0,010,01b

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 9 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem global de leuccitos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 8,752,24a 9,492,69a 8,752,24a 9,492,69a 12,38 3 9,212,35a 9,812,67a 8,502,10a 9,742,69a 6 9,302,98a 9,762,70a 8,402,23a 9,862,88a 12 9,022,36a 9,752,71a 8,412,19a 9,772,44a Momentos (horas) 24 9,032,23a 9,642,45a 8,392,11a 10,022,50a 36 9,042,30a 9,692,75a 8,312,20a 10,073,19a 48 9,412,44a 9,782,71a 8,682,30a 9,642,65a 72 9,322,32a 9,863,01a 8,812,39a 9,712,57a 96 9,822,42a 9,932,53a 9,072,49a 9,782,49a

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

77

Apndice 10 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de basfilos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 0,020,04a 0,030,05a 0,020,04a 0,030,05a 3,95 3 0,030,05a 0,030,06a 0,010,03a 0,000,01a 6 0,020,03a 0,020,09a 0,010,04a 0,000,02a 12 0,020,04a 0,020,06a 0,020,04a 0,020,06a Momentos (horas) 24 0,020,05a 0,020,05a 0,010,03a 0,010,03a 36 0,020,08a 0,030,06a 0,020,06a 0,010,02a 48 0,020,06a 0,010,04a 0,010,03a 0,010,04a 72 0,000,00a 0,010,03a 0,000,00a 0,000,00a 96 0,000,02a 0,010,03a 0,000,01a 0,000,00a

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas inhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 11 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de eosinfilos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 0,770,51a 0,820,71a 0,770,51a 0,820,71a 23,60 3 0,850,61a 0,830,66a 0,790,52a 0,860,61a 6 0,830,58a 0,730,54a 0,760,50a 0,930,69a 12 0,700,63a 0,840,69a 0,720,51a 0,880,48a Momentos (horas) 24 0,700,47a 0,870,71a 0,730,55a 0,920,60a 36 0,740,48a 0,730,57a 0,780,57a 0,720,57a 48 0,760,61a 0,830,75a 0,730,74a 0,500,48ab 72 0,740,66a 0,750,55a 0,390,44ab 0,190,22b 96 0,690,57a 0,610,52a 0,060,11b 0,080,11b

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 12 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de neutrfilos bastonetes dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 0,120,10a 0,200,17a 0,120,10a 0,200,17a 8,18 3 0,140,12a 0,100,10b 0,090,11a 0,100,09b 6 0,060,09a 0,100,07b 0,090,07a 0,080,07b 12 0,090,10a 0,090,11b 0,110,10a 0,050,06b Momentos (horas) 24 0,090,08a 0,110,09ab 0,060,07a 0,060,09b 36 0,070,07a 0,150,08ab 0,100,11a 0,030,06b 48 0,090,11a 0,140,15ab 0,070,09a 0,030,05b 72 0,080,07a 0,100,08b 0,050,07a 0,060,09b 96 0,090,10a 0,080,09b 0,040,08a 0,020,05b

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

78

Apndice 13 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de neutrfilos segmentados dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 5,681,44a 5,921,61a 5,681,44a 5,921,61a 15,13 3 5,741,54a 6,011,79a 5,341,45a 5,961,78a 6 5,601,97a 5,951,93a 5,151,53a 6,182,06a 12 5,421,54a 5,731,87a 5,201,57a 5,961,69a Momentos (horas) 24 5,361,54a 5,791,57a 5,181,34a 5,911,73a 36 5,361,55a 5,721,87a 4,921,33a 6,082,21a 48 5,301,49a 5,571,47a 4,871,50a 5,271,81ab 72 4,931,47a 5,521,70a 4,451,42ab 3,971,24b 96 4,831,38a 5,271,76a 3,501,95b 2,631,29c

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 14 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de linfcitos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 1,440,53a 1,800,66a 1,440,53a 1,800,66a 17,46 3 1,630,69a 1,950,74a 1,490,57a 1,840,67a 6 1,740,55a 1,890,56a 1,410,52a 1,560,57ab 12 1,680,62a 1,760,57a 1,350,45a 1,620,59ab Momentos (horas) 24 1,650,62a 1,770,84a 1,210,50a 1,530,68ab 36 1,460,64a 1,750,68a 1,100,40ab 1,340,74abc 48 1,710,65a 1,770,69a 1,180,40ab 1,130,54bc 72 1,530,66a 1,660,93a 1,020,49ab 0,910,59cd 96 1,510,76a 1,640,67a 0,680,28b 0,580,36d

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 15 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de moncitos dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 0,250,17a 0,240,16ab 0,250,17a 0,240,16a 13,21 3 0,280,22a 0,270,15ab 0,240,18a 0,270,13a 6 0,310,21a 0,250,21ab 0,230,17a 0,250,19a 12 0,290,18a 0,420,23a 0,200,18a 0,220,19ab Momentos (horas) 24 0,270,22a 0,220,26b 0,250,20a 0,260,18a 36 0,270,23a 0,250,28ab 0,140,11ab 0,110,12abc 48 0,270,14a 0,210,14b 0,160,17ab 0,060,08bc 72 0,250,23a 0,210,19b 0,020,03b 0,010,02c 96 0,210,23a 0,200,20b 0,030,07b 0,030,09c

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

79

Apndice 16 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de leuccitos degenerados dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 0,470,28e 0,470,28e 0,470,28f 0,470,28g 32,58 3 0,570,40de 0,620,36de 0,540,28ef 0,710,35fg 6 0,740,27cde 0,790,34cde 0,730,30def 0,860,49efg 12 0,800,36cde 0,890,40cde 0,800,28def 1,020,43ef Momentos (horas) 24 36 0,960,31cd 1,120,49c 0,910,30cde 1,060,55bcd 0,950,37de 1,250,47cd 1,330,38de 1,790,69d 48 1,260,54bc 1,250,48bc 1,660,70c 2,640,95c 72 1,780,69b 1,620,67ab 2,871,08b 4,562,03b 96 2,491,06a 2,110,74a 5,212,81a 6,432,27a

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 17 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de plaquetas dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/Unesp-Jaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 256,460,34a 265,964,96a 256,460,34a 265,964,96a 15,04 3 251,064,01a 262,166,81ab 250,458,95a 259,564,25a 6 245,462,98ab 255,569,59ab 244,561,56a 241,960,11ab 12 242,961,18ab 242,374,59ab 229,561,78a 215,962,48abc Momentos (horas) 24 237,662,25ab 238,065,79ab 221,763,18a 184,068,44c 36 234,161,53ab 215,556,35ab 210,857,52a 168,580,35c 48 224,468,76ab 214,863,79ab 207,160,36a 175,870,37c 72 212,370,40ab 211,061,45ab 210,062,53a 187,859,62bc 96 189,260,37b 200,552,61b 215,069,38a 179,358,19c

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 18 - Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para contagem de plaquetas dos ces do grupo G1 (seringa a 4C) e G2 (tubo a vcuo a 4C) na avaliao das amostras aps cinco e trinta minutos de retiradas da refrigerao nos diferentes momentos (horas) de conservao, Jaboticabal (SP), 2006.
Min 5 G1 30 5 G2 30 CV 0 256,460,3A 256,460,3A 265,964,9A 265,964,9A 20,17 3 222,683,0A 251,060,0A 238,580,8A 262,166,8A 6 199,887,4B 245,463,0AB 224,381,0AB 255,569,6A 12 188,283,4B 242,961,2A 200,488,8AB 242,374,6A Momentos (horas) 24 165,093,7B 237,662,2A 194,780,8AB 238,065,8A 36 160,084,2C 234,161,5A 166,868,5BC 215,556,3AB 48 153,285,2B 224,468,8A 152,767,9B 214,863,8A 72 151,875,4B 212,370,4A 165,373,8AB 211,061,4A 96 124,972,1B 189,260,4A 149,756,1AB 200,552,6A

Mdias seguidas por mesma letra maiscula nas colunas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). G1- grupo 1; G2- grupo 2; Min- minutos.

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Apndice 19 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para VPM dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/UnespJaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 9,331,02c 9,811,00d 9,331,02a 9,811,00d 12,39 3 9,871,02bc 10,451,05cd 9,581,14a 10,111,02cd 6 10,251,02bc 10,611,02cd 9,451,11a 10,311,12bcd 12 10,230,91bc 10,931,04bc 9,541,08a 10,841,17abc Momentos (horas) 24 36 10,841,27ab 10,670,96ab 11,120,97abc 11,270,97abc 9,771,10a 9,501,08a 11,431,08a 11,121,16abc 48 10,890,92ab 11,470,90abc 9,660,97a 11,211,08ab 72 11,430,87a 11,800,79ab 9,670,98a 10,851,39abc 96 11,640,88a 11,970,87a 9,240,84a 10,131,70cd

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Apndice 20 Valores mdios e respectivos desvios-padro obtidos para PDW dos ces do grupo G1 (seringa a 4C), G2 (tubo a vcuo a 4C), G3 (seringa a 25C) e G4 (tubo a vcuo a 25C) nos diferentes momentos (horas) de conservao das amostras de sangue (FCAV/UnespJaboticabal, 2006).
(n=20) Grupos 1 2 3 4 CV 0 11,411,84c 12,051,65d 11,411,84a 12,051,65c 20,68 3 12,382,05bc 12,842,34cd 12,242,44a 12,211,90bc 6 12,912,06bc 13,092,23cd 12,062,24a 13,032,20abc 12 12,871,86bc 13,502,27bcd 12,072,32a 14,092,71abc Momentos (horas) 24 36 13,601,96bc 13,782,59bc 14,382,84abcd 14,452,76abcd 12,642,47a 12,152,60a 15,232,38a 15,002,91a 48 14,412,55ab 14,692,50abc 12,102,13a 14,932,90a 72 16,323,30a 15,552,50ab 12,062,11a 14,793,28a 96 16,542,87a 16,062,75a 11,952,02a 14,563,56ab

Mdias seguidas por mesma letra minscula nas linhas no diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

81 Apndice 21 - Valores hematolgicos de referncia para ces normais. Parmetros Hematolgicos Valores de Referncia Hemcias (x106/L) 5,5 8,5 Hemoglobina (g/dL) Hematcrito (%) VCM (fL) HCM (pg) CHCM (%) Leuccitos/L Basfilos Eosinfilos Neutrfilos Bastonetes Neutrfilos Segmentados Linfcitos Moncitos Plaquetas (x10 /L) VPM (fL)
3

12 - 18 37 - 55 60 - 77 19,5 24,5 32 - 36 6.000 17.000 Raros 100 1.250 0 - 300 3.000 11.500 1.000 4.800 150 1.350 200 - 500 6,7 11,1

Fonte: FELDMAN, B.F.; ZINKL, J.G.; JAIN, C.N. Schalms veterinary hematology. 5a ed. Philadelphia: Lippincott William & Wilkins, 2000. 1344p.

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