Optimizacin de la extraccin asistida por ultrasonido de los polisacridos solubles en agua del micelio Boletus edulis usando la metodologa

de superficie de respuesta
RESUMEN
Un procedimiento asistido por ultrasonido para la extraccin de polisacridos solubles en agua sumergido en el cultivo del micelio Boletus edulis se investig mediante la metodologa de superficie de respuesta (RSM).Tres variables independientes fueron proporcin del micelio seco en agua (X1: 1:40-1:60), tiempo de extraccin (X2: 6-10 minutos), y la temperatura del ultrasonido (X 3: 50-70C).El anlisis estadstico indica las variables independientes (X2, X3), los trminos cuadrticos ( y ) y la interaccin entre X3 y X1 tena efectos significativos en el rendimiento de los polisacridos (p <0.05). Las condiciones ptimas fueron 56C, 1:55 de la relacin del micelio seco en agua, y un tiempo de contacto de 8,4 min.Bajo estas condiciones, el rendimiento experimental de los polisacridos era de 15,48%, que corresponde bien con el rendimiento predictivo de 15,53%.

1.

Introduccin

Boletus edulis es una de las setas ms conocidas comestibles recolectados sobre todo en el hemisferio norte de Europa, Asia y Amrica del Norte. Los polisacridos extrados de B. edulis se ha reportado que tiene muchas funciones biolgicas, como efectos anticancergenos, antioxidantes y antiinflamatorios.Sin embargo, los frutos pertenecientes de B. edulis son muy valiosos por su rareza y dificultad en el cultivo. B. edulis es un hongo micorriza. Su micelio pero no los cuerpos de fruta pueden cultivarse fcilmente. As B. edulis puede obtenerse en forma de micelio de cultivo sumergido y los polisacridos bioactivos pueden ser extrados a partir del micelio B. edulis. Un estudio de la literatura indica que no hubo ninguna investigacin sobre la extraccin de polisacridos solubles en agua delmicelio B. edulis. El calentamiento o ebullicin es usado convencionalmente para extraer polisacridos solubles en agua. Sin embargo, durante la extraccin, muchos compuestos bioactivos debido a la ionizacin, hidrlisis y oxidacin se pierden fcilmente. Recientemente, diversas tcnicas novedosas de extraccin se han desarrollado para la extraccin de compuestos bioactivos tales como la extraccin asistida por ultrasonido, extraccin asistida por microondas y la extraccin con fluidos supercrticos. Entre stos, la extraccin asistida por ultrasonido es una de las ms econmicas, es una tcnica simple y eficaz, que pueden aumentar el rendimiento de los componentes extrados, reducir el tiempo de extraccin y hace que tenga un mayor rendimiento en el procesamiento. Es muy til para la extraccin de compuestos termolbiles e inestables, presumiblemente por evitar reacciones de degradacin. En este estudio, se investig la condicin de extraccin asistida por ultrasonido de los polisacridos del cultivo sumergido del micelio B. edulis. Para mejorar el rendimiento de los polisacridos, la metodologa de superficie de respuesta (RSM) fue diseado para analizar sistemticamente los efectos de los parmetros de extraccin en los rendimientos de los polisacridos de micelio de B. edulis y sus interacciones. RSM es una tcnica estadstica eficaz para optimizar los procesos complejos, que es ampliamente utilizado en la optimizacin de las variables del proceso de extraccin. La principal ventaja de RSM es el reducido nmero de ensayos experimentales necesarios para evaluar varios parmetros y sus interacciones, lo que es ms eficiente y ms fcil de organizar e interpretar los experimentos en comparacin con los dems. Box-Behnken

dise (BBD), una RSM, basado sobre 3 niveles y 3 variables del compuesto central, fue empleado para obtener la mejor combinacin posible de temperatura de extraccin, tiempo de extraccin y relacin de agua del micelio seco para la mxima produccin de polisacridos. 2. Materiales y mtodos

2.1. Microorganismos y condiciones del cultivo B. edulis ACCC50559 era de la Coleccin de la Cultura Agrcola de China (ACCC). Tubos inclinados de agar que contienen patata-dextrosa-agar se inocularon con el micelio y se incubaron a 25C durante 6 das y luego se usa como inculo para semilla de siembra. La semilla de siembra se cultiv en matraces deflectores de 250 mL en un agitador rotatorio durante 60 horas a pH natural, 25C y 120 rpm con un medio (g/L) que contiene: glucosa 20, patata 200 (puesto 200g de patata en el agua, se hirvi durante 30 minutos, y filtrado, volumen medido a 1L), MgSO47H2O 0.5, KH2PO4 1.0, ZnSO47H2O 0.1, extracto de levadura 14, peptona 6. La fermentacin se llev a cabo en el medio de la siguiente composicin (g/L): patata 100 (puesto 100g de patata en el agua, se hierve durante 30 minutos, y se filtra, volumen medido a 1L), sacarosa 20, peptona 6, MgSO47H2O 2, KH2PO4 3, CaCO3 2. Todos los medios se esterilizaron a 115C durante 30 min. El cultivo de fermentacin se inocul en 10% (v/v) del medio de cultivo de siembra anterior y se mantuvo a 28C y 200 rpm en matraces deflectores de 250mL en un agitador rotatorio durante 5 das. 2.2. Extraccin de crudo de polisacridos delamiceliade B. edulis con tratamiento asistida por ultrasonido. El micelio B. edulis del cultivo sumergido se lavaron con agua destilada. El micelio se sec a 30C. Luego, se moli y se almacen en desecadores a temperatura ambiente (15-20C) hasta su uso. El proceso de extraccin de polisacridos del micelio B. edulis por el tratamiento asistida por ultrasonido se realiz en un procesador de ultrasonidos (SY-360, Shanghai Ninson Inc., Shanghai, China). Una dcima del micelio en polvo seco se extrajo con agua destilada en un tubo de centrfuga de 50mL. El tubo de centrfuga se coloc en el procesador de ultrasonidos y se expuso para extraer los polisacridos en diferentes tiempos en diversas temperaturas del ultrasonido en diferentes proporciones del micelio seco al agua.

2.3. Determinacin del rendimiento de los polisacridos de la micelia deB. Edulis Despus del tratamiento con el ultrasonido, la suspensin se extrajo y se centrifug a 7000 rpm por 10 minutos para recoger el sobrenadante y los polisacridos se determinaron por el mtodo de fenol-cido sulfrico. 2.4. Diseo experimental y anlisis estadsticos Un solo factor de prueba se emple para determinar el rango preliminar de las variables de extraccin incluyendo X1 (relacin de micelio seco al agua), X2 (tiempo de extraccin) y X3 (temperatura del ultrasonido). Entonces, un BBD de tres niveles y tres factores se emple para determinar la mejor combinacin de variables de extraccin para los rendimientos de micelio B. edulis de los polisacridos solubles en agua. Tabla 1 representa los valores codificados y no codificado de las variables experimentales y 15 puntos experimentales. Tres repeticiones (13-15) se utilizaron para evaluar el error puro. Los datos experimentales muestran que las variables de respuesta se ajustaron a un modelo polinomial de segundo grado. La forma general del modelo cuadrtico del polinomio fue el siguiente:

3.2. Seleccin del tiempo en el rendimiento de extraccin de polisacridos El tiempo de extraccin es otro factor que podra influir en la eficacia de la extraccin. El proceso de extraccin se llev a cabo utilizando el tiempo de 2, 4, 6, 8 y 10 minutos, cuando otros parmetros de extraccin fueron como sigue: temperatura del ultrasonido 40C, la relacin de micelio seco al agua 1:20. El efecto diferente del tiempo en el rendimiento de extraccin de los polisacridos se muestra en la figura 1 (B). Cuando el tiempo de extraccin vari de 6 a 10 minutos, la varianza de rendimiento de extraccin fue relativamente rpido y la produccin de polisacridos alcanz un mximo en 8 minutos (15,22%), y luego disminuy a medida que la extraccin procedi. Esto indic que el tiempo de extraccin de 6-10 min fue suficiente para obtener los polisacridos, que era menor en el calentamiento convencional o tiempo de extraccin de ebullicin. 3.3. La seleccin de la temperatura sobre el rendimiento de extraccin de los polisacridos Para estudiar el efecto de la temperatura diferente en el rendimiento de extraccin de polisacridos, el proceso de extraccin se llev a cabo utilizando la temperatura de extraccin diferente de 40, 50, 60, 70, 80C, cuando otras condiciones de extraccin fueron las siguientes: tiempo de extraccin 2 min, la relacin de micelio seco al agua 1:20. El rendimiento de extraccin de los polisacridos haba aumentado cuando la temperatura del ultrasonido era de 40 a 60C. Como se muestra en la fig. 1 (C), el rendimiento mximo (15,01%) de los polisacridos se observ cuando la temperatura de extraccin fue de 60C, y luego disminuy a medida que la extraccin procedi. Por lo tanto, el rango de temperatura de extraccin de 50-70C se considera ptimo en el presente experimento. Debido al calentamiento convencional la temperatura de extraccin de ms de 70C, fue menor por la extraccin asistida por ultrasonido. 3.4. Optimizacin de las condiciones de extraccin de los polisacridos 3.4.1. Prediccin del modelo y el anlisis estadstico

(1) donde Y es la respuesta medida asociado a cada combinacin del factor de palanca; 0, i, ii y ij son los coeficientes de regresin para la intercepcin, la linealidad, cuadrado y la interaccin, respectivamente, Xi y Xj son las variables independientes. El software Design Expert (versin de prueba 7.1.6.) se utiliz para estimar la respuesta de cada grupo de diseo experimental y las condiciones optimizadas. La adecuacin del modelo del polinomio cuadrtico fue inspeccionada por el coeficiente de regresin R2. El valor F y valor p se utiliza para comprobar los significados del coeficiente de regresin. 3. Resultados y discusin

3.1. Seleccin de la relacin de micelio seco al agua para el rendimiento de extraccin de polisacridos Los estudios preliminares se realizaron con el fin de determinar la proporcin requerida de micelio seco al agua para los rendimientos de extraccin de polisacridos de B. edulis. La extraccin se lleva a cabo a diferentes proporciones de micelio seco al agua (1:20, 1:30, 1:40, 1:50 y 1:60), mientras que otros parmetros de extraccin fueron como sigue: el tiempo de extraccin 2 min, temperatura del ultrasonido 40C. Los resultados mostraron que la extraccin de los polisacridos era dependiente de la relacin de slido a lquido (Fig. 1 (A)). El rendimiento de polisacridos aument con el aumento de la relacin de slido a lquido. Un pico alto en la transferencia de masa se lleg a la proporcin slidolquido de 1:50. El rendimiento mximo (14,1%) tambin se alcanz. As, la relacin de micelio seco al agua 1:40-1:60 fue favorable para la produccin de polisacridos.

La matriz de diseo y los resultados de los experimentos correspondientes de la RSM para determinar los efectos de las tres variables independientes, incluyendo relacin de micelio seco al agua (X1), tiempo de extraccin (X2) y la temperatura del ultrasonido (X3) se muestran en la Tabla 1. Mediante anlisis de regresin mltiple de los datos experimentales, el modelo para la respuesta Y predicho podra ser expresado por la ecuacin siguiente, un polinomio cuadrtico (en forma de valores codificados):

donde Y es el rendimiento de los polisacridos, X1, X2 y X3 son las variables codificadas para la relacin de micelio seco al

agua, tiempo de extraccin y la temperatura del ultrasonido, respectivamente. Las pruebas estadsticas del modelo se llevaron a cabo en la forma de anlisis de varianza (ANOVA). El ANOVA para el modelo del polinomio cuadrtico ajustado de la extraccin de los polisacridos se muestra en la Tabla 2. El modelo de regresin cuadrtica mostr el valor del coeficiente de determinacin (R2) fue 0,9883, lo que implica que 98.83% de las variaciones podran ser explicadas por el modelo ajustado. Para un buen modelo estadstico, R2adj debe estar cerca de R2. Como se muestra en la Tabla 2, R2adj era 0,9674, lo que implica que slo menos 4,0% del total de variaciones no se explica por el modelo. Tambin indic que un alto grado de correlacin entre los valores observados y los valores predichos. Un valor relativamente bajo de C.V. (coeficiente de variacin) (1,25%) indica una mejor fiabilidad de los valores de los experimentos. Las variables correspondientes seran ms significativas si el valor F se hace mayor y el valor p se hace ms pequeo. Los valores del valor p inferiores a 0,05 mostraron los trminos del modelo fueron significativos. De este modo el valor F (F=47.12) y el valor p (p = 0,003) implica que este modelo fue significativo. Significado del modelo tambin fue juzgado por la prueba de la falta de ajuste. Como se muestra en la Tabla 2, el valor F y el valor p de la falta de ajuste (forma) eran 1,94 y 0,3578, respectivamente, lo que implicaba que no era significativa y un 35.78% de congruencia podra ocurrir debido al ruido. El significado de cada coeficiente se determin usando el valor F y el valor p. Los resultados se dan en la Tabla 3. Se pudo observar que dos variables independientes (X2, X3) y dos trminos cuadrticos ( y ) afect significativamente la produccin de polisacridos, y la interaccin entre X1 y X3 tambin fue significativa (p <0.05). Los resultados tambin mostraron que la variable independiente X3 fue el factor ms significativo en el rendimiento experimental de los polisacridos. 3.4.2. Anlisis de superficie de respuesta

cuadrtico sobre el rendimiento de la respuesta. El grfico de contorno elptico se muestra en la fig. 3 indica las interacciones mutuas entre la relacin de micelio seca al agua y la temperatura de extraccin fueron significativas. Los resultados de la figura 4 mostraron que cuando la proporcin de micelio seca al agua (X1) se fij en el nivel 0, la temperatura de ultrasonidos (X3) se increment con aumentos en el tiempo de extraccin (X2). Y entonces, la temperatura de ultrasonidos (X3) se redujo con mayor aumento en el tiempo de extraccin. El tiempo de extraccin y la temperatura del ultrasonido demostraron efectos cuadrticos sobre la respuesta. 3.5. Optimizacin de los parmetros de extraccin y validacin del modelo A travs de esto trazados en tres dimensiones y sus respectivos trazados de contorno, la idoneidad de la ecuacin del modelo para predecir los valores ptimos de respuesta se probaron usando las condiciones ptimas seleccionadas. Los resultados (Tabla 4) mostr que las condiciones optimizadas fueron la temperatura del ultrasonido de 56,06C, tiempo de extraccin de 8,38 minutos, y la relacin del micelio seca al agua 1:54.53. Bajo las condiciones, el rendimiento de extraccin de los polisacridos fue 15,53%. Sin embargo, teniendo en cuenta la operatividad de la produccin real, las condiciones ptimas se pueden modificar como sigue: temperatura del ultrasonido de 56C, tiempo de extraccin de 8,4 minutos, y la relacin de micelio seco al agua 1:55. Bajo las condiciones modificadas, el rendimiento experimental de polisacridos era 15,48% (N=3), que era prximo al valor predicho. Generalmente, los rendimientos de extraccin de polisacridos a partir de micelios de hongos o setas estaban por debajo de 10%. Hou y Chen (2008) investig que la eficacia de la extraccin de polisacridos de hongos silvestres comestibles BaChu fue de 8,75%. Yan et al. (2011) report los rendimientos de extraccin de polisacridos de Tremella mesenterica fue del 8,26%. Guo et al. (2010) encontr que los rendimientos de extraccin de polisacridos de Phellinus igniarius fue del 5,04%. As la eficacia de la extraccin de 15,48% era muy alta. 4. Conclusin

La relacin entre las variables independientes y dependientes se ilustra mediante la representacin tridimensional de la superficies de respuesta y los contornos de dos dimensiones generadas por el modelo (visto en las figuras. 2-4). Diferentes formas de los trazados de contorno indican las diferentes interacciones entre las variables, un grfico de contorno elptico indica las interacciones entre las variables fueron significativas, mientras que un grfico de contorno circular, significa lo contrario. En estas tres variables (relacin de micelio seca al agua, tiempo de extraccin y la temperatura del ultrasonido), cuando dos variables dentro del rango experimental se representan en la superficie de trazado en tres dimensiones, la tercera variable se mantuvo constante en el nivel cero. Como se muestra en la fig. 2, cuando la temperatura del ultrasonido (X3) se fij en el nivel 0, el tiempo de extraccin (X2) demostraron los efectos cuadrticos en los rendimientos de extraccin. Cuando la proporcin del micelio seco al agua se mantiene a un nivel inferior, el rendimiento aument en un primer momento y luego disminuy con el aumento del tiempo de extraccin (X2). Como se muestra en la fig. 3, cuando el tiempo de extraccin (X2) se fij en el nivel 0, la temperatura del ultrasonido (X3) muestra un efecto

En este estudio, se ha investigado un mtodo asistido por ultrasonidos para extraer los polisacridos del micelio B. edulis usando RSM. Los resultados mostraron que las variables independientes (temperatura y tiempo de extraccin del ultrasonido), y los trminos cuadrticos de temperatura y tiempo de extraccin del ultrasonido, y los efectos de interaccin entre la temperatura del ultrasonido y la relacin de micelio seco al agua tena efectos significativos en el rendimiento de los polisacridos. La temperatura del ultrasonido fue el factor ms significativo en el rendimiento experimental de los polisacridos. Un modelo polinomial de segundo orden se emplea para optimizar la extraccin de polisacridos de micelio B. edulis por la tecnologa de ultrasonidos. La extraccin ptima condiciones para los polisacridos fueron las siguientes: temperatura del ultrasonido 56C, tiempo de extraccin de 8,4 minutos, y la relacin de micelio seco al agua de 1:55. Bajo estas condiciones, el rendimiento experimental de polisacridos era 15,48%, que

haba quedado estrechamente con el valor de rendimiento previsto de 15,53%. El estudio proporciona un mtodo nuevo y eficaz para la extraccin de polisacridos solubles en agua de micelio B. edulis. Otros estudios sobre las estructuras qumicas y la funcin de los polisacridos bioactivos de micelio B. edulis estn bajo proceso.