Comentario del artculo:

Transgenic Monkeys Produced by Retroviral Gene Transfer into Mature Oocytes

A. W. S. Chan, K.Y. Chong, C. Martinovich, C. Simerly, G. Schatten. Science 291, 309 (2001)

Realizado por: Manuel Pedro Jimnez Garca. Asignatura: Ingeniera Biomolecular. Curso: 2011-12.

ndice del comentario

1)

Modelos animales: ratones vs primates no humanos. Objetivo. Procedimiento experimental

2) 3)

4)

Resultados:
Eficiencia de la transgnesis. Comprobacin de la integracin del transgn.

5)

Conclusiones

1) Modelos animales
Limitaciones interespecficas entre humanos y primates son menores que entre humanos y roedores. La utilizacin de primates acelerara multitud de investigaciones del rea de la biomedicina. Mayor obstculo para trabajar con primates baja eficiencia de transferencia de DNA basndonos en los protocolos convencionales.

2) Objetivos
Generar monos rhesus transgnicos que expresen la protena GFP, a partir de dos vectores retrovirales diferentes en cuanto al promotor de GFP.

Vectores de expresin retroviral pseudotipados: 1) LNC-EGFP (VSV-G):

GFP se encuentra bajo el control del promotor temprano de CMV (citomegalovirus). 2) LNEF-EGFP (VSV-G): GFP se encuentra bajo el control del promotor hEF-1a (factor de elongacin humano 1 alfa)

3) Procedimiento experimental
3.1) Clonacin de GFP en cada vector plasmdico. Pre- Implantacin Implantacin 3.2) Replicacin de cada vector en bacterias. 3.3) Transfeccin en clulas EcoPackTM 2-293. Y Cotransfectado con pVSV-G (que permiten la replicacin y el empaquetamiento de los retrovirus) 3.4) Concentracin de los retrovirus y titulacin. 3.5) Induccin de la infeccin (microinyeccin en el espacio perivitelino de oocitos de monos rhesus). 3.6) Fertilizacin y desarrollo embrionario inicial (in vitro)

3.7) Transferencia de embriones a hembras nodriza (in vivo): 2 embriones por hembra.

3.1.1) Construccin de LNC-EGFP (VSV-G).

pEGFP: GFP se encuentra bajo el control del promotor temprano del citomegalovirus. GFP emite en rojo, debido a una doble sustitucin de aminocidos. Se digiere con HpaI y HindIII

3.1.1) Construccin de LNC-EGFP (VSV-G).

pLNCX Contiene elementos derivados del virus de la leucemia murina de Moloney y del virus del sarcoma murino de Moloney. Carece de los genes GAG, ENG y POL, necesarios para el empaquetamiento del retrovirus.

3.1.2) Construccin de LNEF-EGFP (VSV-G).

pLNEF+ pEGFP: GFP se encuentra bajo el control del promotor hEF-1a. GFP emite en color verde. Un fragmento de 3,44 kb de hEFnGFP fue insertado en un sitio de extremos romos creado en pLNCX por digestin con HindIII y BamHI.

3.3) Transfeccin in vitro de clulas empaquetadoras (EcoPackTM 2-293).Y Cotransfeccin de pVSV-G

La lnea EcoPackTM 2-293:
Son clulas derivadas de fibroblastos de rion humano. Estn transformadas con el adenovirus 5, permitiendo expresar GAG, POL, ENV del virus de la leucemia murina de Moloney. Permite la replicacin y empaquetamiento de retrovirus.

Co-transfeccin de pVSV-G:
Unido al tipo celular anterior permite producir retrovirus infecciosos pero no replicativos. Expresa la glicoprotena-G del virus de la estomatitis vesicular, bajo un promotor fuerte de citomegalovirus.

Proceso de incubacin y recogida del sobrenadante del cultivo.

3.4) y 3.5) Concentracin de retrovirus. Titulacin. Microinyeccin de oocitos.

El ttulo viral es un punto crtico para obtener altas eficiencias de transduccin. Ttulos obtenidos:
108 ufc/ml en LNEF-EGFP (VSV-G) 109 ufc/ml en LNC-EGFP (VSV-G)

Microinyeccin del espacio perivitelino del oocito:

Se inocularon entre 10-100 pl
Entre 1-10 vectores LNC-EGFP Entre 0.1-1 vectores LNEF-EGFP

6.1) Resultados: Eficiencia de la transgnesis en los embriones rhesus, fetos y nacidos.

Monos rhesus nacidos con vida:

ANDi: transgnico Infant B: no transgnico (posible mosaico) Infant C: no transgnico (posible mosaico)

6.2) Resultados: comprobacin de la integracin del transgn.

Procedimiento realizado en 19 tejidos: se utilizan unos u otros dependiendo de la tcnica y del individuo.
1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Placenta Sangre Cordn umbilical Linfocitos cultivados Epitelio bucal Epitelio urogenital Pelo Pulmones 9) 10) 11) 12) 13) 14) 15) 16) 17) Hgado Corazn Intestino Rion Vejiga Testculos Tejido muscular Piel Cola 18) 19) Pncreas Bazo

Tcnicas: PCR y RT-PCR Southern blot Microscopa confocal ANDi

Resultados PCR y RT-PCR

Primers utilizados: para pLNC-EGFP, pLNEF-EGFP y GFP.

ANDi es transgnico y presenta mRNA en todos los tejidos analizados.

Determinacin de la integracin del vector: Resultados PCR de amplificacin de la regin LTR del vector.

Infant B y C: monos rhesus no transgnicos

La integracin del vector fue determinada por: PCR de placenta (Pl), cordon umbilical (Co), sangre (Bo), pelo (Ha) y epitelio bucal (Bu), empleando primers especficos para la amplificacin de las regiones LTR retrovirales. La secuencia del provirus se detect en ANDi y los 2 fetos muertos: Feto macho muerto (Mu: tejido muscular del mismo) Feto reabsorvido (T3: tejido inespecfico del mismo).

Resultados Southern-blot.
Se realiz un corte nico con HindIII del DNA genmico. Se utiliz [23P] para detectar el transgn.

C1: control negativo. Tejido de mono rhesus no transgnico. DNA pLNC-EGFP: control positivo. No se muestra. Conclusin:Varios fragmentos, que indican muchos sitios de integracin. Se explica porque la enzima de restriccin utilizada slo tiene un nico sitio de corte en mitad del transgn.

Resultados de microscopa confocal

Observacin de los niveles de expresin de GFP en los fetos muertos transgnicos: (B): bulbo piloso. Epifluorescencia directa (C): uas de los pies. Epifluorescencia directa (D): Inmunofluorescencia indirecta de secciones congeladas de placenta con anticuerpos anti-GFP conjugados con rodamina (rojo). (E): inmunofluorescencia indirecta igual a (D) pero el anticuerpo conjugado con fluorescena (verde). (F): Superposicin de (D)+(E) mostrando colocalizacin de GFP directa.

Conclusiones
La transferencia gnica mediada por retrovirus para producir animales transgnicos tiene la ventaja de que introduce una nica copia del transgn, aunque en la prctica no siempre es as. La desventaja es que el tamao del fragmento es lmitado y que existe una posible interferencia de las regiones de regulacin viral, con genes endgenos del animal. ANDi tiene una insercin del transgn (en sentido inverso), en todos sus rganos y tejidos, por tanto, no es un animal mosaico, sino un animal transgnico completo. Anlisis de fluorescencia directa de GFP en las uas de los pies y el pelo de fetos, y de placenta son datos que permiten establecer que hay transgnesis, los fetos muertos son transgnicos. La alta eficiencia de ste mtodo se debe a la ausencia de envuelta nuclear en los oocitos, que se consigue deteniendo la metafase II de manera natural. El aborto de los gemelos es un fenmeno raro y de alto riesgo para la madre, puede deberse a que fueron originados del vector de ms alto ttulo. Aunque slo ANDi es transgnico en todos sus tejidos y rganos, no podemos descartar que los fetos muertos sean transgnicos mosaicos, ya que al no tener los rganos formados completamente, no se pudo tomar muestras especficas de cada rgano. Todava no se puede demostrar transmisin vertical del transgn, ya que ANDi an no ha madurado sexualmente, como para tomar muestras de sus espermatozoides. El ttulo del vector inoculado, as como el volumen microinyectado tienen una relevancia enorme en cuanto a la eficiencia de la transgnesis. Se investiga en esta lnea actualmente. Los primates no humanos son modelos animales indispensables para la terapia gnica de enfermedades como el Parkinson y la Diabetes, incluso modelos para testar terapias celulares y vacunas para el HIV. A pesar de que con este artculo se demuestra la posibilidad de introducir un transgn en monos rhesus, an existen grandes obstculos para conseguir una recombinacin homloga exitosa en gene targeting o lo que es lo mismo, la generacin de monos rhesus knock out para un determinado gen.

Gracias por vuestra atencin!