流式细 胞术简

介
中心实验室

陈家梁
 流式细胞术发展史

• 1953 年 Croslannd-Taylor 应用分层鞘 流原

理，成 功设计红 细胞光学自 动计数器
• 1969 年 Van Dilla 及其同事在 Los Alamos,
NM 发明第一台 荧光检测细 胞计
• 1972 年 Herzenberg 研制出 细胞分选器
• 1975 年 Kohler 等提 出单克隆抗 体技术，为
细胞研 究提供大 量的特异免 疫试剂
• 大量厂 家不断生 产流式细胞 仪
 流式细胞仪 主要厂家

– Beckton Dickinson(BD) 公司（美国 ）

– BACKMAN COULTER 公司（ 美国）
– Partec 公司
（德国）
BD FACSCalibur
BD FACSCanto Ⅱ
BACKMAN COULTER EPICS-XL-MCL
Partec
FCM 中常见英文缩写含义

• FACS ： Fluorescence activated cell sorter

• FCM ： Flow Cytometry
• FSC ： Forward Angle Light Scatter
• SSC ： Side Angle Light Scatter
• FITC ：异硫氰酸荧光素（ fluorescein isothiocyanate ） 488nm
• PI ：碘化丙锭 (propidium iodide ， ) 488nm
• PE ：藻红蛋白 (phycoerythrin) 488nm
• APC ：别藻 蓝蛋白（ allophycocyanin ） 633nm
 流式细胞仪的特点

单个细胞或微粒分析
同时多参数分析
速度快： 10000 个细胞 ( 微粒 )/ 秒
统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情
况
分选感兴趣的细胞或微粒
 流式细胞术是一 种可以快速 、准确、客 观
，并且同时检测 单个微粒（ 通常是细胞 ）
的多项特性的技 术，同时可 以对特定群 体
加以分选

 研究对象为生物 颗粒，如各 种细胞、染 色

体、微生物、及 人工合成微 球等

 研究的微粒特性 包括多种物 理及生物学 特

征，并加以定量
 流式细胞仪系统

• 通过流 式细胞仪 我们可以得 到以下信息

- 相对细胞大小
- 相对细 胞颗粒密度 和内部复杂度
- 染色过 细胞的相对 荧光强度
 FCM 的检测范围

细胞结构 细胞功能
细胞大小 细胞表面 / 胞浆 /
细胞粒度 核的特异性抗原
细胞表面面积 细胞活性
核浆比例 细胞内细胞因子
DNA 含量与细胞周 酶活性
期
RNA 含量 激素结合位点
蛋白质含量 细胞受体

在上述 信号基础上 的细胞分选

流式细胞仪构造
• 流式细胞仪 (Flow Cytometer ， FCM) 的结
构分五部分：

– 流动室 及液流 驱动 系统
– 激光光 源及光 束成 形系统
– 光学系 统
– 信号检 测与存 贮、 显示、 分析 系统
– 细胞分 选及浓 缩系 统
流式细胞仪构造模式图
 流动室与液流驱动系统

• 流动室 是仪器 核心 部件， 被测 样品在 此与 激光相

交。
• 流动室 由石英 玻璃 制成， 中央 有一长 方形 小孔，
供单个 细胞通 过。
• 流动室 内充满 了鞘 液，其 作用 是将样 品环 形包绕
。
• 鞘液流 速稳定 ，样 品流在 鞘流 的环包 下形 成流体
动力学 聚焦，从而 得到准 确的 细胞荧 光信 息。
• 流动室 上装有 压电 晶体， 受到 振荡信 号可 发生振
动。
流动室与液流驱动系统
 Injector
Tip Sheath
fluid

Fluorescence
signals

Focused laser
beam
 样本的流速

Low Optical Cuvette High

Sample Sample
Flow Rate Flow Rate

12 µL/min 60 µL/min
Laminar Laminar
Flow Flow

Sheat Sheath Sheath Sheath

h Sampl Sampl
e e
 激光光源及光束成形系统

• 目前台 式机 FCM ，大多采用氩 离子气体 激

光器。
• 激光光 束在到达 流动室前， 先经过透镜 聚
焦，形 成约 22×66μm 的光斑，这 样激光能
量较强 ，以激发 荧光染料。
• 台式机 的整个光 路是封闭的 ，在安装时 由
工程师 调试完毕 后，无需用 户作任何调 节
，使用 十分方便 。
 光学系统

• FCM 的光学 系统由若干 组透镜、滤光 片和

小孔组 成，它们 将不同波长 的荧光信号 分
别送入 到不同的 电子测控器 。
• 主要光 学原件： 滤光片 (Filter)
– 长通滤 片 Long Pass Filter, LP
– 短通滤 片 Short Pass Filter, SP
– 带通滤 片 Band Pass Filter, BP
 滤光片
Longpass Shortpass
460 500 540
Bandpass 460 500 540 460 500 540

LP 500 SP 500 BP500/50

 信号检测与分析

当细胞携带荧光素标记物 ，通过激
光照射时，产生代表细胞内不同物质
、不同波长的荧光信号，这些信号以
细胞为中心，向空间 360 度立体 角发
射，产生 散射光 和荧光信号。
 散射光信号

• 散射光 信号不依 赖任何样品 的制备技术 （

如染色 ），因此 称为细胞的 物理参数。
– 前向散 射角 (Forward Scatter ， FSC) ：与细 胞
的大小 有关， 在 FCM 应用 中，常 取 FSC 作阈
值，来 排除样 品中 的各种 碎片 。
– 侧向散 射角 (Side Scatter ， SSC) ：与激光 束正
交 90 度的散射 光信 号，与 细胞 粒度及 复杂 程度
正相关 。
• 散射光 信号波长 与激光相同 。
 散射光信号示意图
Right Angle Light Detector
α Cell Complexity

Incident Light
Source Forward Light
Detector
α Cell Surface Area
 前向角散射光 —— FSC
Forward Angle Light Scatter

Laser

FALS Sensor
 侧向角散射光—— SSC
Side Angle Light Scatter

Laser

FALS Sensor

90LS Sensor
 荧光信号

• 一种是 细胞自身在激光照射下发出微
弱的荧光信号，称 自发荧光。

• 一种 是经过特异荧光素标记后 ，受激
发光照射得到的荧光信号，通过对这
类荧光信号的检测和定量就能了解所
研究细胞参数的存在与定量。
 荧光信号
荧光素 吸收激光 能量
荧光素 将吸收能 量释放，转 换为
 振动能 和热能
 释放较 入射光 波长 更长的 光量 子
荧光素 与特异抗 体结合
荧光抗 体与细胞 抗原结合越 多，产生的 荧
光信号越强
 常用荧光染料

• 目前台 式机 FCM 配置 ：
– 488nm 激光 管常用 染料 有
• PI (Propidium Iodide)
• PE (Phycorey- thrin)
• FITC (Fluorescein Isothiocyanate)
• PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein)
• PE-CY5 等
– 633nm 激光 管常用 染料 有
• APC
• APC-Cy
 荧光信号示意图
以激 发光 光源波 长 488nm 为例 示意 图：
 荧光检测器

FALS Sensor

Freq
Fluorescence

Fluorescence detector
(PMT3, PMT4 etc.)
荧光信号的线性测量与对数测量

当携带荧光素的细胞与激光正交
时，受激发发出荧光，经过滤光片分离
不同波长的光信号分别到达不同的光电
倍增管 (PMT) ， PMT 将光信号转换成
电信号。电信号输入到放大器放大，放
大器分两类：线性放大和对数放大。
 细胞 DNA 含量、 RNA 含量、总蛋白质含量
等的测量一般选用线性放大测量。

在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面
抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。
如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将
细胞阳性群、阴性群同时显示出来通常使用对
数放大器，如果原来输出是 1 ，当输入增大到
原来的 10 倍时，输出为 2 ；当输入增大到原
来的 100 倍时，输出为 3 等。
 荧光信号的面积和宽度

• 所谓荧光信号的 面积是采用 对荧光光通 量

进行积分测量， 一般对 DNA 含量测量时 ，
均采用面积 (FL2 － A) 来计算。这是因 为
荧光脉冲的面积 比荧光脉冲 的高度更能 准
确反映 DNA 的含量。
• 荧光信号的宽度 ( 如 FL2 － W) 常用来 区分
双联体细胞
光路图
 Optics

Laser Fluorochrom Detector Filter

es Parameter
488 nm 530/30
FITC GFP FL1
PE PI FL2 585/42
PerCP PerCP-CY5.5 FL3 670LP
635 nm
APC FL4 661/16
 FCM 测量数据的存贮、显示和分析

• 目前 FCM 所采用的都 是多参数 指标，荧光

参数标 记物最多 可达 4 个，数 据的存贮采
用列表 排队方式 ，可节省存 贮空间。
• 数据文 件为二进 制文件，缺 乏直观性， 数
据的显 示常用以 下几种方式 ：
– 直方图
– 散点图
– 等高线 图
– 密度图
– 三维图
 SSC
Data FSC
Processing

FL2
FL1

FL4
FL3
 直方图
• 直方图 (Distribution Histogram)
– 横坐标 代表荧 光信 号或散 射光 信号相 对强 度
，单位 是道数 ，可 以是线 性或 对数坐 标。
– 纵坐标 一般是 细胞 数。
 散点图
• 散点图 (Dot Plot)
– X 坐标为 该细胞 一参 数相对 含量 ， Y 坐标 为
该细胞 另一参 数的 含量， 可以 将细胞 亚群 分
开。
等高线图和密度图
三维图
 设门分析

可以通过设
“门”
(Gate) ，分析、
分选感兴趣的
细胞。
 FCM 的分辨率
• 分辨率是衡量 FCM 测量精度的 指标，
通常用变异系数 CV 表示。
• 一般要求 CV<8 ，最好 CV<3 。
基 本 操 作
 样本处理
细胞悬液的制备 :

• 细胞悬 液：
– 分离 PBMC 、 PRP 等：操 作复杂， 分离、离心步 骤导致细胞
特定群体丢 失，并可能 引入某些误 差
– 直接使用外 周血、骨髓 ：最接近生 理状况，操 作简便， 样本用
血量小
– 灌洗液、体 腔积液
– 培养细胞、 细胞系
• 实体组 织：
– 病理组织： 新鲜样本 / 石蜡包埋样本
– 针吸组织： 新鲜样本
• 鞘液、 洗液 等：清 洁无 颗粒 杂质
 步骤一： 选择合适的荧光染料

• 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激
发
• 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合
适范围内
• 荧光素光谱的重叠应当尽量减少
步骤二： 染色

• 体积
• 温度
• 孵育时间
• 对照
 步骤三： 数据收集和分析

• 画图
• 寻找目标细胞
• 调整仪器设置到合适的状态
• 我们可以得到怎样的结果？它们意味着
什么？
 仪器设置调 节

1. 用未染色细 胞调整仪器 PMT

电压
2. 用单染色的 细胞调节仪 器补
偿
 关于同型对照
例：一个双色染色的实验
抗体 A FITC ，抗体 B PE
对应的同型对照是 IgG1 FITC,IgG1 PE

那么需要准备的是
阴性对照：细胞加上 IgG1 FITC,IgG1 PE
单阳性对照：
FITC: 细胞加上 Ab A FITC, IgG1 PE
PE: 细胞加上 Ab B PE, IgG1 FITC
 光谱重叠 的校正

受激光照射后 FITC 和 PE 分子发射光谱互相干扰图

光谱重叠 的校正
光谱重叠 的校正
 光谱重叠 的校正
阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器
合适的放大倍数，即归零。荧光阴性对照实际为没
有特异性的、与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋
白。由于化学键、生物键及分子之间的吸引作用，
这些蛋白会与标本中的细胞结合，在流式细胞仪上
可检出一定的信号。当荧光特异性抗体与标本结合
时，会产生两部分信号：非特异信号（即同阴性对
照的信号），和特异性结合信号。所以我们只认为
大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号
并将其归入统计范围。
 光谱重叠的校 正
如进行 FITC 、 PE 双
色分析，先准备该试剂的
阴性对照管

A ： IgGFITC/IgGPE ，通
过调节电压，使阴性群
体落在 FTIC 及 PE 双
阴性区。（注：在进行
调补偿时，必须将原补
偿全部归零）
PE 和 FITC 分子的阴性对照
 光谱重叠 的校正

B ： FITC
标记抗体
/IgG-PE

未调补偿的双参数直方图
光谱重叠 的校正

FITC 荧光信号补偿的调节
补偿模 型图
FL2
补偿 调节前 后对 比

FL1
 数据分析

• 设门
• 设定阴性与阳性群体的界限
• 确定阳性与阴性细胞群体
• 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光
值，绝对数或抗体结合数
应 用
 流式应 用常见范 围

• 细胞大小
• 细胞的颗粒度
• 细胞表面分子： CD 系列
• 细胞浆内分子：胞内细胞因子
• 细胞核内分子： P53
• 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
 FCM 的临床应用

• HIV 免疫分 型， CD4 绝对 计数

• 白血病 和淋巴 瘤的 免疫分 型
• 肿瘤的 细胞周 期和 倍体分 析
• 网织红 细胞计 数
• 细胞移 植的交 叉配 型和免 疫状 态监测
• 干细胞 计数
• 残量白 血病细 胞检 查
• HLA-B27 检查
• 血小板 功能及 相关 疾病
 FCM 的科研应用

• 树突细 胞研究
• 干细胞 研究
• 癌症病 人的多药 耐药性
• 细胞动 力学功能 研究
• 环境微 生物分析
• 流式细 胞术与分 子生物学研 究
 FCM 的应用——免疫学

• 淋巴细 胞免疫分 型
– 淋巴细 胞亚群 分析
– CD4 绝对 计数
• HIV 的诊断与研 究
– 淋巴细 胞 CD4/CD8 分析
– CD4 绝对 计数
– T 细胞 活化
• 细胞移 植的交叉 配型和免疫 状态监测
 FCM 的免疫学应用

• 免疫功 能和免疫 调控的研究

– 淋巴细 胞和单 核细 胞的活 化
– 细胞因 子的研 究
– 淋巴细 胞的增 殖
– 树突状 细胞的 研究
• HLA-B27 检测
 淋巴细胞亚群分析

• 使用特 异的单克 隆抗体，进 行多色分析 ，

同时分 析淋巴细 胞上多种抗 原的表达， 可
以将淋 巴细胞亚 群区分开， 进行定量分 析
• 各淋巴 细胞亚群 的百分含 量
• 淋巴细 胞亚群的 绝对计数
 FCM 应用之淋巴细 胞亚群分析

淋巴细胞亚群检测： T cells, T
subsets, NK cells, B cells
 淋巴细胞亚群分析

• 根据功 能，淋巴 细胞主要分 为

– B 淋巴细胞 （ CD19+ ）， 与体液 免疫 有关
– T 淋巴 细胞（ CD3+ ），与 细胞免 疫有 关
• 总 T 和总 B 可以用 来判断 某些 免疫缺 陷和 自身 免疫
性疾病
– NK 细胞 （ CD3- CD16+ 56+ ）， 行使免 疫监 控
功能， 能够介 导对 某些肿 瘤细 胞和病 毒感 染细
胞的细 胞毒性 作用 。
 FCM 应用之淋巴细胞亚 群分析
T 淋巴细胞 (CD3+) 名 称 功 能
CD3+CD4+ 辅助性 / 诱导 性 T 细胞 辅助 和诱导细胞 免疫和体液 免疫
(Th/Ti)
CD3+CD4+CD29+ 辅助性 T 细胞 (Th) 辅助 细胞免疫和 体液免疫
CD3+CD4+CD29- 诱导性 T 细胞 (Ti) 诱导 细胞免疫和 体液免疫
CD3+CD8+ 抑制性 / 杀伤 性 T 细胞 抑制 免疫反应 / 杀伤 异源细胞
(Ts/Tc)
CD3+CD8+CD28- 抑制性 T 细胞 (Ts) 抑制 细胞和体液 免疫
CD3+CD4+CD29- 杀伤性 T 细胞 (Tc) 细胞 毒性 T 细胞
CD3+CD4+CD8+ 活化的 T 细胞 在 T 细胞恶性增生 时升高
CD3+CD4-CD8- 有调节功 能的 T 细胞 , 其表达 /δ T 细胞受体 (TCR γ/δ )
CD4+/CD8+ 比值

CD45RA+CD45RO- 幼稚的 / 静止 的 T 淋巴 细胞 当免 疫系统没有 能力更新辅 助性

或抑 制性 / 细胞毒 性淋巴细胞 的
祖细 胞时此细胞 亚群较低
CD45RA-CD45RO+ 记忆性 T 淋巴细胞 病菌 感染时升高 , 但在 慢性病毒
感染 , 如 HIV 患者 中降低
CD45RA+CD45RO+ 活化的 T 细胞 , 感染时升 高 感染 时升高
 FCM 应用之淋巴细胞亚 群分析
活化 T 淋巴细胞 名 称 功 能

CD3+HLA-DR+ 活化 T 细胞
CD4+HLA-DR+ 活化的 辅助性 / 诱导性 T 细
CD8+HLA-DR+ 胞
活化的 抑制性 / 杀伤性 T 细
CD4+CD25+ 胞
活化的 辅助性 / 诱导性 T 细
CD8+ CD25+ 胞

CD8+CD38+HLA-DR+ 活化的 抑制性 / 杀伤性 T 细 在病 毒感染的患 者中增加 ; 其增

胞 加意 味着 HIV 患者的 预后较差
B 淋巴细胞 (19+)
CD19+CD23+ 活化的 B 细胞 过敏 患者中升高
CD19+CD5+ 在自 身免疫性疾 病中升高
CD19+CD5+CD23+ 慢性 B 细胞白血 病及单克隆 B 淋
巴细 胞
NK 细胞 自身 免疫性疾病 时降低 , 而病毒
CD3+CD(16+56)+ 感染 时升高
CD3+CD57+ CMV( 巨细胞病 毒 ) 感染的强 烈征
兆
 FCM 应用之淋巴细胞亚 群分析

疾 病 CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 NK

自身 免疫性疾病
系统性红 斑狼疮
类风湿性 关节炎
自身免疫 性溶血性
贫血
重症肌无 力
免疫 缺陷病
爱滋病
病毒 感染
传染性单 核细胞增
多症
慢性 活动性肝炎
活动 性肝硬化
肿瘤
消化道癌 , 肝癌 ,
肺癌
再生 障碍性贫血
粒细 胞减少症
FCM 应用之 淋巴细 胞亚群分 析
 FCM 应用之淋巴细胞亚 群分析

淋巴 细胞 亚群检 测意
义：
疾病机理研究 疾病辅助诊
断
治疗方案的确定及疗效评价

移植后免疫检测
CD25 高于正常值 5-10%, 表明即将或已发生排斥
CD4/CD8 比值下降提示并发凶险感染
<0.2 时 , 必须停用免疫抑制剂
CD2+HLA-DR+ 增加 5-10%, 且不伴有 CD25 的增
加, 提
疾病预防 示巨细胞病毒感染

慢性疲劳 , 感染后综合征 , 纤维肌痛 , 类风湿性关节炎 , 过敏等

 FCM 应用之 HLA- B27 检测
HLA-B27 抗原是人类主要组织相容性复合体（ MHC ）的表达
产物，属Ⅰ型 MHC 基因。在免疫系统中主要负责细胞之间的相
互识别和诱导免疫反应
人 群 参 数 疾病相关
正常人(白人) HLA-B27+ 4-8%
正常人(黑人) HLA-B27+ 4-8%
HLA-B27+(所有种族) 有强直性脊柱炎 20%
HLA-B27+(所有种族) 无强直性脊柱炎 80%
强直性脊柱炎(白人) HLA-B27+ 85-95%
强直性脊柱炎(黑人) HLA-B27+ 57%
Reiteer综合征 HLA-B27+ 79%
急性前葡萄膜炎 HLA-B27+ 52%
FCM 应用之 HLA- B27 检测
正常人 患
者
 FCM 的应用——血液病学

• 白血病和淋巴瘤免疫分型
• 残留白血病
• 造血干细胞计数
• PNH 诊断
• 网织红细胞分析
• 血小板分析
– 血小板膜糖蛋白分子的表达
– 血小板活化
– 网织血小板分析
FCM 应用之白血病免疫 分型分
析
 FCM 应用之血小板

血小板 活化

活化血小板

静止血小板
 FCM 应用之血小板

血小板 活化 流式全血法 血小板聚集仪

样本处理 抗凝全血 PRP(富血小板血浆)
人为活化 最低 强烈(经离心,洗涤)
样本量 低至2uL 10mL
灵敏度 <5% 不高
相关病症 检测指标 临床意义
贮存血小板 CD62 与输注血小板恢复负相关
心肺分流术(CPB)
冠状血管形成术 Cd62p, CD63 生物相容性
肾透析
不稳定心绞痛
急性心肌梗塞

中风
Cd62p, CD63 监测和预后
脑血管局部缺血
糖尿病

产前痉挛子痫症
心肺分流术(CPB)
血小板- 白细胞聚集 较血小板活化敏感
急性冠状动脉综合征
 FCM 应用之血小板

网织血 小
板
ITP( 特发性血小板减少症 )
骨髓移植
化疗
鉴别诊断
 FCM 应用之血小板
血小 板计数 新标 准 ( 间接双 平台
法)
( 国际血液学标准化委员会 (ICSH)/ 国际实验血液学协会 (ISLH)
2001)

R = 红细胞数 / 血小板数 ( 流式细胞术 )

血小板 数 = 红细胞数 ( 血球仪 )/R

灵敏度高 (1- 400x109/L) ，

重复性好，室内 / 室外变异系数均很小
尤其应用于血小板预输注病人的检测
( 阈值 :20x109/L)
 FCM 应用之凋亡检 测

• 细胞凋 亡与细胞 坏死是两个 不同的过程

• 细胞凋 亡的主要 检查手段
– 形态学 检测
– Ladders 实验
– 流式细 胞术检 测
• 与凋亡 相关的病 理过程
– HIV
– 自身免 疫性疾 病
– 肿瘤
 FCM 应用之凋亡检 测
• 细胞凋亡的主要 指标
– 细胞内 酶改变 ： Caspase-3 活化
– 细胞膜 不对称 性改 变，磷 脂酰 丝氨酸 外翻 ，但
仍然保 持膜的 完整 性： Annexin V/PI
– 细胞核 DNA 的断 裂改变 ： TUNNEL 实验
（ APO-BRDU ， APO-DIRECT ）
• 凋亡相关蛋白：
– Fas
– Bcl-2
 细胞凋亡— PI 分析
调亡细 胞

正常 G0/G1 期细胞
Events

PI - Fluorescence
细胞凋亡— Active Caspases-3
Caspases-3 又称半胱氨酸
蛋白酶 3 ，是细胞凋亡信号
传导通路中的 ICE 蛋白酶家
族的重要成员，在细胞凋亡
发生的早期被激活。 ICE 家
族主要通过 Caspase 8 和
caspase 10 启动的两种途径
来引起细胞凋亡的发生 , 两
种反应都要经过 caspase 3
而向下逐级级联。因此，临
床常用 caspase 3 来检测早
早期的细胞凋亡。
 细胞凋亡— Annexin V

在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷
脂酰丝氨酸（ PS ）迁移到细胞外层表面。 Annexin V
是一种对 Ca2+ 依赖，对 PS 有高度亲和力的磷脂结合蛋
白，可作为探针识别细胞膜表面是否有 PS ，从而识别凋
亡细胞。由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷脂酰丝
氨酸，又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞
坏死在其初期。
 细胞凋亡— TUNEL 法

TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记法（ TdT

mediated X-dUP nick ending end
labeling,TUNEL ）
细胞凋亡时，核酸内切酶活化，双链 DNA 会出现许多
不对称的断裂点，即产生一系列 3'-OH 的末端。外源性荧光
标记的脱氧核苷酸末端转移酶（ terminal deoxynucleotidyl
tranferase,TdT ）能够催化外源性荧光素或酶标记的 dUTP
连接到 DNA 的 3'-OH 末端，用流式细胞术检测
FCM 应用之细胞增殖周期测定和 DNA 倍体分析

细胞增殖周期：分为 G0 、 G1 、 S 、 G2 、 M 期。 S 期
是 DNA 合成期，在 S 期内， DNA 进行复制，使细胞的 DNA
含量由 2 倍体（ 2C 46 条染色体）变为 4 倍体（ 4C ）。 G1
和 G2 期为 DNA 合成前、后间期，此期无 DNA 的合成，但
RNA 和蛋白质进行合成。 M 期为有丝分裂期，在此期一个细
胞分裂为 2 个细胞。细胞内的 92 条染色体分裂成 2 组 46 条
染色体，使每个细胞内具有 46 条染色体。在 M 期分裂成两
个子细胞之前， G2 和 M 期细胞的 DNA 含量均为恒定的
4C 。 M 期以后部分细胞进入 G1 期，继续进行增殖，部分细
胞进入 G0 期，即静止期，不再继续增殖。因此， FCM 分析
一个群体细胞峰 DNA 倍体与细胞周期时，将 DNA 含量直方
图分为三部分，即 G0/G1,S,G2/M 期三个细胞峰。 G0/G1 和
G2/M 细胞峰 DNA 的含量成正态分布， S 期细胞峰则是一个
加宽的正态分布。
FCM 应用之细胞增殖周期测定和 DNA 倍体分析

利用 DNA 的荧光染料，如 PI （ Propidium

iodide 碘化丙啶），与细胞内的 DNA 结合，
可反映细胞内 DNA 含量。采用 DNA 直方图
显示。具有 2C DNA 含量细胞为 G0/G1 期细
胞， 4C DNA 含量细胞为 G2/M 期细胞，
DNA 含量介于两者之间的细胞为 S 期细胞。
FCM 应用之细胞增殖周期测定和 DNA 倍体分析

DNA 倍体：主要比较 G0/G1 期细胞 DNA 含量的变

化。用 DNA 指数（ DI ）表示。

DNA 指数 = 测量样本 G0/G1 期 DNA 含量 / 正常人

淋巴细胞 G0/G1 期 DNA 含量

以正常人淋巴细胞作为对照。
正常细胞 DNA 指数为 1.00 ， DNA 指数＞ 1 ，为
超 2 倍体，＜ 1 为亚 2 倍体，两者可统称为非整倍
体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体肿瘤中
出现频率较高。
FCM 应用之细胞增殖周期测定和 DNA 倍体分析

M G0
G2 DNA 分析
G1
细胞周期
G0G1
s
细
胞
数
量
s G2M
0 200 400 600 800 1000
2N 4N
正常人骨髓细胞 DNA 分析 (ModiFIT)
多发性骨髓瘤
 DNA 分析的临床意义

• DNA 分析诊断肿 瘤
– DNA 非整倍体细胞峰
– 突出的四倍体细胞峰
– SPF>15%
• DNA 倍体分析：
结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进
行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一
些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸
物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为
重要。
• 增殖状态分析：
 FCM 的应用——分子生物学

• 分选细 胞后进 行 FISH

• 分选细 胞后进 行 PCR
• 流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光
原位杂交（ PCR-FISH ）结合测定血液
CD4 ＋细胞中 HIV 特异的 DNA 或 RNA
• 流式荧光原位杂交（ Flow-FISH ）测定染
色体端粒长度
流式微球分析 Cytometric Bead
Array （ CBA ）
流式微球分析 Cytometric
Bead Array （ CBA ）

CBA 与
ELISA
相比优
点

“ 多 元 ”和
“同 步 ”
检测

样本量少

灵敏度相