Tcnicos Analises Clinicas

dhywarks@hotmail.com

VETORES DE CLONAGEM PCR SEQUENCIAMENTO

 1970 - The Beginning of the Revolution

Descoberta de uma enzima de restrio em bactria

Haemophilus influenzae

1973 - ligao de fragmentos obtidos pela

clivagem com enzimas de restrio e ligao dos

mesmos com a enzima T4 DNA ligase (COHEN e

cols., 1973)

FENOMENO DE RESTRIO MODIFICAO

PRINCIPAIS CONCEITOS
CLONAGEM GNICA: isolamento, amplificao e purificao de um gene ou de genes, a partir do material gentico de um dado organismo

VETORES: veculos de clonagem que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em uma clula hospedeira adequada

CLULA HOSPEDEIRA: clulas de fcil manipulao, crescimento rpido e constituio gentica bem conhecida - ex: bactrias, leveduras, clulas de cultura de tecidos de mamferos e insetos

OBJETIVOS
DESENVOLVIMENTO DE MODELOS PARA: Estudo da estrutura/funo de genes Estudo da estrutura/funo de protenas

Produo de protenas recombinantes (importncia mdica) Produo de organismos transgnicos

Melhoramento Gentico
Clonagem teraputica Clonagem reprodutiva

COMO FAZER???....
Isolamento Amplificao Digesto Purificao do Fragmento alvo

Clonagem em vetores
Transformao de clulas hospedeiras e seleo dos clones

Replicao
Anlise Expresso do DNA e da protena

ROMPIMENTO DAS BARREIRAS ENTRE AS ESPCIES

Possibilidade de reunir num s organismo qualidades de seres diferentes: ITAKURA e cols. (1977): conseguiu produzir interferon humano em Escherichia coli MULLIGAN e BERG (1980): xito obtido na expresso de genes bacterianos em clulas de mamferos

CLONAGEM GNICA

Gerar grande nmero de cpias de um determinado DNA alvo

Insero de fragmentos de DNA em vetores Replicao de vetores contendo o inserto Recuperar (purificar) os fragmentos dos vetores

CLONAGEM GNICA
1. Clivagem do vetor e do DNA com enzimas de restrio
2. Ligao do vetor ao inserto 3. Replicao do vetor em clulas competentes

4. Purificao do inserto

CARACTERSTICAS DOS VETORES DE DNA

Origem de replicao, que permite que sua replicao independentemente do cromossomo hospedeiro

Marca de seleo, que permite que as clulas contendo o vetor

e o DNA inserido neste - sejam facilmente identificadas

Stios nicos para uma ou mais enzimas de restrio permite que os fragmentos de DNA sejam inseridos em um local definido dentro de um vetor, com as outras pores intactas

CARACTERISTICAS DOS VETORES DE DNA

DIGESTO DO ALVO DO VETOR

TIPOS DE VETORES EM BIOLOGIA MOLECULAR

VETOR PLASMDEO BACTERIFAGO COSMDEOS

HOSPEDEIRO Bactria Bactria Bactria

TIPO DE CLONAGEM Genmica / cDNA Genmica / cDNA genmica genmica

TAMANHO DO INSERTO 5-10kb <20kb <50kb 100-1000kb

CROMOSSOMOS levedura ARTIFICIAIS

PLASMDEOS

PLASMDEOS

pequenas molculas de DNA de cadeia dupla contm os elementos necessrios sua replicao

um gene que confere resistncia a um antibitico

Podem estar presentes em duas ou mais cpias na clula

podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases)

PLASMDEOS

plasmdeos, sendo capazes de amplificar o segmento de DNA neles inserido, so utilizados como vetores de clonagem

Para isso, tm que possuir certas propriedades

PLASMDEOS
Mltiplos Stios de Clonagem - locais nicos de clivagem para endonucleases de restrio - stio de insero no vetor de clonagem um gene que codifique uma substncia que possa distinguir uma clula transformada de uma no transformada - resistncia a um antibitico - clulas que possuem o gene so capazes de crescer em meios com o antibitico enquanto que as restantes no sobrevivem

ter uma origem de replicao - sequncia de DNA que

permite a replicao do vetor na clula hospedeira;

CLONAGEM EM PLASMDEOS

Plasmdeo apresentando: origem de replicao (ori), gene que confere resistncia a um antibitico - ampicilina e stio(s) de restrio (stio de

restrio para a EcoRI), que pode ser usado para

inserir fragmentos de DNA O DNA inserido ligado ao vetor e os plasmdeos recombinantes so transformados em

bactrias
As bactrias so plaqueadas em meios contendo o antibitico para o qual o plasmdeo confere resistncia, como forma de selecionar as bactrias

resistentes (transformadas)
Desenvolvem-se colnias de bactrias com o plasmdeo recombinante

CLONAGEM EM PLASMDEOS

BACTERIFAGOS

BACTERIFAGOS

BACTERIFAGOS
bacterifago que se comporta como um vrus da E. coli

uma partcula viral constituda por protenas e DNA em igual quantidade, que se apresenta como uma molcula linear de cadeia dupla

injetado na clula hospedeira - particularidade das suas extremidades (stio cos) serem de cadeia simples, constitudas por cerca de 12 nucletidos que, sendo complementares na sequncia de bases, permitem ao DNA adquirir uma forma circular antes da sua insero.

O genoma do fago codifica para 50 protenas, aproximadamente.

CLONAGEM EM BACTERIFAGOS

O vetor contm um stio de restrio (EcoRI) para insero do DNA clonado Adicionalmente, stios cos, para empacotar o DNA nos fagos nas extremidades do vetor de DNA - necessrio para lisogenia DNA inserido ligado ao vetor e as molculas recombinantes so empacotadas nos fagos fagos recombinantes so usados para infectar bactrias como a E. coli Cada fago recombinante, que carrega um fragmento nico do DNA clonado, forma uma placa nica no interior da cultura bacteriana

CLONAGEM EM BACTERIFAGOS

COSMIDEOS

CLONAGEM EM COSMDEOS
Ultrapassa algumas limitaes da clonagem em fagos e plasmdeos No fago , os fragmentos de DNA a serem inseridos no podem ultrapassar os 15 kb na maior parte das vezes, os genes so maiores (35 a 40 kb) o que torna impossvel a sua insero

Os cosmdeos so assim, plasmdeos (com origem de replicao e genes que conferem resistncia a antibiticos), que contm um fragmento de DNA do fago incluindo o local cos

Utilizados como veculos de clonagem molecular

As enzimas de empacotamento reconhecem dois locais cos com distncia de 35 a 49 kb, o que limita o tamanho dos fragmentos passveis de serem empacotados.

O DNA clivado com enzima de restrio que produz grandes fragmentos de DNA que
vo se ligar ao cosmdeo anteriormente clivado com enzima semelhante.

CLONAGEM EM COSMDEOS

Situao ideal - cada fragmento de DNA genmico possui um local cos nas

extremidades que, durante o empacotamento, vo ser reconhecidos por

enzimas

Uma vez injetado no interior da clula hospedeira, vai circularizar e replicar como um plasmdeo normal, sem exprimir qualquer funo do fago, sendo igualmente reconhecido com base na resistncia adquirida a um antibitico especfico

COSMIDEOS

CLONAGEM EM COSMDEO

VETORES DE EXPRESSO

Permite no apenas aumentar o nmero de cpias de um determinado fragmento, como

os vetores de clonagem, mas tambm o produto desse fragmento clonado

vetor de expresso deve apresentar:

Promotor forte e eficiente para produzir elevadas quantidades da protena desejada e de baixo nvel basal para evitar toxicidade;

Terminador a fim de evitar a trascrio no desejada

Sequncia para o inicio da traduo

Repressor para evitar a produo de protena em quantidades txicas;

 A insero do DNA recombinante em clulas hospedeiras pode ser efetuada de diferentes maneiras

Uma delas transformao

consiste na formao de clulas competentes efetuado um tratamento com cloreto de clcio antes da transformao - Normalmente, a carga negativa do DNA (devido

ao fosfato) repelida pela carga negativa da membrana das

bactrias (devido aos fosfolpidos), assim, o on Ca

bactria

2+

neutraliza

estas foras, facilitando a entrada do DNA de interesse nas

BIBLIOTECA GENMICA

BIBLIOTECA GENMICA
Atualmente, os vetores mais utilizados na construo de

bibliotecas genmicas so fagos e cosmdeos

Em ambos os casos, fragmentos grandes de DNA obtidos por fragmentao aleatria, ligam-se ao DNA do vetor para poderem ser empacotados em partculas de fago .

BIBLIOTECA GENMICA
Bibliotecas construdas com vetores so armazenadas e propagadas na forma de
fagos recombinantes

Estes vetores possuem um fragmento central limitado por dois fragmentos essenciais

O fragmento ou brao esquerdo, codifica as protenas da cpsula, e o brao (fragmento) direito, tem a origem de replicao do fago e promotores de outros genes essenciais

Entre o fragmento central e os dois braos esto os stios de restrio usados na clonagem,

A extremidade de cada brao apresenta um segmento de cadeia simples (cos).

Estes segmentos so complementares entre si, permitindo assim a recircularizao da molcula e consequente replicao do fago dentro da clula hospedeira.

BIBLIOTECA GENMICA

Vetor de substituio
Fragmentos clonados so ligados aos braos do fago, previamente preparados com a enzima, a mistura empacotada in vitro em partculas virais Para selecionar apenas os fagos recombinantes, estes so infectados numa bactria lisognica A suspenso de fagos resultante pode ser armazenada durante vrios anos em frigorfico, com algumas gotas de clorofrmio para prevenir crescimento

bacteriano

BIBLIOTECA GENMICA
Em cosmdeos, as partculas virais servem apenas como veculos para introduzir o DNA recombinante dentro da bactria e uma vez dentro dela o cosmdeo comporta-se como um plasmdeo grande Os cosmdeos podem aceitar inseres de cerca de 45 kb, quase 2 vezes o tamanho das inseres clonveis em um fago

APLICAES

Hormnio de crescimento

Insulina humana
Vacina da hepatiteB Hormnios sexuais

CLONAGEM REPRODUTIVA

CLONAGEM TERAPUTICA

The End
Dhywarks@hotmail.com