Microcultivo.

Cortar cuadros de PDA de una caja Petri de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bistur estril y caliente. Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que est sobre una varilla de vidrio doblada en forma de V en una caja de Petri (previamente esterilizada). Tomar con el asa l inoculo del moho previamente seleccionado. Inocular por picadura en cada uno de los lados del cuadro de agar. Colocar sobre el agar un cubreobjeto y presionar ligeramente para que se adhiera al medio 6. Adicionar 5 ml de glicerol al 10% en la caja Petri. 7. Incubar la caja a 28 C durante 48 h.

Si el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, retirar el glicerol con una pipeta Pasteur. Adicionar 5 ml de formaldehdo para inactivar el moho durante 15 minutos

Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un portaobjetos que contenga una gota de azul de algodn, sellar la preparacin con barniz de uas transparente. Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodn, colocar un cubreobjetos

sobre el colorante y sellar la preparacin. Observar las preparaciones a 10X y 40X.

Auxonograma: basado en la asimilacin de H de C en presencia de O2 en un medio base sin azcares con discos impregnados con H de C. Se forma halo si la cepa estudiada asimila el azcar Zimograma: basado en la fermentacin de azcares. Se usa un medio lquido al que se aade un azcar determinado, ms un indicador de pH. Si vira el indicador, se produce cido y gas en forma de burbujas. La fermentacin del azcar es + . La fermentacin y asimilacin de compuestos de carbono son las pruebas ms utilizadas en la identificacin de levaduras. El auxonograma o capacidad de las levaduras para utilizar o asimilar diferentes compuestos de carbono es hoy da el criterio taxonmico ms aceptado

Examen directo microscpico.

Se realiza a partir de muestras obtenidas de lesiones. Es el mtodo ms simple y ms rpido para establecer un diagnstico presuntivo de micosis, ya que no necesita de incubacin. Si la muestra no es abundante hay que dar prioridad al cultivo, frente al examen directo. Preparacin de la muestra: En el caso de tejidos: cortar, trocear, machacar, etc. En el caso de lquidos: concentrar por centrifugacin. En el caso de uas: trocear, repartir en fragmentos, etc. Si son otras muestras como escamas, pelos, etc, no es necesaria una preparacin previa, sino que se hace directamente el examen

Lquidos de montaje en el lab. De micologa.

Examen Directo con Solucin Salina Colocamos una gota de la muestra lquida en un porta y aadimos una gota de solucin salina. Ponemos el cubre y observamos al microscopio con poca luz y variando el aumento. Los hongos se observan refrctiles o brillantes, ligeramente verdosos. En el caso de las levaduras pueden aparecer inclusiones. Tambin se pueden observar burbujas de diferentes tamaos. No debemos confundir las levaduras con hemates y con burbujas de aire. Se diferencian porque las levaduras presentan pequeas inclusiones en la clula y las burbujas van a ser siempre de diferentes tamaos

Hidrxido Potsico con Dimetil Sulfxido

No es necesario calentar la preparacin, de esta forma no aparecen precipitados. Las muestras de pelos, escamas y biopsias se observan con poca luz. Es importante no confundir artefactos como fibras de tejidos, granos de polen, etc, con hongos. Otra causa de error es lo que se denomina hongos en mosaico, que suele aparecer cuando las muestras estn muy queratinizadas. Suelen ser acmulos lipdicos que desaparecen cuando se calienta la preparacin. Colocamos la muestra en pequeas porciones sobre un porta y aadimos varias gotas de KOH + Dimetil y ponemos el cubre. Observamos los elementos fngicos (hifas, levaduras, etc). Si la muestra observada son uas muy queratinizadas, el tiempo que acta del KOH es de varias horas. Es conveniente dejar el porta en una cmara con ambiente hmedo (placa de petri con un algodn empapado en agua dentro).

Azul Algodn de Lactofenol Se realizan las preparaciones a partir de cultivos. El fenol destruye la flora acompaante y organismos; el cido lctico conserva las estructuras fngicas y el azul algodn tie la quitina de las paredes fngicas. Aadimos una gota de la muestra o una porcin del hongo en un porta. Sobre ella colocamos una gota de azul algodn y ponemos el cubre. Observamos al microscopio. Blanco de Calcofluor

Se realiza un examen directo sea cual sea la muestra. Es til en cortes de tejidos. Colocamos en un porta la muestra + 1 gota de KOH dimetil sulfxido + 1gota de calcofluor. Mezclamos y ponemos el cubre. Despus de varios se ha producido la clarificacin, y se observa en un microscopio de fluorescencia (verde brillante o blanco azulado). Las fibras elsticas y colgeno se observan con fluorescencia amarillo verdosa. Estas se pueden confundir con hongos y levaduras y se diferencian en la fluorescencia. Hay algunos hongos (hongos dematiaceos) que producen enfermedades como micetomas que se tien con gran dificultad usando el blanco de calcofluor.
Colorante de Cobre ( tinta parker-KOH) Para el diagnstico de Malassecia furfur se tien intensamente de color azul. La tinta china se utiliza en muestras de LCR y exudados. La usamos siempre que busquemos Criptococcus neoformans. La tcnica consiste en aadir 1gota de tinta china junto con 3 gotas de la muestra, dejar reposar, apareciendo un color marrn (la cpsula se rodea con un halo blanco).

Mtodos de tincion.
Tincion de Gram Se realiza para la identificacin de hongos. Suelen ser Gram+ y la nica consideracin a tener en cuenta es que el cristal violeta hay que mantenerlo por ms tiempo. Fundamento: Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena) Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.

Primer colorante: violeta cristal Gram +: Colorante violeta cristal se queda en la celula no puede traspasar la pared Gram -: Colorante violeta cristal se intercambia por alcohol blanco. Segundo colorante: fucsina basica Gram +: violeta+fucsia violeta Gram -: blanco+fucsia fucsia Tincion de cpsulas Primer colorante: fucsina basica: tie todo menos la capsula Segundo colorante: nigrosina: tie el medio capsula queda contrastada en blanco. Tincion de esporas Primer colorante: verde de malaquita: tie las esporas Segndo colorante: fucsinna basica: tie el resto de la celula se observan endosporas dentro de la celula.

Tincin de giemsa.

Fundamento Estos organismos adquieren una coloracin diferencial y se ven dentro del citoplasma de la clula husped. La tcnica de Giemsa est formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte bsico y la eosina como tinte cido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromtico, de ah que muchas estructuras se tian de prpura y no de azul. El pH de la solucin de coloracin es crtico y se debe ajustar idealmente segn diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9. Procedimiento Desparafinar e hidratar. Aplicar solucin de trabajo de Giemsa durante 10 minutos. Deshidratar con alcohol absoluto, 3 cambios. Aclarar con xilol, 3 cambios. Resultados Citoplasma: rosa Ncleos: azul Eritrocitos: rosa - naranja Grnulos de las clulas cebadas: prpura Bacterias: azul Parsitos: azul

Tincin de Wright

Fundamento La tincin de Wright es una tincin de tipo Romanowsky. Una tincin de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidacin, as como eosina Y o eosina B. La accin combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloracin prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y. Las propiedades de tincin de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras qumicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de cidos nucleicos, las protenas de los ncleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante bsico. La eosina Y, colorante cido, se fija a los agrupamientos bsicos de las molculas de hemoglobina y a las protenas bsicas.

Tincin acido-alcohol resistente.

Fundamento Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tincin de contraste. El procedimiento es el siguiente:

desparafinar e hidratar los cortes cido peridico 5%, 10 min lavar con agua destilada fucsina fenicada, 15 min decolorar en alcohol cido al 50% lavar con agua destilada hematoxilina, 10 min azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio deshidratar, aclarar y montar preparaciones

Tincin hematoxilina-eosina

Fundamento: La tincin hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tincin hematoxilina y eosina es uno de los mtodos mas populares de tincin utilizado en histologa y medicina diagnostica. El mtodo supone la aplicacin de la tincin de hematoxilina, que por ser catinica o bsica, tie estructuras cidas (basfilas) en tonos azul y purpura,como por ejemplo los ncleos celulares; y el uso de eosina que tie componentes bsicos (acidfilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aninica o cida, como el citoplasma. Tcnica

Sumergir los preparados histolgicos en xilol para eliminar los excesos de parafina. El xilol es un alcohol algo txico, pero existen reactivos (como el Hemo-D) que ejercen la misma funcin aclarante de parafina sin la toxicidad del xilol. Luego pasan por una serie de alcoholes en concentracin decreciente para rehidratar la muestra (100. 95 y 70). Se lava en agua para eliminar exceso de alcohol Se sumerge en hematoxilina por 10 minutos, luego se lava en agua para eliminar excesos y se pasa rpidamente por alcohol cido. Se lava nuevamente Se sumerge 30 segundos en eosina. Se pasa por otra serie de alcoholes,esta vez en orden creciente(70, 95 y 100) para deshidratar la muestra y que se pueda realizar el montaje con un pegamento no soluble en agua. Finalmente se deja remojar 10 minutos en xilol, antes de realizar el montaje final.

Tincin de acido peridico de shiff (PAS)

La tcnica de Schiff, es una reaccin colorimtrica que se usa comnmente en citoqumica. Utiliza PAS, cido perydico de Schiff, o leucofucsina, un colorante incoloro pero que se torna rojo estable al contacto con los grupos aldehdos. La tcnica de PAS se utiliza en los preparados para microscopia ptica, permite la tincin de componentes celulares que contienen hidratos de carbono, por ejemplo algunas membranas celulares, clulas caliciformes en la mucosa del intestino, fibras reticulares que estn rodeados por hidratos de carbono, etc. Entonces en esta tcnica, el cido peryodico oxida a los grupos oxidrilos (OH) de dos carbonos cercanos, formando de esta manera grupos aldehdos compuestos por carbono, oxigeno y hidrogeno. as la leucofucsina puede reaccionar con estos y dejar una tincin rojiza.

Se emplea para determinar la presencia de molculas como el glucgeno, glucoprotenas y glucosaminoglucanos. Lo que hace es romper la unin de los anillos de las hexosas formando grupos aldehdo o rompen los enlaces de las hexoaminas de los glucosaminoglucanos, tambin formando grupos aldehdo y hacindolos reaccionar a estos grupos con el reactivo de Schiff. Tambin sirve para identificar membranas basales y fibras reticulares.

Plata metanamina de Gomori

La plata metanamina de Gomori es un mtodo de tincin especial ms empleado para hongos. La reaccin tintorial est basada en que, en presencia de cido perydico, los polisacridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehdos; stos, a su vez, reducen el complejo nitrato-plata metanamina (o metenamina) produciendo una coloracin de caf a negra, debido al depsito de plata reducida en los lugares de localizacin de los aldehdos. Tambin se utiliza para la identificacin de la melanina. Este pigmento es producido en la piel por los melanocitos. En los humanos la melanina se encuentra en piel, cabello, en el recubrimiento de la retina. Aunque los seres humanos generalmente poseen una concentracin similar de melanocitos en su piel, estos expresan en algunos individuos y en algunas etnias ms frecuentemente el gen productor de melanina, por lo que se confiere una mayor concentracin de melanina en la piel.

Procedimiento

Debe evitarse, durante todo el proceso, el uso de instrumentos metlicos, ya que la plata precipitara sobre ellos.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Desparafinar e hidratar. Aadir cido perydico 0,5%, 12 minutos. Lavar con agua destilada. Sumergir los cortes en la solucin de plata metanamina, 1 hora mnimo a 60 C; a partir de este tiempo comprobar regularmente al microscopio. Lavar con agua destilada. Aadir cloruro de oro, 1 minuto. Lavar con agua destilada. Aadir tiosulfato sdico 3%, 1-2 minutos. Lavar con agua corriente. Tincin de contraste (rojo nuclear, hematoxilina, verde luz...), 1 minuto. Deshidratar, aclarar, montar.

Mucicarmina de Mayer

Las mucinas o mucoprotenas son protenas con H.C. en una proporcin superior al 4 %. La tcnica del mucicarmn de Mayer sirve para identificar globalmente las mucinas, pero no reconoce su naturaleza bioqumica.

1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min.

6 - Solucin diluida de mucicarmn ( 1:4 ) 30 min.

7 - Lavar con agua corriente 10 min. 8-Deshidratar. Alcohol de 70 Alcohol de 96. Alcohol absoluto. Xilol. 9- Montaje.

3- Lavar en H2O destilada.

4- Teir con Hematoxilina de Weigert 10 min. 5 - Lavar con agua corriente 3 min.

Tincin de toluidina.

Colorante que tie estructura basfilas, tales como la cromatina. Se puede comportar como colorante ortocromtico (tie de color azul) o metacromtico (tie de color violeta-rojo), dependiendo del pH y de la naturaleza qumica de la sustancia teida. Como colorante ortocromtico, se usa frecuentemente para teir tejido nervioso, donde tie la heterocromatina y los grnulos de Nissl (acmulos de cisternas de retculo endoplsmico rugoso de los somas neuronales, as como las fibras nerviosas amielnicas y clulas de gla. Tambin se utiliza para la tincin de cortes semifinos. El azul de toluidina tie metacromticamente las estructuras ricas en proteoglucanos sulfatados, como el heparn sulfato, presente - por ejemplo - en el cartlago joven (condroblastos y matriz inmadura) y en los grnulos de las clulas cebadas

Azul de alcian
se ha comprobado que usando el azul alcin en condiciones de pH en torno a 2,4 -2,6 se colorean los mucopolisacridos cidos sulfatados y los carboxlicos. Si por el contrario se emplea a un pH muy bajo, en torno a 1, slo se colorea los mucopolisacridos sulfatados, los carboxlicos no se tien. Si se sigue disminuyendo el pH hasta 0,5 se incrementa la selectividad de la tincin y en este caso slo se tien los mucopolisacridos fuertemente sulfatados

Modo de operar: Desparafinar e hidratar. Tratar con la solucin deseada de azul alcin durante 30 min. Si se us la solucin a pH 2,5, lavar con agua (d) ; si se us cualquiera de los otros dos, secar slo con papel de filtro. Contrastar si se desea con rojo nuclear. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: Azul alcin a pH 2,5 los mucopolisacaridos cidos (carboxilos y sulfatos) se tien de azul. Azul alcin a pH 1 slo se tien de azul los mucopolisacaridos cidos sulfatados. Azul alcin a pH 0,5 slo se tien de azul los mucopolisacaridos cidos fuertemente sulfatados