Microscopia de Fluorescencia

Magaly Herrera Garca Luis Rolando Boza Peralta

Introduccin
Descubierto en 1908 por Khler y Siedentopf Se basa en que una sustancia natural o un colorante aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida

Introduccin

Anticuerpos Anti-ADN nativo por el mtodo de Inmunofluorescencia Indirecta

Siendo pocas las molculas autofluorecentes, su aplicacin mas difundida es para revelar una fluorescencia agregada como en la deteccin de antgenos y anticuerpos

Principio
El espcimen es iluminado con luz de una determinada longitud de onda que es absorbida por los fluorforos haciendo que emitan luz de longitud de onda mayores. La luz de iluminacin se separa de la fluorescencia mucho ms dbil emitida a travs del uso de un filtro de emisin espectral

Constitucin Fundamental

Fuente Luminosa: Lmpara de mercurio o halgena Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiacin ultravioleta Filtros: Retienen la luz ultravioleta dejando pasar solo la visible. Hay diversos tipos de excitacin y emisin

Constitucin Fundamental

Filtro de excitacin: ubicado entre la fuente de luz y el preparado Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisin de luz fluorescente. Filtro de emisin: Ubicada antes del ocular para prevenir daos retinianos que podran ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrmico. Corta completamente la luz de excitacin no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisin del fluorocromo.

Constitucin Fundamental

Espejo Dicroico: Permite la separacin de la luz de excitacin y la fluorescencia. Posicionado en 45 respecto al eje ptico, la longitud de onda ms corta es reflejada y la longitud de onda ms larga lo atraviesa.

Constitucin Fundamental

Microscopios de Fluorescencia

Microscopio de Fluorescencia Invertida AMG

Microscopio de Fluorescencia

EVOS fl

Nikon TE2000

Aplicaciones:
1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por molculas de la muestra misma.
2. Fluorescencia inducida: Partes especficas de la muestra pueden ser observadas selectivamente, mediante mtodos de tincin.

3. Sobre objetos bastante ms pequeos Que la limitacin del poder de resolucin, siempre que su emisin de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molcula de DNA, un virus.

Tcnicas de Tincin Fluorescente

1. DAPI: tie el DNA de color azul brillante. Permite enumerar microorganismos.

2. Tincin de Viabilidad: permite discriminar entre clulas vivas y muertas

3. Green Fluorescent Protein: Deteccin y rastreo de organismos introducidos en ambientes naturales.

Fluorescencia Mltiple
Es posible combinar, sobre una misma muestra, dos o ms colorantes siempre que emitan en diferente longitud de onda y nuestro sistema sea capaz de excitar a todos a la vez y discriminar los fotones emitidos por ellos.

Utiliza una longitud de onda de 200 nm por lo tanto alcanza una resolucin de 100nm. No se puede observar directamente con un ocular porque la luz UV daa la retina. Depende de la absorcin de luz de las molculas.

La lente que usualmente es de vidrio es sustituida por cuarzo y la iluminacin es por lmparas de mercurio. Usa filtros para detectar diversas absorciones de luz y la observacin es directa por poseer otro filtro que retira la luz UV.

Diferencias entre Microscopia Ultravioleta y Fluorescencia

FOTOGRAFAS MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

Ttulo: Ya es primavera en el cerebelo Autor: Nagore Puente Departamento: Neurociencias Tcnica: Microscopa confocal

Cerebelo de un ratn transgnico fluorescente (en verde) junto a la localizacin de un receptor metabotrpico (en rojo)

Ttulo: La noche estrellada Autor: M Roco Fernndez Surez Departamento: Biologa Celular e Histologa Tcnica: Microscopa de fluorescencia

En la imagen se muestran folculos pilosos de ratn recin nacido. En medio de un universo de clulas cuyos ncleos vemos en azul, por el marcaje con DAPI, encontramos unos puntos de color que se

corresponden al marcaje con nestina, protena tpica de las clulas

nerviosas y que es actualmente empleada como marcador de clulas madre

Vstago de Alfalfa

Vegetal perenne profundamente arraigado en la regin mediterrnea cerca de Irn, crece tambin en Amrica del Norte y Asia Occidental

Cultivo de clulas de rin de un mono verde africano

Se marco con anticuerpos primarios de ratn y anticuerpos secundarios conjugados con rodamina Red-X

Clulas de rin de un mono verde africano transformadas con el virus Simian 40

Cultivo adherente de COS-7 de fibroblastos que fue marcado con Oregon Green 488 conjugado con aglutinina de soya

Tejido pulmonar humano.

Se marc con aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugado con Texas Red-X. WGA, que se une selectivamente a Nacetilglucosamina y N-acetilneuramnico residuos (cido silico)

Tejido de un rin de ratn.

La muestra fue marcada triplemente antes de tomar la imagen con Alexa Fluor 568 conjugada con faloidina y Alexa Fluor 488 conjugada con aglutinina de germen de trigo.

Tejido de lengua de oveja.

La muestra fue marcada con Alexa Fluor 350 conjugado con faloidina, Oregon Green 488 conjugado con aglutinina de germen de trigo. Los nucleos celulares se tieron con Steve Orange

Algodn.

Seccin trasversal de algodn manchado con Rodamina B.

Clulas de Mamfero.

Fluorescencia de clulas de mamfero doblemente marcadas. El ADN en el ncleo de la clula es mostrado en azul. Las estructuras citoplasmicas (Micro filamentos) estn mostrados en verde

Clulas endoteliales.

Triple tincin de fluorescencia de clulas endoteliales de una arteria de pulmn.

Cromosomas y ncleos.

Fluorescencia de tres niveles de clulas humanas. El ADN en la segunda interface del ncleo celular y los cromosomas de una tercera clula son mostrados en azul. Secuencias especificas del ADN fueron marcadas en verde y rojo

Cromosomas.

Tincin de doble fluorescencia de cromosomas.

Triple tincin de clulas humanas

Fluorescencia de triple tincin de clulas humanas. Los micro filamentos son mostrados en rojo , componentes del ncleo celular son mostrados en azul y verde.

Clulas epiteliales

Tincin de Inmunofluorescencia de una clula epitelial (Hep-2) Mitocondria.

Bibliografa
MicroscopyU: The source for microscopy education http://www.microscopyu.com/galleries/fluorescence/inde x.html http://www.microscopyu.com/galleries/confocal/index.ht ml Nobelprize.org: The Flourescence Microscope Photo Gallery http://www.nobelprize.org/educational/physics/microsco pes/fluorescence/gallery/index.html Microscopio de Fluorescencia http://morfoudec.blogspot.mx/2008/07/microscopa-defluorescencia.html Wikipedia: The Free Encyclopedia - Fluorescence Microscope Article http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_microscope