Resumen

DNA total

DNA de plasmidio
DNA de fagos

Aislamiento de DNA de bacteria

Las bacterias se cultivan en medio favorable a temperatura ptima Se lisan las clulas y se libera el contenido Tratamiento del extracto celular para remover todos los componentes excepto el DNA Se concentra la solucin de DNA

DNA Purification > Total Cell

Crecimiento de la bacteria
Crecimiento de medio lquido
Medio definido Medio complejo

Crecimiento en medio slido

Monitoreo del crecimiento

Growth can be monitored by optical density

Monitoreo del crecimiento

Growth can be monitored by optical density

Separacin de clulas
Colecta de clulas
Centrifugacin

Monitoreo del crecimiento

Preparacin del extracto celular
Las clulas deben lisarse para liberar el DNA

Mtodos Fsicos
Fuerza mecnica es aplicada para romper la pared y la membrana Mortero, sonicacin

Mtodos Qumicos
Ataque qumico a la pared y membrana celular Pared- lisozima, EDTA o ambos Membrana- detergente (SDS)

Lisis celular

Rompimiento de la pared
La lisozima digiere los polisacridos, componentes estructurales de la pared EDTA (tetraacetato de etilenediamina) enlaza iones de magnesio esenciales en preservar la estructura de la clula e inhibe las enzimas que pueden degradar el DNA

Rompimiento de la membrana

SDS es un detergente que remueve las molculas de lpidos

DNA Purification > Total Cell > Breaking Cell

DNA Purification > Total Cell

Centrifuge removes insoluble cell debris

Purificacin del DNA

Adems del DNA, todava se encuentran una gran cantidad de protenas y de RNA La remocin de stas es importante para evitar interferencia en el anlisis

Remocin de protenas y RNA

Extraccin orgnica
Adicin de fenol fenol/cloroformo Se precipitan las protenas; formacin de una capa blanca en la interfase entre la capa orgnica y la acuosa Se remueve la solucin acuosa

DNA Purification > Total Cell > Purification

Organic Extraction

Extraccin orgnica
Qu tal si hay un exceso de protenas?
Se repiten las extracciones con fenol
No favorable; destruccin del DNA con el movimiento

Rompimiento con proteasa antes de la extraccin

Pronasa o proteinasa K

Extraccin orgnica
Parte del mRNA es removido con el tratamiento a fenol.

El remanente del RNA puede ser digerido con ribonucleasas (si es necesario).

DNA Purification > Total Cell

Concentration of DNA

Extraccin por Silica

Guanidium thiocyanate
Desnaturaliza el material que no es DNA Hace que el DNA se enlace a las partculas de silica

Se aade silica directamente o la muestra se pasa por una columna de silica Remocin de DNA al aadir agua

DNA Purification > Total Cell > Purification

Purificacin de DNA con partculas de silica

Extraccin de DNA de otros tipos de clulas

Clulas vegetales: alto contenido de carbohidratos
Lisozima no tienen efecto Se aade CTAB (cetylmethylammonium); se une a los cidos nuclicos y los precipita Se centrifuga y se remueve el sobrenadante

Clulas animales: no tienen pared, lisan con SDS

DNA Purification > Total Cell

Purification of Plant DNA

DNA de plasmidio
Se crece la bacteria y se colecta

Se rompen las clulas y se libera el contenido

Se trata el extracto celular para remover todos los componentes excepto el DNA de plasmidio Se concentra la solucin de DNA

DNA de plasmidio
Separacin basada en diferencias entre el plasmidio y el DNA bacterial
tamao- plasmidios son mucho ms pequeos

Separacin por tamao

En orden de maximar las diferencias, rompimiento mnimo del DNA bacterial Cuando el rompimiento es mnimo, el DNA formar parte del debris celular

Rompimiento mnimo se logra utilizando tcnicas de rompimiento suave

Rompimiento suave de la clula

Tratamiento con lisozima y EDTA en presencia de sucrosa evita el rompimiento inmediato Al formar esferoplastos, la clula puede lizarse con la adicin de detergentes no-onicos

DNA Purification > Plasmid DNA

Separacin basado en conformacin

Separacin por el superenrollamientode pequeos plasmidios circulares

Separacin basada en conformacin

Rango de pH ms estrecho cuando el DNA superenrrolladoes desnaturalizado y el DNA regular no. Se usa un lisado claro
Al aadir base; DNA regular es desnaturalizado Al aadir cido; DNA regular es una masa enredada El DNA enredadoes pellet

DNA Purification > Plasmid DNA

Separacin basado en conformacin

DNA superenrrollado tambin puede ser separado del DNA regular utilizando bromuro de etidio en asociacin con un gradiente de densidad con cloruro de cesio (CsCl)

Separacin basado en conformacin

Bromuro de etidio se enlaza a DNA normal, pero slo en cantidad limitada a DNA superenrrollado Este enlazamiento causa un movimiento en la banda de DNA normal

DNA Purification > Plasmid DNA

DNA Purification > Plasmid DNA

DNA de fagos
El DNA de fagos puede estar fuera de la clula; no hay que comenzar con un extracto celular Al centrifugar el cultivo, la bacteria estar en el pellet y el fago en suspensin

La dificultad es obtener una concentracin grande de fagos por ml de cultivo

Para obtener ttulos altos

El fago debe estar en fase ltica

Los fagos deben infectar la baceria al m omento justo en el ciclo de crecimiento

Purificacin de DNA fagos

Los fagos pueden ser precipitados con glicol de polietileno (PEG) Centrifugar. Descartar el sobrenadante. Redisolver. Purificar por gradiente de densidad de CsCl.

www.dpo.uab.edu/~jglinvil/JS572web S572,FL06,MPurifyDNA.pdf