Tcnicas de purificacin y caracterizacin de protenas

IBI. Fernando Acosta Gmez

Protenas

Una clula contiene millones de protenas distintas, separarlas y determinar su estructura es extremadamente difcil. La purificacin depende de lo que se va a determinar en una protena: o o o o o o Peso Molecular Punto isoelctrico numero de subunidades numero de aminocidos tipo de aminocidos secuencia de aminocidos

Una vez determinados los Aminocidos: o Cromatografa segn su polaridad.

* purificacin de protenas

* purificacin de protenas

Para estudiar detalladamente las propiedades de cualquier protena es preciso contar con una muestra homognea que slo contenga molculas de un tipo. Las tcnicas de separacin se concentran en el tamao, la carga y la polaridad, que es donde residen las diferencias de las molculas. Se aplican muchas tcnicas para eliminar contaminantes y lograr una muestra pura de la protena de inters. El porcentaje de recuperacin indica cunto de la protena de inters se ha conservado en cada paso.

* Aislamiento de protenas de clulas

* aislamiento de protenas de clulas

Para estudiar detalladamente las protenas se necesita extraer las protenas de la clulas y orgnulos subcelulares. Homogeneizacin: Ruptura de la clula. Moler el tejido en una licuadora homogeneizador Potter-elvejhem.

*Centrifugacin Diferencial
Despus de la homogeneizacin, las clulas se someten a centrifugacin diferencial, la muestra se hace girar a unas 500 veces la fuerza de la gravedad (500 x g). Si la protena deseada no se consigue, entonces la velocidad aumenta, por ejemplo a 10 000 x g, para separar las mitocondrias y as hasta obtener las protenas deseadas para su investigacin. Una vez solubilizadas, se someten a una purificacin bruda, comnmente hecha con el sulfato de amonio y a esto se le conoce como precipitacin por sales.

* aislamiento de protenas de clulas

Uso de centrifugacin diferencial para separar los componentes de las clulas. Partiendo de un homogeneizador de clulas, una fuerza gravitacional (g) creciente har que se sedimenten diferentes componentes de las clulas

Centrifugacin diferencial

* aislamiento de protenas de clulas

Las protenas se mantienen disueltas gracias a sus interacciones con el agua. Cuando se aade sulfato de amonio a una solucin de protena, una parte del agua forma enlaces iondipolo con la sal. Al haber menos agua disponible para hidratar las protenas, setas comienzan a interactuar hidrofbicamente entre ellas. A una concentracin definida de sulfato de amonio, se forma un precipitado que contiene las protenas contaminantes. Se separa por centrifugacin y se desechan. Luego se aade ms sal hasta que se precipita un grupo distinto de protenas, donde se consigue la protena de inters.

* Cromatografa de columna

* Cromatografa de columna
Esta tcnica comenz a usarse a principios del siglo XX para separar pigmentos vegetales cuyos colores se distinguan con facilidad, pero en la actualidad es posible separar compuestos incoloros; se basa en el hecho de que diferentes compuestos pueden distribuirse en distinto grado entre diferente fase, o porciones separables de materia, se compone de 2 fases, estacionaria y la mvil, que esta fluye sobre el material estacionario y se lleva consigo la muestra a separar. El material que se constituye en la fase estacionaria se empaca en una columna, la fase mvil se pasa a travs de la columna.

* Cromatografa de columna

* Cromatografa por filtracin en gel

Tambin llamada por excusin de tamao, separa molculas con base en su tamao, es til para ordenar protenas con pesos moleculares variados. En esta forma de cromatografa la fase estacionaria consiste en partculas de gel que forman enlaces cruzados, estn en forma de granulado y consisten en uno o dos tipos de polmeros. Uno de carbohidrato como dextrano o agarosa y el segundo puede ser una poliacrilamida y la estructura creada con enlaces cruzados de estos polmeros crea poros en el material.

* Cromatografa por filtracin en gel

* Cromatografa por afinidad

aprovecha las propiedades especificas de unin de muchas protenas, tambin se usa un material polimrico como fase estacionaria, se distingue porque el polmero esta unido por enlaces covalentes con algn compuesto, llamado ligando, que se une especficamente a la protena deseada. Las dems protenas de la muestra no se unen en la columnas y se eluyen con facilidad con amortiguador, mientras que la protena unida permanece en la columna.

*Electroforesis

*Electroforesis
La electroforesis se basa en el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico, hacia un electrodo con carga opuesta. La movilidad de las macromolculas depende de su carga, forma y tamao. Aunque se han usado muchos medios de soporte para electroforesis, que incluyen papel y lquidos, el soporte ms comn es un polmero de agarosa o acrilamida similar a los empleados en cromatografa de columna. Se aplica una muestra a depresiones moldeadas en el medio de soporte. Se hace pasar una corriente elctrica por el medio, a un voltaje controlado, para lograr la separacin deseada, una vez que las protenas se separan en el gel se tie para revelar la ubicacin de las protenas.

*Electroforesis

*Electroforesis

Electroforesis Bidimensional

*Determinacin de la estructura primaria de una protena

*Determinacin de la estructura primaria de una protena

Determinar la sucesin de aminocidos de una protena es una operacin rutinaria, aunque no trivial, en bioqumica clsica. Las distintas partes se deben efectuar cuidadosamente para obtener resultados correctos. El primer paso es averiguar que aminocidos estn presentes y en que proporciones. Basta calentar una solucin de la

protena en cido, por lo regular HCL 6 m a 100-110C durante 12-36 horas para hidrolizar los enlaces pepiticos.