LOGO

TCNICAS MODERNAS EN MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Lina Mara Lpez de vila, MSc. Docente Escuela de Microbiologa Universidad de Antioquia

METODOLOGAS MODERNAS

Rpidos

Inmunolgicos

Moleculares

Biosensores

Mtodos rpidos
Cualquier mtodo para la deteccin, recuento, caracterizacin y subtipificacin de microorganismos mediante el cual se obtienen resultados de manera sencilla, fiable y en menor tiempo que con los mtodos convencionales.

Rapidez
Exactitud Bajo costo Facilidad de uso Aceptabilidad

Medios cromognicos y fluorognicos

Mtodos de cultivo modificados

Basados en bioqumica

Medios de cultivo cromognicos o fluorognicos

Enumeracin de coliformes fecales y E. coli Enumeracin de microorganismos patgenos: Salmonella, L. monocytogenes, S. aureus

Sustrato: carbohidrato, aminocido, fosfato Cromgeno o fluorogno: derivados de indolil o sustratos 4-metilumbeliferil

Cromgeno / fluorogno 5-Bromo-4-cloro-3-indoxil 5-bromo-3-indoxil 5-bromo-6-cloro-indoxil 6-cloro-3-indoxil N-metilindoxil 2-Nitrofenil 4-metilumbeliferil

Nombre comercial X Lapis Magenta Salmon Green ONP MU

Color /fluorescencia Azul turquesa a verde menta Azul Morado a magenta Rosa a salmn Verde Amarillo Azul (UV 365 nm)

ELF

ELF

Bajo luz UV verde (377 nm)

Sustrato
-D-glucuronido -D-galacto-piranosido -D-glucopiranosido N-acetil--D-glucosamida Myo-inositol-1-fosfato Fosfato

Microorganismo
E. coli Enterobacterias, coliformes Klebsiella spp, enterobacter spp. Candida albicans B. cereus, Listeria sp. S. aureus

Cromognico
si Si Si Si

Fluorognico
Si No No Si

Si
Si

Si
Si

E. Coli /Coliformes
Chromocult

E. Coli O157:H7
BCM E. coli O157:H7 Flourocult E. coli O157:H7 Agar O157:H7 IDMedium Rainbow agar O157

Salmonella spp.
Rambach agar

S. aureus
CHROMagar S. aureus S. aureus ID Agar

L. monocytogenes BBL CHROMagar Listeria RapidL. mono

Grupo Bacillus cereus BCM R&F Bacillus anthracis agar

RAPIDE. coli 2

SM ID medium

CHROMagar E. coli EMX-Agar TBX agar Coli ID medium

CHROMagar SMS BBL CHROMagar Salmonella

Agar ALOA LIMONO-IdentAgar

E. coli O157:H7 No fermentacin de sorbitol

No posee -D-glucuronidasa
S. aureus Reduccin de telurito Proteolisis albmina L. monocytogenes Deteccin de fosfolipasa C No fermentacin de xilosa Salmonella spp. Deteccin de Caprilato esterasa y -glucosidasa

Mtodos de cultivo modificados

Mtodos de cultivo modificados

Nmero mas probable

Simplate Tecnologa de deteccin binaria, mltiples enzimas. Requiere menos microorganismos para generar cambios de color.

Tempo

Mtodos bioqumicos

Impedancia Resistencia al paso de una corriente alterna a travs de un material conductor. El metabolismo microbiano cambia este parmetro elctrico. El tiempo de deteccin es inversamente proporcional al numero de bacterias en la muestra.

Recuento de viables Pruebas de esterilidad Deteccin y cuantificacin de indicadores Screening de patgenos

Monitoreo ambiental
Screening de compuestos antimicrobianos

Bioluminiscencia
ATP indicador de viabilidad celular

Inmunoensayos
Permiten la deteccin de: Clulas intactas, toxinas, productos metablicos.

No permiten la diferenciacin de clulas vivas y muertas.

Condiciones de stress generan expresiones aberrantes de antgenos.

Anticuerpos policlonales Anticuerpos monoclonales

Resultados presuntivos

Separacin inmunomagntica Partculas magnticas cubiertas con Ac 1. La suspensin del alimento se mezcla con las partculas magnticas 30-60 min 2. El complejo magntico es puesto en un separador magntico. 3. El complejo magntico es lavado varias veces con un buffer para eliminar contaminantes 4. Las clulas son eluidas para posteriores anlisis.

Inmunoensayos

Sistemas de flujo lateral - inmunocromatografa

Ensayo tipo sandwich en una membrana porosa (nitrocelulosa) Anticuerpo de captura Anticuerpo de deteccin

Singlepath
DuPont Lateral Flow System

RapidChek SELECT

Ensayo inmunoabsorbente asociado a enzima (ELISA)

Peroxidasa Perxido de hidrogeno(Fenilendiamina) Fosfatasa alcalina P-nitrofenilfosfato

-Galactosidasa O-nitrofenil-B-D-galactopiransido

Indirecta

Sandwich
Inhibicin competitiva

LOCATE Biopharm
3M Tecra

RIDASCREEN Campylobacter

Mtodos basados en bacterifagos

Especificidad de los bacterifagos IMS con protenas recombinantes

Genes

Condiciones cultivo

FENOTIPO

Condiciones ambientales

Cepas particulares

MTODOS MOLECULARES

Aplicacin Deteccin directa de patgenos

Ventajas No requiere cultivo

Problemas Puede detectar clulas muertas. Inhibicin por componentes del alimento. Sensible a contaminaciones en el laboratorio

Confirmacin a partir de pre-enriquecimiento

Rpido y sensible Posible automatizacin No se afecta por la microbiota acompaante Identifica cepas virulentas y no virulentas Caracterizacin mltiple Identificacin de organismos genticamente modificados

Caracterizacin de patgenos Otras aplicaciones

Aspectos importantes

1.

Preparacin de la muestra

Componentes del alimentos pueden afectar la sensibilidad del mtodo. Calcio, grasas, glicogeno, compuestos fenlicos, enzimas. Falla en la lisis celular Captura y degradacin de cidos nucleicos Inhibicin de la polimerasa

Eliminacin de inhibidores Filtracin Adecuada extraccin de ADN Separacin inmuno magntica (IMS)

Pre-enriquecimiento de la muestra

Aspectos importantes

2.

Blanco molecular

Presente en la clula en alto numero de copias. Suficientemente heterlogo. Genes RNA ribosomal (rRNA) Genes de virulencia Genes codificantes de toxinas Genes involucrados en el metabolismo celular

Aspectos importantes

3. Tipo de metodologas Basadas en PCR Amplificacin isotrmica Basadas en hibridacin Electroforesis en campo pulsado Ribotyping Microarreglos

Metodologas basadas en PCR

Metodologas basadas en PCR

PCR tradicional
Amplificacin de una secuencia blanco y visualizacin por electroforesis en gel de agarosa.

Cuantificacin de punto final

Posibilidad de contaminacin

PCR mltiple

PCR anidada

Metodologas basadas en PCR

PCR en tiempo real
Fragmento amplificado Sistema de deteccin Cuantificacin absoluta vs. Cuantificacin relativa

Agentes fluorescentes No especficos No reconocen secuencias especificas Union al ADN - Intercalantes - Unin al surco menor La fluorescencia aumenta con la cantidad de producto amplificado Dmeros de primers

Curva de melting (Tm)

Curva de melting Evaluacin rango de temperaturas (60-90C) La fluorescencia disminuye gradualmente hasta que desaparece totalmente

Agentes fluorescentes Especficos Sondas especificas marcadas con fluoroforos Taqman Molecular beacons Scorpions

Sondas TaqMan

Sondas de hidrlisis

Actividad exonucleasa 5de Taq polimerasa

Reportero Quencher TaqMan = PacMan

Molecular beacons

Sondas de hibridacin en horquilla

Bucle: 18-30 pb complementario a la

secuencia blanco Tallo: 5-7 nt complementarios entre si 5fluoroforo 3qencher

Primers Scorpions

Primer unido covalentemente a una sonda

PCR en tiempo real

Equipos

Sistemas comerciales

Kit

Formato
Convencional
Tiempo real Tiempo real Tiempo real

Bacterias
Salmonella, E. coli 0157:H7, L. monocytogenes, Campylobacter Listeria, Salmonella, E. coli L. monocytogenes, Campylobacter, Salmonella Campylobacter, E. coli, L. monocytogenes

Casa comercial
Qualicon
Roche QIAGEN Applied BioSystems BioRad

BAX
LightCycler Foodproof Mericon TaqMan IQ-Check R.A.P.I.D LT

Tiempo real

L. monocytogenes, Salmonella, E. coli

Idahotech

Metodologas basadas en PCR Genotipificacin

RAPD (DNA polimrfico amplificado aleatoriamente) Primers arbitrarios (10 pb) de baja astringencia Patrn de bandeo nico para cada cepa AFLP (Polimorfismos en longitud de los fragmentos amplificados)

Metodologas basadas en hibridacin

FISH (Fluorescent in situ hybridization) Identificacin de rRNA con sondas marcadas con fluorocromos Deteccin por epifluorescencia Limite de deteccin 104 UFC/ml

Ribotyping
Reconocimiento de genes ribosomales Procariotas: 5S, 16S y 23S rRNA RFLPs de genes rRNA

1. 2.

3.

Purificacin y digestin de DNA genmico Electroforesis en gel de agarosa Southern blot

Micro arreglos
Coleccin de molculas biolgicas sobre soporte solido.

BIOSENSORES
Dispositivos analticos que combinan sistemas de reconocimiento biolgico con sealizacin fsica o electroqumica.

Alta sensibilidad, selectividad y reproducibilidad Fcil manejo, bajo costo

Corto tiempo de anlisis

Resultados en tiempo real Fcil automatizacin

Tejidos
Microorganismos Bioreceptor (Reconocimiento) Organelas Clulas Enzimas Anticuerpos cidos nucleicos

Biosensores
ptico Transductor (Seal medible) Electroqumico Termomtrico Piezoelctrico Micro mecnico

CLASIFICACIN