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METABOLISMO CELULAR
Los seres vivos necesitan biomolculas para su nutricin: Glcidos, Lpidos y Protenas y minerales, agua y vitaminas .
Una vez digeridos en el tubo digestivo, los nutrientes son absorbidos hacia la sangre y/o linfa para llegar a las clulas. En las clulas son sometidos a muchas reacciones qumicas denominadas METABOLISMO . Este tiene dos etapas: EL CATABOLISMO ( degradacin) y el ANABOLISMO ( Sntesis). En el primero la energa total de las molculas (ENTALPA) disminuye al producir reacciones de tipo exergnico (eliminan energa), En el segundo (anabolismo) la entalpa aumenta al recoger la energa de las reacciones catablicas necesaria para sintetizar molculas. (La ENTALPA: expresa una medida de la cantidad de energa absorbida o cedida por un sistema)
ENZIMAS: Caractersticas
1) Las enzimas generalmente son protenas, sin contar algunos ARN que tambin son catalizadores (Ribozimas). 2) Son biocatalizadores: Porque incrementan la velocidad de las reaccines, miles hasta millones de veces ms rpido. 3) Son muy especficas: Porque catalizan siempre las mismas reaccins con el mismo sustrato. 3) Son termolbiles: Porque en el humano se desnaturalizan y se descomponen hasta anularse totalmente a partir de los 40 No son dializables ( no atraviesan filtros en el humano), debido a su alto Peso Molecular. Son recicladas sin cambios fsico qumicos despus que realizaron una reaccin, hasta cumplir su tiempo de vida media.
ABZIMAS - RIBOZIMAS
Los anticuerpos naturales son protenas que unen y neutralizan a los cuerpos extraos (antgenos) que ingresan al cuerpo. Las Abzimas son anticuerpos catalticos y son enzimas catalticas artificiales capaz de ser dirigidas hacia determinado lugar. Ej. abzymas contra el cncer. RIBOZIMAS: Son ARN con funcin cataltica y son muy especficas para su S.
ENZIMAS Y COFACTORES
Muchas de las enzimas actan solas ( parte proteica pura) son llamadas APOENZIMAS Ej.Lipasas. Otras enzimas actan obligatoriamente junto a una molcula llamada COFACTOR y son llamadas HOLOENZIMAS. Los cofactores pueden ser de dos clases: A) Coenzimas B) Iones metlicos. COENZIMAS: Son molculas orgnicas de bajo peso molecular, derivadas de las vitamina B , son termoestables (resisten el calor), y son dialiazables (atraviesan filtros ). Son de dos clases: a)Transportadoras de electrones (NAD, FAD, NADP), y b) Las que transportan otros grupos qumicos ( TH4, CoA,
Lipoato).
COENZIMAS : ACCIN
1. XIDO-REDUCTASAS ( Reacciones de oxido-reduccin. Por transferencia de electrones, usan con frecuencia coenzimas como NADH, FADH2, Lipoato etc.). Ej. Succinato deshidogenasa, Citocromo oxidasa. Si una molcula se reduce, tiene que haber otra que se oxida.
2. TRANSFERASAS (Transferencia de grupos funcionales) , Ej. Glucocinasa. grupos aldehidos gupos acilos grupos glucosilos grupos fosfatos (kinasas)
3. Hidrolasas P Provocan la ruptura de enlaces por medio de una molcula de agua. E; la Lactasa.
4. LIASAS Rompe a los dobles enlaces, por eliminacion o adicion de grupos. Ej. Citrato liasa, aldolasa. Entre C y C . Entre C y O. Entre C y N. 5. ISOMERASAS Reacciones de isomerizacin. Ej. Epimerasas, fosfotriosa isomerasa. 6. LIGASAS Formacin de enlaces C-C. C-S, C-S y CN , con aporte de ATP. Ej. Piruvato Carboxilasa. Entre C y O Entre C y S ; Entre C y N , Entre C y C
SITIO CATALTICO
Est en la Enzima. Es un hueco o bolsa . En l se une el sustrato (100 a mil molculas /min.) para la reaccin. Caractersticas: Es pequeo, es un hueco (tridimensional), necesita que la enzima y el Sustrato se APROXIMEN y se ORIENTEN debidamente.
Nmero de recambio: Nmero de molculas de (Sustrato) transformados en (Producto) por las enzimas c/seg.
Dos tipos de Sitio Cataltico: a) Modelo de Fisher ( de cerradura- llave) y b) Modelo encaje inducido (KOSHLAND): El SC se modifica hasta obtener la forma del S.
MODELO INDUCIDO
CINTICA ENZIMTICA
Estudia la velocidad de una reaccin que se determina midiendo la aparicin de Productos o la desaparicin del S. V. inicial (Vo): Cuando aun no ha funcionado el 10% del total de la Enzima disponible. V.mx: Es el efecto al saturarse la Enzima por el Sustrato. Estudiada por Leonor Michaellis y Maud Menten. Concepto de Km: Equivale a la concentracin de Sustrato que produce la mitad de la V mx. Cuando el valor de Km es grande, la enzima tiene poca afinidad por su Sustrato, y a la inversa. Unidad de Actividad Enzimtica: Cantidad de Enzima Que causa la transformacin de 1.0 mol de S por Min. Actividad especfica: N de unidades de Enzima por mg de protena. Katal: Cantidad de Enzima que transforma 1 mol de S por Seg.
La concentracin de substrato (S), a la semivelocidad mxima de reaccin (V/2) se puede determinar de la figura y representa la constante de Michaelis o Km, la cual es una caracterstica para cada enzima. La inversa de Km, o 1/Km, mide aproximadamente la afinidad de la enzima por el substrato. Mientras ms pequeo sea el valor de Km, mayor ser la afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato, ste ser transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad.
3) Efecto de la Temperatura
INHIBIDORES ENZIMTICOS
Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimtica, a travs de interacciones con el centro activo u otros centros especficos (alostricos). Esta definicin excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica De esta forma, habr dos tipos de inhibidores: I. Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo II. Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la molcula, causando un cambio conformacional con repercusin negativa en la actividad enzimtica.
Otra Clasificacin
Segn su tiempo de accin los inhibidores pueden ser: a) Inhibidores Reversibles , b) Inh. Irreversibles
Inhibidores reversibles
(a) Inhibicin competitiva El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijacin del substrato: A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibicin. Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del Sustrato.
(b) Inhibicin No Competitiva El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijacin del substrato a la enzima, pero s impide la accin cataltica. (c) Inhibicin Acompetitiva El inhibidor se fija nicamente al complejo enzimavez formado, impidiendo la accin cataltica;
substrato una
Inhibidores Competitivos
Son molculas que detienen la actividad de la enzima temporalmente, pero luego la reaccin contina, generalmente por que una mayor concentracin de sustrato desalojar al inhibidor del sitio cataltico donde ste se ubic. Generalmente son bastante similares en su estructura qumica con el sustrato natural. Sustrato e Inhibidor luchan (compiten!) por ubicarse en el sitio cataltico de la enzima.
El complejo que se forma es ENZ-INH. que no es productivo y la reaccin se detiene. Afectan a la Vmax de la enzima, pero no altera su Km (su afinidad por ella).
Inhibicin competitiva
sustrato inhibidor
Enzima
Enzima
Sin inhibidor
con inhibidor
Los inhibidores competitivos son sustancias, muchas veces similares qumicamente a los sustratos, que se unen al centro activo impidiendo con ello que se una el sustrato. El proceso es reversible y depende de la cantidad de sustrato y de inhibidor, pues ambos compiten por la enzima.
Inhibicin Competitiva
S E I EI ES
Inhibicin Competitiva
E+P
1/v
0.07
0.06
100
0.05
80
0.04
60
0.03
40
0.02
20
0.01
s
0 0 20 40 60 80 100 120
1/s
0.00 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
FAD
COOCH2 COOMalonato
COOC O CH2 COOOxalacetato
COOSuccinato
Succinato deshidrogenasa
COOFumarato
Inhibidores No Competitivos
Son molculas que retrasan la actividad de las enzimas pero no se unen al Sitio Cataltico donde se une el Sustrato, se unen a un sitio diferente dentro de la enzima que recibe el nombre de Sitio Alostrico. Cuando el inhibidor ocupa el centro alostrico, tiene lugar un cambio conformacional en el centro activo que impide la fijacin del substrato. Son molculas muy diferentes qumicamente al Sustrato de la enzima. Inhibicin depende nicamente de la concentracin del Inh. Y , si aumentamos la concentracin de Sustrato ste no desaloja al inhibidor ya que la reaccin seguir detenida. Distorsionan la Km de la enzima, sin alterar la Velocidad mxima de sta.
Inhibicin no competitiva
sustrato
No se produce la catlisis
Enzima
Enzima
Sin inhibidor
Con inhibidor
inhibidor
Los inhibidores no competitivos son sustancias que se unen a la enzima en lugares diferentes al centro activo alterando la conformacin de la molcula de tal manera que, aunque se forme un complejo enzima-sustrato, no se produce la catlisis. Este tipo de inhibicin depende solamente de la concentracin de inhibidor.
S
E I S EI I
Inhibicin No Competitiva (Modo de accin)
ES
E+P
ESI
REACCION NO COMPETITIVA
REACCIN NO COMPETITIVA
Inhibidores Acompetitivos
S E ES E+P
I ESI
El inhibidor slo puede fijarse al complejo ES; el complejo ESI no es productivo.
Inhibicin acompetitiva
Inhibidores Irreversibles
Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo qumico de la enzima, modificndola covalentemente A diferencia de la inhibicin reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacin del inhibidor. Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente txicos. Algunos tipos de inhibidores irreversibles:
1. Reactivos de grupos SH 2. Organofosfricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados : Yodoacetato. : Diisopropilfluorofosfato (DPF). : In CN- que se fija al Fe++. : Hg, Ag.
SUBSTRATOS SUICIDAS
(Inhibidores activados enzimticamente)
Se trata de molculas que se unen al centro activo de manera especfica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos.
- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molcula inhibitoria en una especie qumica muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivndola. - Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivo y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles
EI
EI*
E + I*
1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional 2. La accin cataltica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I* 3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivndola de forma definitiva al igual que un inhibidor
E1 A B Z
E2 C
E3 D
El producto (Z) va inhibir a la primera enzima de la va (E1). Procesos a nivel celular; regulacin de ajuste finode la actividad enzimtica
REGULACIN ALOSTRICA
hexocinasa
Glucosa + ATP
En la regulacin por el Sustrato , cuando ste alcanza suficiente concentracin puede inhibir a la enzima que lo est produciendo (en este caso la hexocinasa de la Gluclisis.)
ENZIMA
Fosforilacin por Protein kinasas (mamferos)
ATP
Nucleotidizacin (bacterias)
ADP
ENZ P
Enz-AMP
Las enzimas pueden tener numerosos sitios de fosforilacin, especialmente en los residuos de Serina, Treo, y de Tirosilo.
ATP
Grupo Fosforilo ENZ- SER ENZ-SERPO3
H2O
Pi
PROTEIN FOSFATASAS
Control Hormonal
La actividad de estas enzimas (protenas) cinasa y fosfatasas estn bajo control hormonal y neurolgico.
Elementos de la reaccin
PROENZIMAS O CIMGENOS
Son enzimas Inactivas, porque no tienen sitio cataltico (SC). Los residuos de aminocidos estn presentes pero sin alineamiento apropiado. Se activan cuando construyen su (SC) por protelisis selectiva (ruptura irreversible o acortamiento de su molcula).
Ejemplo de proteolisis selectiva: Las enzimas digestivas del pncreas Activacin de la enzima alfa Quimotripsina otro ejemplo: Factores de coagulacin; la proinsulina.
ISOENZIMAS
Enzimas que tienen estructura o secuencias de amino cidos semejantes pero no idnticas. Tienen propiedades fsicas distintas porque difieren en la composicin de sus aminocidos. Estas propiedades fsicas diferentes es
NADH+H
Piruvato LDH
NAD
Lactato
LDH-1 tiene 4 monmeros HHHH y est en Corazn. LDH-5 tiene 4 monmeros MMMM y es del Hgado.
La isozimas de la lactato deshidrogenasa del suero se demuestran por electroforesis en gel de almidn o pH 8.6. Ellas emigran a 5 regiones diferentes. La LDH tiene 5 isozimas (LDH-1, LDH-2, LDH-3, LDH-4 y LDH5), la ms positiva electricamente es la LDH-1 y corresponde a la de 4 monmeros (H= heart). La LDH 5 es la que tiene 4 monmeros M =Muscle
Otras Isoenzimas
Ejemplo 2: Aspartato aminotransferasa (AST): La AST tiene dos isoenzimas hepticos:
AST-1 es citoslica y pasa al plasma con facilidad. AST-1 refleja cambios leves en la membrana plasmtica AST-2 es mitocondrial y su liberacin es difcil AST-2 refleja lesiones necrticas en los hepatocitos
Ejemplo 3: La CK (Creatin cinasa) que tiene tres isoenzimas: CK-MM en los msculos estriados, CK-MB en el msculo cardaco, y CK-BB en el cerebro.
2) Marcadores Pancreticos
EXOCRINOS El diagnstico diferecial entre pancreatitis aguda y otros trastornos intraabdominales con sntomas similares se lleva a cabo con las mediciones de la actividad enzimtica de amilasa srica, o urinaria, o ambas, y de lipasa y tripsina. AMILASA Se conoce un mnimo de siste isoenzimas distribuidas en saliva, jugo pancretico, leche humana; es de gran importancia para el diagnstico de pancretitis aguda, sin embargo, esta es de mayor utilidad si se cuantifica simultneamente la actividad de la lipasa y la de la isoenzima especfica pancretica. LIPASA Se ha demostrado su presencia en el pncreas y posiblemente se encuentre en el rin. TRIPSINA: En pancreatitis y en 50% de los casos de carcinoma pancretico. ENDOCRINOS: La cuantificacin de anticuerpos sricos contra la cido glutmico descarboxilasa (GAD) del pncreas en pacientes dibticos en un marcador que permite predecir y diagnotica la diabetes mellitus insulinodependiente
3) MARCADORES CARDIACOS
CREATINFOSFOCINASA (CK):
Se conocen tres isoenzimas CK B, CK-MB, CK-MM. La enzima CK es dimrica; cada una de sus subunidades se denomina M y B, y existen tres variedades de esta enzima CK-MM, CK-MB y CKBB. La fraccin de creatinfosfocinasa (CK-MM) se encuentra fundamentalmente en el msculo esqueltico, la fraccin (CK-MB), en el msculo cardiaco, y la fraccin (CK-BB), en cerebro e intestino, como sus nombres lo indican. En la actualidad, la CK-MB se cuantifica por inmunoensayos, la cuantificacin de CK-MB es la prueba de eleccin y se puede tomar muestras de suero cada dos o cuatro horas. Otras ventaja adicional de medir la CK MB es la de detectar un reinfarto, ya que su actividad enzimtica retorna a su valores de referencia a las 36 horas.
LA TROPONINA I y T : Slo se presentan en suero cuando existe necrosis cardiaca; sin embargo, la concentracin de stas permanece elevada de 3 a 14 das.
La troponina (TN) es una molcula esfrica constituida por tres subunidades diferentes. Las cuales se denominan de acuerdo con su funcin: 1) TN-T, que es la unidad que se une a tropomiosina; 2) TN I qe es la unidad inhibidora y 3) TN-C, que es la unidad que se une al calcio.
ENZIMAS PLASMTICAS
Son enzimas que estn en el plasma. De dos tipos: a) Especficas: Si el plasma es su sitio normal de actividad y ubicacin. Ej. seudocolinoesterasa, enzimas de la coagulacin sangunea, etc. b) No especficas: Su funcin no es en plasma y se encuentran accidentalmente altas en el plasma. A su vez son de dos tipos: 1. De secrecin: provienen de glndulas de secrecin exocrina. Ej. del pncreas. 2. Del metabolismo intermedio: Por dao celular o necrosis de tejidos.
ENZIMOLOGIA CLINICA
1. Conjunto de tcnicas destinadas a detectar la presencia y cuantificar la actividad de enzimas en lquidos biolgicos:
- Presencia
la alteracin * Localizacin tisular de la lesin 2. INFORMACION PRONOSTICA: * Intensidad de la lesin * Evolucin temporal de la lesin
PERFIL ENZIMTICO
En la mayora de los estudios diagnsticos y pronsticos por Enzimologa Clnica no se estudia un solo enzima. Las situaciones normales y patolgicas se describen a travs de sus perfiles enzimticos. El perfil enzimtico comprende: Los tipos de enzimas implicados La naturaleza de sus alteraciones La evolucin temporal de sus niveles
Creatina fosfokinasa total (CK), cuya funcin es regular la disponibilidad de energa en las clulas musculares.Tiene 3 isoenzimas:CK-mm,CK-MByCK-BB. La lactato deshidrogenasa (LDH) que interviene en el metabolismo anaerbico de la glucosa. La aspartato transaminasa (GOT o AST) que participa en el metabolismo de algunos aminocidos. La superoxido dismutasa.
Por el contrario, si la sospecha es de hepatitis, se determinan junto a las transaminasas los niveles de GGT, LAP y CHE.
CK-MB
Se considera diagnstica de dao miocrdico una cifra de la CK- MB deal menos el doble del valor de referencia, con posterior normalizacin. Asimismo, para sugerir dao miocrdico, la cifra de la forma MB debe ser superior al 5 o el 6 % de la CK total. El nico problema que tienen estas enzimas es que sus valores no empiezan a aumentar hasta unas 6 a 8 horas despus del inicio del infarto.
LDH
Comienza a elevarse entre las 10 y 24 horas despus del inicio del IMA y alcanza su pico a los 3-6 das, volviendo a valores normales a los 8-14 das. Es importante para el control tardo.
TRANSAMINASAS ( AST y ALT) : Un ejemplo es el msculo cardaco que es rico en transaminasas; en consecuencia, los infartos de miocardio son seguidos por incrementos rpidos y notables de la transaminasa.
U.I7L