UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO

Bioengenharia

Profa. Dra. Glria Bandeira

 Introduo
Microbiologia o estudo dos microrganismos, um grande grupo de seres vivos capazes de existirem como clulas nicas ou em agrupamentos em que cada clula um indivduo (Barbosa e Torres, 1998).

Os micrbios so minsculos seres vivos, individualmente muitos pequenos para serem vistos a olho nu. O grupo inclui bactrias, fungos (bolores e leveduras), protozorios e algas microscpicas. Tambm inclui vrus, os quais so entidades acelulares, muitas vezes considerados como sendo o limite entre os seres vivos e novivos (Tortora, Funke e Case, 2000).

 Cada clula microbiana independente quanto a seus processos vitais de obteno de energia, crescimento e reproduo.
Com exceo dos vrus, todos os microrganismos apresentam estrutura celular. Por falta de estrutura celular os vrus so incapazes de nutrio, metabolismo e crescimento; para sua multiplicao utilizam e dependem de clulas vivas.

 A maioria dos microrganismos fornece contribuies cruciais para o bem estar dos habitantes do mundo, atravs da manuteno do equilbrio entre os organismos vivos e os compostos qumicos do nosso ambiente:
Os mos. marinhos e de gua doce constituem a base da cadeia alimentar nos oceanos, nos lagos e nos rios; Os mos. do solo auxiliam na degradao de detritos e na incorporao do nitrognio da atmosfera em compostos orgnicos, reciclando desse modo, elementos qumicos do solo, da gua e do ar; Certas bactrias e algas possuem um papel fundamental na fotossntese um processo gerador de alimento e energia que crucial para a vida na Terra;

 Os seres humanos e muitos outros animais dependem das bactrias em seus intestinos para a digesto e a sntese das muitas vitaminas de que seus corpos necessitam, incluindo algumas vitaminas B, para o metabolismo, e vitamina K para o sangue;
Os mos. tambm possuem muitas aplicaes comerciais. Eles so utilizados na sntese de produtos qumicos, tais como acetona, os cidos orgnicos, as enzimas, os lcoois e muitas drogas; Atravs da engenharia gentica, as bactrias e outros micrbios podem produzir substncias teraputicas importantes, tais como insulina, hormnio do crescimento humano. A indstria de alimentos tambm inclui os micrbios na produo de vinagre, picles, bebidas alcolicas, queijos, iogurtes e pes;

PRINCPIOS GERAIS DA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Trs reas AUMENTAR: o valor nutritivo; propriedades organolpticas (cor, odor, flavour, textura, etc.); vida de prateleira dos alimentos. CONTROLE DE DETERIORAO: por reduo ou eliminao dos microrganismos; para evitar a multiplicao dos microrganismos. SEGURANA ALIMENTAR: bactrias patognicas.

 CLASSIFICAO DOS MICRORGANISMOS PELA SUA IMPORTNCIA PARA A MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Microrganismos teis industrialmente Microrganismos deterioradores Microrganismos patognicos

Fatores que afetam a multiplicao de microrganismos em alimentos

Fatores intrnsecos Atividade de gua (Aa) Conceito O valor absoluto de Aa fornece uma indicao segura do teor de gua livre do alimento, sendo esta a nica forma de gua passvel de utilizao por parte dos microrganismos Numericamente a Aa varia de 0 a 1

VALORES DE AA EM ALGUNS TIPOS DE ALIMENTOS

Valores de Aa Tipos de alimentos

> 0,98

< 0,98 a 0,93

< 0,93 a 0,85 < 0,85 a 0,60

< 0,60
Fonte: Christian, 1980

Car nes e pescados frescos, leite e outras bebidas, frut as e hortalias fr escas, hortalias em salmour a enlatadas e frut as em calda enlatadas. Leite evaporado, concentrados de t omate, car nes e pescados curados, sucos de frut as, queijos, po e embut idos. Leite condensado, salame, queijos duros, pr odutos de confeit aria, mar meladas. Geleias, far inhas, fr utas secas, caramelo, goiabada, coco seco r alado, pescado muito salgado e extrato de car ne. Doces, chocolate, mel, macarres, batat as fr itas, ver dur as desidr atadas ovos e leite em p.

VALORES M NIM OS DE Aa PERM IT IDO A M ULT IPLICAO M ICROBIANA

Grupo microbiano Aa mnima

Maioria das bactrias Maioria das leveduras Maioria dos bolores Bactrias halfilas Bolores xerotolerantes Bol. xerfilos e leveduras osmfilas
Fonte: Farkas,1997

0,91-0,88 0,88 0,80 0,75 0,71 0,62-0,60

V ALORES M NIM OS DE Aa PARA M ULT IPLICAO DE PAT GENOS Microrganismos Aa mnima

Aeromonas hydrophila Bacillus cereus Campylobacter jejuni Clostridium perfringens Escherichia coli 0157:H7 Salmonella spp Staphylococcus aureus Multiplicao Produo de enterotoxina (alimentos) Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica 0,97 0,92-0,95 0,97-0,98 0,95-0,97 0,95 0,94-0,95 0,83-0,90 0,93-0,95 0,93-0,95 0,95-0,97

pH Conceito
O pH mede a concentrao de H+ de um alimento ou soluo

pH = -log. [H+]

VALOR DE pH APROXIMADO DE ALGUNS ALIMENTOS

Alimentos/ pH aproximado
Carnes Frangos Presunto Salsichas Frankfurt Bovina ( moda) Pescados Atum Peixe fresco (maioria) Salmo Fonte:Jay,1992 e ICMSF,1980. pH 5,4-6,2 5,9-6,1 5,7-6,2 5,2-6,2 pH 5,2-6,1 6,6-6,8 6,1-6,3

FAIXAS DE pH DE MULTIPLICAO DOS MICRORGANISMOS

pH > 4,5

4,0 < pH < 4,5

pH < 4,0

Bactrias patognicas Bactrias esporuladas Bactrias lcticas Bactrias acticas Bolores Leveduras

Alguns Bactrias lcticas esporulados Bactrias lcticas Bactrias acticas Bactrias acticas Bolores Leveduras Bolores Leveduras

Potencial de xido-reduo (O/R, Eh)

Conceito Potencial de xido-reduo de um substrato pode ser definido como sendo a facilidade de um determinado substrato perder ou ganhar eltrons

Oxidao

Oxidao

Cu
Reduo

Cu+ + e -

Cu + O2
Reduo

2CuO

Fatores extrnsecos
Temperatura

CLASSIFICAO DOS MICRO RGA NISMOS EM RELA O TEMP ER AT URA

Grupo termfilos mesfilos psicrfilos psicrotrficos
Fonte: ICMSF, 1980.

Temperatura ( C) mnima tima 40-45 5 - 15 -5 -+5 -5 -+5 55-75 30-45 12-15 25-30

mxima 60-90 35-47 15-20 30-35

Umidade relativa Presen a de gases no meio Dixido de carbono (C O2)

Aplicao: conservao de alime ntos (frutas, carnes, pescado, etc)

 Nutrientes
Fonte de energia(acar, lcool e aminocidos, carboidratos complexos, gorduras);

Fonte de nitrognio (aminocidos, peptdios e protenas); Vitaminas;

Minerais.

Teoria dos obstculos

Conceito
Interaes entre os fatores intrnsecos e extrnsecos para impedir a multiplicao de microrganismos deterioradores e patognicos, melhorando a estabilidade e a qualidade de alimento, tornando-os mais estveis, de prolongada vida-de-prateleira, e seguros sade dos consumidores.

Reproduo e curva de crescimento bacteriano

 Esporos

Gram
BACTRIAS GRAM-POSITIVAS BACTRIAS GRAM-NEGATIVAS

Clulas fixadas lmina

Corante principal cristal violeta Cora em prpura Cora em prpura

Mordente: soluo de iodo Permanece prpura Permanece prpura

Descorar com: lcool ou acetona

Permanece prpura

Contratingir com Safranina Permanece prpura Cora em vermelho

 CONTROLE MICROBIANO
Importncia do controle microbiano: Prevenir a transmisso de doenas e infeco; Prevenir a contaminao ou crescimento de mos. nocivos; Prevenir a deteriorao e dano de materiais pro microrganismos. Os micrbios podem ser removidos, inibidos ou mortos.

 Esterilizao: processo de destruio de todas as formas de vida microscpica.

Desinfetante: um agente, normalmente qumico, que mata as formas vegetativas, mas no necessariamente, as formas esporuladas. Antissptico: uma substncia que previne o crescimento ou ao de mos., pela destruio dos mesmos ou pela inibio de seu crescimento ou atividade. Saneador: um agente que reduz a populao microbiana at nveis considerveis, de acordo com as exigncias da sade pblica. Normalmente um agente qumico que mata 99,9% das clulas vegetativas.

 Germicida (microbicida): um agente que mata as formas vegetativas, mas no, necessariamente, as formas esporuladas dos germes. Bactericida: um agente que mata as bactrias. De modo similar, os termos fungicida, viricida e esporocida se referem a agentes que matam os fungos, vrus e esporos, respectivamente.
Bacteriosttico: uma condio na qual se previne o crescimento de bactrias.

Agente antimicrobiano: aquele que interfere com o crescimento ou atividade dos micrbios.

CONDIES QUE INFLUENCIAM A AO ANTIMICROBIANA Temperatura: o aumento da temperatura, quando usado em combinao como uma substncia qumica, apressa a destruio dos microrganismos. Tipo de microrganismo: os esporos bacterianos so mais resistentes que qualquer outro organismo vivo em sua capacidade de sobreviver sob condies fisicas ou qumicas adversas. Estado fisiolgico das clulas: clulas jovens, metabolicamente ativas so mais facilmente destrudas que as clulas velhas ou em latncia.

 Condies ambientais: as propriedades fsicas e qumicas do meio ou das substncias que sustentam os microrganismos, tm profunda influncia sobre o ritmo, assim como sobre a eficcia da destruio microbiana. Tamanho da populao microbiana: populaes maiores levam mais tempo para morrer do que populaes menores; Intensidade ou concentrao do agente microbicida: quanto menor a intensidade ou concentrao, mais tempo leva para destruir uma populao microbiana;

Tempo de exposio ao agente microbicida: quanto maior o tempo de exposio maior ser o nmero de clulas mortas;

Matria orgnica + desinfetante pode resultar:

Combinao do desinfetante com a matria orgnica, com formao de produto nomicrobicida; Combinao do desinfetante com a matria orgnica para formar um precipitado, o que afasta o desinfetante de uma possvel combinao com os microrganismos; Acmulo de matria orgnica na superfcie da clula microbiana, formando uma capa que impede o contato com o desinfetante.

Modo de ao dos agentes antimicrobianos: Leso da parede celular; Alterao da permeabilidade celular; Alterao das molculas de protenas e de cido nuclico; Inibio da ao enzimtica; Antimetabolitos. Mecanismo de destruio das clulas microbianas: Alterao do estado fsico do citoplasma; inativao de enzimas; rompimento da membrana ou parede celular.

As atividades metablicas de um organismo so a soma de todas as reaes qumicas e, sendo estas influenciadas pela temperatura, conclui-se que os processos vitais so por ela afetadas. Do mesmo modo, todos os microrganismos so dependentes da gua, a maior parte de sua massa constituda pela gua e todas as suas atividades so desenvolvidas em ambiente aquoso.

Agentes Fsicos
Altas temperaturas: Calor mido (vapor dgua, gua fervente, pasteurizao, esterilizao); Calor seco (estufa, incinerao); Baixas temperaturas: (refrigerao e congelao);

Radiaes ionizantes: (raios gama e raios X);

 Radiaes no ionizantes: radiaes UV;

Filtrao: memb. Filtrante;

Dessecao.

Calor mido
Causas da inativao trmica de bactrias pelo calor mido
Coagulao de protenas; Inativao de enzimas; Desorganizao dos lipdios celulares; Desorganizao do aparelho gentico; ruptura do DNA.

A morte da clula exponencial.

Possveis pontos de ao do calor sobre as clulas: parede celular, memb. citoplasmtica, os ribossomos, RNA, DNA e as protenas estruturais e funcionais.

Calor mido Vapor dgua sob presso permite: Temperaturas elevadas; Aquecimento rpido; Maior penetrabilidade e grande umidade. gua fervente: Efetivo contra as clulas vegetativas Pasteurizao: 62,8C/30min. 72,5C/15s

 Esterilizao do Equipamento
Esterilizao: Deve destruir e/ou inativar enzima(s) envolvida(s) em processos vitais para o microrganismo. Dificuldades: a heterogeneidade da populao microbiana; possibilidade de existncia de mos. com capacidade de utilizar outras rotas metablicas para vencer o bloqueio estabelecido; dificuldade do agente em atingir um alvo muito especfico

Mecanismo de Esterilizao
O mecanismo pelo qual conseguido varia conforme o agente empregado; Desnaturao de Protenas Calor mido; Alterao estrutural da molcula e perda da atividade biolgica. Populao Microbiana Considerar as caractersticas dos mos. (cel. vegetativas ou esporos) presentes no equipamento

Natureza do Equipamento a ser Esterilizado

Ideal: o nvel de contaminao, os tipos de mos., caractersticas fisiolgicas e a resistncia da populao microbiana contaminante.
impossvel a obteno de todos esses dados.

comum fazer-se o clculo de esterilizao considerando-se como se toda a populao fosse constituda de esporos.

Calor mido Tempo de destruio em minutos 105? C 110? C 115? C 120? C 5-10 5-25 40-120 420 400

Microrganismos B. antracis C. tetani C. botulinum Bact. solo Bact. termfilas

100? C 2-15 5-90 300-530 Muitas horas

125? C

32-90 120 100-300

10-40 15 40-110

4-20 6-30 11-35

4 4-8

Calor Seco Tempo de destruio em minutos 130? C 140? C 150? C 160? C at 180 60-120 9-90 60 15-60 25 20-25 20-40 5-15 30 12 180 30-90

Microrganismos 120? C B. antracis C. botulinum 120 C. tetani Esporos do solo

170? C

5 15-60

Calor Seco Ar Quente: Estufa: 180C/2h.

Oxidao da protena microbiana;

Resistncia: endurecimento da camada externa da clula por meio da coagulao das protenas dificultando a penetrao do calor; Quesnel et al. (1967), a ao letal resulta da transmisso de calor do material em contato com os microrganismos e no do ar aquecido em volta das clulas. Incinerao: Efetivo contra as clulas vegetativas

Baixas Temperaturas

Cessa o metabolismo e o crescimento; Bactrias e vrus : -20C e -70C; -196C preservao.

No podem ser indicadas para a desinfeco ou esterilizao.

Radiaes ionizantes: (raios gama e raios X) so chamadas dessa forma porque possuem suficiente energia para retirar eltrons de molculas, ionizando-as e criam hidrognio livre, radicais hidroxila e alguns perxidos.
Radiaes no ionizantes: radiaes UV Centros cirrgicos, Cmaras asspticas em ind. farmacutica; Superfcie contaminada em ind. alimentos; Tem pequena capacidade de penetrao; 2600-2700A Filtrao: (materiais termossensveis) Soro, enzimas, algumas vitaminas ou antibiticos; memb. Filtrante (150m de espessura e 0,01 a 10m de dimetro).

Dessecao: causa uma parada na atividade metablica da clula: O tipo de microrganismo; O material no qual os microrganismos so dessecados; A intensidade do processo de dessecao; As condies fsicas as quais so expostos os organismos dessecados (luz,temperatura, umidade). Os microrganismos dessecados continuam viveis por muitos anos.

Agentes Qumicos
Nenhum agente qumico antimicrobiano nico melhor ou ideal para qualquer ou todas as finalidades.
Esterilizante: um composto qumico que realiza uma esterilizao. Desinfetante: substncia qumica que mata as formas vegetativas mas no necessariamente as esporuladas.

 Desinfeco: processo que utiliza um agente para destruir microrganismos infecciosos.

Antisptico: composto qumico usualmente aplicado na superfcie do corpo humano que previne a multiplicao dos microrganismos.

Saneador: agente que mata 99,9% dos microrganismos contaminantes de uma rea.

 Caractersticas de um agente qumico ideal Atividade antimicrobiana: deve ter amplo espectro, isto , deve inibir ou matar muitos tipos diferentes de mos. Solubilidade: ser solvel em gua ou em outros solventes (lcool) em quantidade necessria ao seu uso efetivo.

Estabilidade: no deve haver perda significativa de ao antimicrobiana durante o seu armazenamento.

 Ausncia de toxicidade: no deve prejudicar o homem ou os animais. Homogeneidade: as preparaes devem ser uniformes em sua composio de modo que os componentes ativos estejam presentes em cada aplicao. Inibio mnima por material estranho: alguns compostos qumicos antimicrobianos combinam-se facilmente com protenas ou outros materiais orgnicos encontrados no material que est sendo tratado. Isto diminui a quantidade de substncias qumica disponvel para agir contra os mos.

 Ausncia de poderes corrosivos e tintoriais: os compostos no devem corroer ou desfigurar metais nem corar ou danificar os tecidos. Poder desodorizante: o desinfetante ideal deve ser inodoro ou apresentar odor agradvel.

Capacidade detergente: ser capaz de remover mecanicamente os mos. da superfcie que est sendo tratado. Disponibilidade e baixo custo: ser facilmente empregado e de baixo custo.

 Escolha do Agente Qumico Antimicrobiano

Natureza do material a ser tratado

Tipos de microrganismos (grampositivos e gram-negativos). Condies ambientais (temperatura, pH, tempo, concentrao e presena de material orgnico).

Principais grupos de agentes qumicos

Fenol e compostos fenlicos lcoois Halognios Metais pesados e seus compostos Corantes Detergentes Compostos quaternrios de amnio cidos e lcalis Glutaraldedo Esterilizantes qumicos gasosos (xido de etileno, -propiolactona, formaldedo).

Fenol (cido carblico, cido fnico) e compostos fenlicos

Desnaturam as protenas e causam danos a membrana celular;.

Podem ser bactericida ou bacteriosttico;

Esporos bacterianos e vrus so mais resistentes; Alguns compostos so altamente fungicida; Sua ao inibida em pH alcalino e na presena de material orgnico;

lcoois
lcool etlico (CH3CH2OH): concentraes de 50-70% efetivo clulas vegetativas;
No agente esterilizante; Sa agentes desnaturantes e solventes de lipdios (lesam a membrana citoplasmtica); Concentraes > 60% so ativas contra os vrus lcool metlico menos efetivo que o etlico e altamente venenoso. lcoois proplico, amlico, butlico so mais germicidas que o etlico.

Halognios (iodo)
Pouco solvel em gua e solvel em lcool; Altamente germicida (bactrias, esporos, fungicida e vrus).

Cloro e Compostos Clorados

Hipoclorito: Ca(OCl)2 e NaOCl Tratamento de gua, restaurantes, laticnios.

Cloraminas: so mais estveis que os hipocloritos; So usados como desinfetantes, agentes de sanificao ou antissptico De maneira similar os hipocloritos e as cloraminas sofrem hidrlise com a formao do cido hipocloroso.

Cl2 + H2O HCl + HClO (c. hipocloroso)

HClO HCl + O
O O2 o agente oxidante leva os mos. a morte. A destruio dos germes pelo cloro e pelos seus derivados devida em parte a combinao do cloro com protenas da memb. citoplsmtica e com as enzimas.

Detergentes sintticos
No se precipitam em guas cidas e nem alcalinas;

Classificam-se em detergentes aninicos (ionizam com a propriedade detergente no nion) e detergentes catinicos (ionizam com a propriedade detergente no ction);
Os detergentes catinicos so mais germicidas que os aninicos.

Compostos quaternrios de amnio

Poder bactericida elevado contra os germes gramnegativos;
Tem poder bacteriosttico e bactericida e fungicida;; Sua ao inclui a inibio enzimtica, a desnaturao protica e a leso da memb. citoplamtica com vazamento dos constituintes celulares.

provvel que uma verdadeira associao do mecanismos cause a inibio ou a morte das clulas.

 Microbiologia Industrial
Subst. + mos. novo(s) produto(s) de desassimilao ou de sntese.

Pr-requisitos dos processos industriais

O organismos: o organismo empregado deve ser capaz de produzir quantidade apreciveis do produto. Deve apresentar caractersticas relativamente estveis e crescer rpida e vigorosamente, sem demonstrar potencial patognico. O meio: ser barato e facilmente acessvel em grandes quantidades (ex. soro de leite). O produto: muitas vezes uma mistura heterognea (clulas microbianas e constituintes no utilizados do meio). Deve-se: desenvolver um mtodo de obteno e de purificao que seja vivel quando operado em larga escala.

 Principais classes de produtos

Bebidas alcolicas: cerveja, vinho e outras bebidas constitui uma das maiores e mais velhas industriais microbiolgicas. Produtos farmacuticos: antibiticos, vacinas, vitaminas, etc. Suplementos alimentcios: meios de sais inorgnicos de nitrognio, fornece uma boa fonte de protena e de outros nutrientes orgnicos. Produtos qumicos de valor comercial: acetona, lcool etlico.

 Deteriorao de materiais estruturais

Couro, txtil, madeira e produtos derivados da madeira.

Tecnologia das Fermentaes

Fermentao: Qualquer processo metablico que libere energia de um acar ou outra molcula orgnica, no requer oxignio ou um sistema transportador de eltrons e usa uma molcula orgnica como um aceptor final de eltrons.

 Recipiente utilizado para a fermentao industrial: biorreatores (aerao, controle de pH e de temperatura). Tipos mais comuns de biorreatores: agitao contnua.
Os microrganismos na fermentao industrial produzem metablitos primrios e secundrios. Metablitos primrios: so formados ao mesmo tempo que as clulas e a curva de produo segue a curva do crescimento celular. Metablitos secundrios: no so formados at que os microrganismos tenha completado toda a sua fase de crescimento logartmico e tenha iniciado a fase estacionria do ciclo de crescimento.

 Bactrias produtoras de cido lctico

So bacilos ou cocos imveis, microarfilas, gram-positivo, no formadores de esporos. No crescem muito bem em meios artificiais por necessitarem de alimentos mais complexos.

Cocos (Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc); Bacilos (Lactobacillus).

Gneros

 Streptococcus
Grupo lctico: Fermentam queijo e manteiga; No toleram mais do que 2-4% de sal. Ex.: S.lactis e S. cremoris. Grupo enterococcus: Resistem a temperatura de pasteurizao do leite, temperaturas mais elevadas; Toleram sal de 6,5% ou mais; Crescem em pH alcalino (9,6); Crescem em intervalo de temperatura amplo (5-8C ou 48-50C).

 Pediococcus
Cocos Gram-positivo, microaerfilos, homofermentativo, produtores de cido; Crescem numa ampla faixa de temperatura (7C-45C); Toleram sal de at 5,5%; Alteram bebidas alcoolicas (cerveja, devido a produo de diacetil).

 Leuconostoc
Habitat: superfcie dos vegetais; Inicia a fermentao em produtos vegetais com maior rapidez que outras bactrias lcticas, impedindo dessa forma o crescimento de bactrias no lcticas; So tolerantes ao sal e a altas concentraes de acar (55-60%); Produtores de diacetil, pelcula em mel e CO2 em queijos (furos)

 Lactobacillus
Microaerfilas, Gram-positivo, bacilos curtos no produtores de esporos; Habitat: vegetais, esterco e leite; Fermentam o acar produzindo cido lctico; Bom: produtos vegetais fermentados; produtos lcteos; elaborao industrial de cido lctico. Ruim: cerveja e vinho (diacetil); No sintetiza a maioria das vitaminas; Resistem a altas temperaturas.

Produo de cido lctico

A fermentao ltica realizada pelas bactrias pertencentes ao grupo ltico ou bactrias lticas.

Carboidratos: milho, amido de batata, melao,

trigo, leite, soro de leite, sacarose.

A escolha da matria-prima depende:

de sua acessibilidade; do tratamento prvio a fermentao; do custo;

 A fermentao lctica: homolctica (produo de 2 moles de cido lctico por mol de glicose), com maior quantidade desse componente em relao aos demais produtos formados, como diacetil, etanol e CO2 ou heteroltica, quando a proporo desses produtos so praticamente, as mesmas. As diferenas entre homo e hetero tm base gentica e fisiolgica.

 Os homolticos apresentam as enzimas aldolases e hexose-isomerase, mas no apresentam a fosfocetolase. Utilizam a via de EmbdenMeyerhof-Parnas para produzir duas molculas de lactato para uma de glicose.
Os heterolticos apresentam a fosfocetolase, mas no a aldolase e a hexose-isomerase e, em vez de utilizarem a via de Embden-MeyerhofParnas na degradao de glicose, usam a do monofosfato-hexose ou a via das pentoses. As bactrias cido lctico so largamente usadas na conservao e processamento de alimentos: carne, peixe, leite e vegetais.

Esquema da reao bioqumica efetuada por microrganismos na produo de cido lctico.

lactase sistema de

C12H22O11 + H2O

2C6H12O6
Glicose + galactose enzimas

2CH3CHOHCOOH
cido lctico

 O controle do processo requer conhecimento das cepas de microrganismos da matria-prima e da reao bioqumica do produto final. Esse processo: assegura a estabilizao e modificao da qualidade sensorial dos produtos. o crescimento de bactrias cido lctico um mtodo utilizado para a conservao de alimentos tanto para consumo humano como animal, pois inibem o crescimento de outras mediante a produo de perxido de hidrognio e de antibiticos.

 As bactrias cido lctico adicionam aromas caractersticos aos produtos e podem prevenir a rancidez e outras reaes qumicas que diminuem a qualidade do alimento. O metabolismo fermentativo das bactrias cido lctico na presena de oxignio diminui o pH do meio. Esta diminuio de pH resulta na produo de cido lctico. O Lactobacillus plantarum apresentou metabolismo homofermentativo em anaerobiose glicose, metabolismo heterofermentativo na presena de oxignio glicose.

Essa mudana no metabolismo ocorre devido ao nvel de piruvato produto secundrio e de produtos primrios tais como acetato, etanol e CO2.

Tabela: Alguns produtos industriais elaborados por bactrias

PRODUTO Acetona butanol 2,3 butanediol Dihidroxiacetona cido 2-cetoglucnico cido 5-cetoglucnico cido lctico MICRORGANISMO Clostridium acetobutylicum e outros Bacillus polymyxa; Enterobacter aerogenes Gluconobacter suboxydans, Pseudomonas spp Gluconobacter suboxydans Lactobacillus delbrueckii USOS Solventes: fabricao de produtos qumicos Solvente; umectante; produto qumico intermedirio. Substncia qumica refinada Intermedirio na obteno do cido D-araboascrbico Intermedirio na obteno do cido tartrico Produtos alimentares; tecidos e lavanderias; fabricao de produtos qumicos; curtio de couros. Amidos modificados; tratamento de papel e de tecidos Tratamento de peles, de tecidos; removedor de manchas; amaciamento de carnes. Estabilizador de produtos alimentcios; substituto do plasma sanguineo Fabricao de cido ascrbico Tratamento de anemia perniciosa; alimento e suplemento alimentar. Aditivo em alimentos Aditivo na alimentao animal Uso mdico (dissolvem cogulos sanguineos)

Amilase bcteriana

Bacillus subtilis

Protease bacteriana

Bacillus subtilis

Dextrano

Leuconostoc mesenteroides

Sorbose Cobalamina

Gluconobacter suboxydans Streptomyces olivaceus; Propionibacterium freudenreichii Brevibacterium glutamicus Micrococcus glutamicus Streptococcus pyogenes

cido glutmico Lisina Estreptoquinaseestreptodornase

Fonte: Pelczar, Reid, Chan (1981).

CIDO PIRVICO

Organismos

Streptococcus Lactobacillus Bacillus

Saccharomyces

Propionibacterium

Clostridium

Escherichia Salmonella

Enterobacter

Produtos Finais de Fermentao

cido Lctico

Etanol e CO2

cido Propinico, cido Actico, CO2 e H2

cido Butrico, Butanol, Acetona, lcool isoproplico e CO2

Etanol, cido lctico, cido succinico cido actico, CO2 e H2

Etanol, cido frmico, Butanodiol, acetona, CO2 e H2

 Produo de vinagres Francs vinaigre, vinho azedo. Dois tipos de reaes bioqumicas: 1- uma fermentao alcolica de um carboidrato; 2- uma oxidao do lcool at cido actico.

Definio (Food and Drug Administration FDA) produto obtido pela fermentao alcolica e subsequentemente actica do suco de ma. Contm, em 100 centmetros cbicos (20C) no menos do que 4 gramas de cido actico (vinagre, vinagre de cidra, vinagre de ma).

 Bactrias lipolticas
So bactrias que hidrolisam os lipdios em glicerina e cido graxos. Ex.: Alcaligenes, Serratia e Mycrococcus.

Bactrias sacarolticas ou osmoflicas

Altas concentraes de acar; Hidrolisam os dissacardios ou polissacardios em carboidratos mais simples; Espcies amilolticas: Bacillus subtlis e Clostridium butyricum; Poucas sp hidrolisam a celulose.

 Bactrias termfilas
So bactrias que se reproduzem acima de 45C (timo 55C) Ex.: C. thermosacchalyticum (gs); Bacillus (cido).

Bactrias halfilas
Halfilas moderadas (5-20%); halfilas extremas (20-30%); ligeiramente halfilas (25%); sal tolerante (presena ou ausncia de sal) Ex.: Halobacterium, Sarcina, Micrococcus, Vibrio, Pseudomonas e Pediococcus.

 ENZIMAS
Enzimas so catalizadores biolgicos formados por aminocidos. So portanto, um tipo de protena com atividade cataltica, sendo encontrados na natureza em todos os seres vivos. Sua funo viabilizar a atividade das clulas quebrando molculas ou juntando-as para formar novos compostos. A singularidade desses compostos decorre do elevado grau de especificidade ao substrato em condies moderadas, sob as quais atuam. Toda enzima uma PROTENA, mas nem toda protena uma ENZIMA.

 As protenas so as molculas mais abundantes nas clulas, cerca de 30 -70%. Constituintes bsicos: Carbono 50% Oxignio 23% Nitrognio 16% Hidrognio 7% Enxofre 3%

Classificao das protenas: protenas fibrosas e globulares. Estruturas das protenas: primria, secundria, terciria e quaternria. As enzimas pertencem a classe das protenas globulares, tendo como estrutura a terciria.

 Aminocidos: so compostos qumicos que apresentam em sua frmula qumica grupo carboxlico (-COOH) e grupo amino (-NH2). H
R C NH2 Os aminocidos so diferenciados de acordo com o grupo R ligado ao carbono assimtrico. Na natureza so encontrados 20 aminocidos. COOH

Quimicamente, enzimas so protenas com estrutura especial contendo um centro ativo denominado apoenzima e as vezes um grupo prosttico (cofator) que pode ser orgnico (coenzima) ou um on metlico ativo. A habilidade com que a enzima se liga ao substrato se denomina atividade biolgica e depende: Estrutura da protena;

Nmero de cadeias peptdicas;

Arranjo dessas cadeias na molcula; natureza do substrato; Natureza do grupo prosttico (se houver)

 Cada organismo vivo produz uma grande variedade de enzimas.

Algumas so produzidas em grandes quantidades por certos microrganismos.

As enzimas extracelulares so capazes de digerir materiais nutritivos insolveis como celulose, protenas e amido. Algumas destas enzimas so usadas em alimentos, bebidas, laticnios, nas indstrias farmacuticas, txtil e de detergentes. So produzidas comercialmente em grande escala, por sntese microbiana atravs de fungos ou de bactrias.

O processo de produo normalmente anaerbio e o meio de cultura semelhante ao usado para a fermentao de sntese de antibitico.

 Caractersticas enzimticas So produtos naturais biolgicos; Apresentam alto grau de especificidade; Reaes baratas e seguras; Desempenham a mesma funo consecutivamente sem serem consumidas no processo.

Comparao das enzimas com os catalizadores qumicos

CARACTERSITICAS ENZIMAS CATALIZADORES QUMICOS Especificidade ao substrato Natureza da estrutura Sensibilidade a T e pH Condies de reao (T, P e pH) Custo de obteno (isolamento e purificao) Natureza do processo Consumo de energia Formao de subprodutos Separao catalisador/produto Atividade cataltica (temp. ambiente) Presena de cofatores Estabilidade do preparado Energia de ativao Velocidade de reao SIM BAIXA BAIXA ALTA NO ALTA ALTA BAIXA ALTA BAIXA BATELADA BAIXO BAIXA DIFCIL/CARA CONTNUO ALTO ALTA SIMPLES ALTO MODERADO ALTA COMPLEXA ALTA SUAVE BAIXA SIMPLES BAIXA DRSTICA

 Classificao e nomemclatura das enzimas Divide-se em 6 classes e baseiam-se na reao que catalisam.

O primeiro nmero designa a qual das seis classes a enzima pertence.

O segundo nmero indica o tipo de ligao que a enzima atua. O terceiro nmero uma subclassificao do tipo de ligao. O quarto nmero apenas um nmero de srie.

Principais Classes de Enzimas

PRIMEIRO NMERO

CLASSE DA ENZIMA

TIPO DE REAO CATALISADA

Oxirredutase

Catalisam reaes de oxirreduo. Transferncia de H, O ou eltrons

Transferases

Catalisam transferncia de grupos entre molculas

Hidrolases

Catalisam reaes de hidrlise

Liases

Catalisam a adio de grupos a ligaes duplas e vice-versa

Isomerases

Catalisam reaes de isomerizao

Ligases

Catalisam a unio de duas molculas associadas a ruptura da ligao tirofosfato do ATP.

Mercado Global de Enzimas

SETOR

ENZIMAS
-amilase, glicoamilase, glicose isomerase

MILHES DE DLARES

Produo de amido

500

Detergentes

Protease, lpase, amilase 450

Texteis Tratamento de couro Papel e celulose Laticnios Clarificao de cerveja e amaciamento de carnes TOTAL

amilase Diversas enzimas celulase Lactase papaina

150 25 25 150 25

1325 bilhes

 Cintica Enzimtica
a anlise quantitativa do efeito de cada um dos fatores que influencia a atividade enzimtica avaliada atravs do aumento ou reduo da velocidade da reao catalisada. A atividade enzimtica e a cintica enzimtica determinada pela concentrao da enzima, concentrao de cofatores, concentrao e tipos de inibidores, pH, T e fora inica.

 Cintica Enzimtica
Objetivos:

Medir as velocidades das transformaes que se processam; Estudar a influncia de condies de trabalho (concentraes de reagentes e das enzimas, temperatura, pH, concentraes de ativadores e de inibidores) naquelas velocidades; Correlacionar (equaes empricas ou modelos matemticos) as velocidades das transformaes com alguns dos fatores que as afetam; Colaborar na otimizao do processo; Estabelecer critrios para o controle do processo; Projetar o reator mais adequado.

 Cintica de Processos Fermentativos

Importante: As concentraes das enzimas no se mantm constantes com o tempo, podendo haver: Decomposio relativamente rpida desses catalisadores, como decorrncia de condies ambientes pouco favorveis particularmente da temperatura; Aumento da concentrao de enzimas com o tempo como consequncia da reproduo dos microrganismos. Outro ponto importante: interdependncia dos fatores que influem nas velocidades das reaes.

 Cintica das Reaes Enzimticas S + E P

Medida de velocidade de reao em condies experimentais definidas.

Cintica Enzimtica
Cintica Enzimtica
Estudo da velocidade de uma reaco qumica que ocorre na presena de um enzima

Permite elucidar sobre: Os pormenores do mecanismo cataltico das enzimas O papel das enzimas no metabolismo Controle da atividade Mecanismos de inibio

Velocidade vs. Concentrao

A concentrao de substrato influencia a velocidade de uma reaco

Estudo da relao entre a concentrao e a velocidade:

. No inicio da reao a quantidade de substrato constante, j

que a quantidade de substrato muito maior do que a de enzima. .Determina-se a velocidade inicial de reao, Vo ,para uma determinada [S]. .Obtm-se valores para vrias concentraes de substrato, mantendo constante a concentrao de enzima. Assim podemos traar os valores num grfico, em que exprimimos Vo como funo de [S]

Velocidade vs. Concentrao

Dados: Para [S] baixas, Vo aumenta quase linearmente Para [S] maiores, Vo aumenta mais gradualmente Para [S] mais elevadas, atinge-se uma velocidade mxima, Vmx. Km: constante de psudoequilibrio de Michaelis-Menten, expressa a relao entre as concentraes reais no estado estacionrio.

Equao de Michaelis-Menten
Comportamento explicado pela formao do complexo enzima-substrato ES 1. A enzima liga-se ao substrato reversivelmente formando o complexo ES
Reao rpida

2. O complexo ES dissocia-se em enzima livre e produto da reao

Reao mais lenta

.A reao 2, mais lenta, limita a velocidade global da reao. .A velocidade proporcional concentrao do complexo ES. .A cada momento a enzima existe na forma livre e no complexo ES. .A velocidade mxima (Vmx) da reao ocorre quando todas as enzimas esto associadas a molculas de substrato.

Deduo da Equao Michaelis-Menten

A curva que representa a relao entre [S] e Vo tem forma idntica para a maior parte das enzimas. Esta curva pode ser descrita algebricamente pela equao de Michaelis-Menten. A equao de Michaelis-Menten

Hiptese: o passo limitante da velocidade das reaes enzimticas a dessociao do complexo ES. Se Vo exatamente metade de Vmx, ento: Km= [S] Vo=Vmx Quanto menor for o valor de Km maior ser a afinidade da E pelo S

 Significado de Vmx e Km
Vmx e Km podem variar de uma enzima para outra. Km depende do mecanismo da reao como o nmero e as velocidades relativas dos passos individuais da reao. Reao de 2 passos:
Km= K2+ K-1 K1

Para a reao de Michaelis-Menten, K2 o limitante da velocidade; assim quando K2 <<K-1, Km se reduz ao valor de K-1/K1. Se essa reao prevalece o Km representa uma medida da afinidade da enzima pelo substrato no complexo ES.

 Se K2 >> K-1 e Km = K2/K1. Em outros casos K2 e K-1 so comparveis e Km permanece com uma funo mais complexa do relacionamento entre todas as trs constantes de velocidade.

Se uma enzima reage pelo mecanismo de dois passos de Michaelis-Menten Vmx equivalente a K2[Et], onde K2 o passo limitante da velocidade.

Deduo da Equao Michaelis-Menten

Presuposto: no h transformao de produto em substrato Reaes de formao e dessociao do complexo ES:

Vo pode ser considerado como a velocidade com que ocorre a quebra da ligao ES

No fcil determinar [ES]!

[ET] - concentrao total da enzima

A concentrao de enzima livre , assim, [ET]-[ES]

Deduo da Equao Michaelis-Menten

.Passo 1
Velocidade de formao de ES Velocidade de degradao de ES .Passo 2
[ES] constante, ou seja, a velocidade de degradao e formao de ES so iguais.

.Passo 3

Deduo da Equao Michaelis-Menten

.Passo 4
Obtemos Vo, substituindo [ES]

A velocidade mxima quando [ES]=[ET]! Equao de Michaelis-Menten

Anlise da Equao Michaelis-Menten

A equao de Michaelis-Menten, que nos d a relao quantitativa entre a velocidade inicial V0, a velocidade mxima Vmx e a quantidade inicial de substrato [S], todas relacionadas pela constante de Michaelis Km Km unidades de concentrao No caso de V0 ser exatamente metade de Vmax:

Km corresponde concentrao de substrato para a qual V0 metade da velocidade mxima

Anlise da Equao Michaelis-Menten

A equao de Michaelis-Menten muito til para determinar os valores de Km e Vmx das reaes.

Os enzimas que exibem uma dependncia hiperblica de V0 em funo de [S] diz-se que seguem a cintica de Michaelis-Menten.

Enzimas cujo mecanismo obedea s duas reaes anteriores podemos dizer que o valor de Km est relacionado com a afinidade do enzima para o substrato, e logo diferente de substrato para substrato e de enzima para enzima.

O Vmx a velocidade mxima que a reao pode alcanar, na situao virtual em que todos os enzimas se encontram ligados ao substrato.

Equao de Lineweaver-Burk

Podemos transformar a equao de Michaelis-Menten, invertendo-a:

Esta forma da equao de Michaelis-Menten chama-se equao de Lineweaver-Burk

Equao de Lineweaver-Burk
Grfico de 1/[V0] em funo de 1/[S]

Obtm-se uma funo linear!

.Esta reta tem um declive Km/Vmx .A interseco da reta no eixo 1/V0 corresponde ao valor 1/Vmx .A interseco com o eixo 1/[S] corresponde a -1/Km

Permite uma determinao de Vmx precisa!

Inibio enzimtica

Reversvel
Competitiva Anti-Competitiva Mista

Irreversvel

Inibio Reversvel Competitiva

O inibidor estruturalmente semelhante ao

substrato podendo haver competio pelo centro ativo da enzima

A inibio pode ser contrariada adicionando

mais substrato ao meio

O Km aumenta e o Vmax no se altera

(valores caractersticos da inibio competitiva)

Inibio Reversvel Competitiva

 Equao de Michaelis-Menten com a presena de um inibidor competitivo: V= Vmx . [S] Km(1+[I]/KI)+[S]

Aplicando o mtodo de Lineweaver-Burk na equao acima temos: 1 = 1 + Km(1+[I]/KI). 1 V Vmax Vmax [S]
Determinao de KI Vo= 1 + VI
Km KI(Km + [S]) . [I]

Inibio Reversvel Competitiva

Inibio Reversvel Competitiva

Inibio Reversvel No-Competitiva

O inibidor se liga a um local especfico do

enzima (que no o centro ativo)

O inibidor liga-se apenas ao complexo ES,

formando o complexo ESI Para qualquer [I] uma parte da enzima permanecer sob a forma [EIS]

O Km diminui e o Vmax diminui (em a

Vmx sem inibidor)

Inibio Reversvel No-Competitiva

Inibio Reversvel No-Competitiva

Inibio Reversvel No-Competitiva

Inibio Reversvel Mista

O inibidor liga-se a um local especfico do

enzima (que no o centro ativo)

O inibidor liga-se tanto ao enzima livre

como ao complexo ES

Vmax diminui Km pode aumentar, diminuir ou manter-se

Inibio Reversvel Mista

Inibio Reversvel Mista

Inibio Reversvel Mista

Inibio Reversvel
Vmax aparente Sem inibio Inibio competitiva Inibio AntiCompetitiva Inibio Mista Vmax Vmax Vmax/ Vmax/ Km aparente Km Km Km/ Km/

Quando = , a Inibio Mista tem o nome de Inibio No Competitiva

Inibio Irreversvel

O inibidor combina-se permanentemente ao

enzima de uma das seguintes formas:
Ligao covalente Destruio de um grupo funcional essencial ao funcionamento do enzima

Ligao no covalente particularmente estvel

 Microbiologia Industrial
Esterilizao de meios de fermentao
Esterilizao de um meio a operao que tem por finalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macroscpica ou microscpica, saprfitas ou no, existentes no meio considerado.

Dispensvel: fermentao lctica de hortalias e povilho e tratamento biolgico de resduos; Panificao: obteno de leveduras fervura do melao, baixo pH, gua de qualidade; Vinagre: baixo pH, temperatura, deficincia nutritiva do meio (lcool).

 Indispensveis: produo de antibiticos, enzimas, vitaminas, acetona, butanol. Clostridium acetobutilicum pode ser destrudo por bacterifagos. A penicilina, pode ser parcial ou totalmente destruda pela penicilinase (mos. contaminantes); Riboflavina e cianocobalamina (mos. contaminantes).

Cintica de Destruio de Microrganismos pelo Calor mido A destruio do microrganismo em suspenso em um meio aquoso se comporta como se fosse uma reao de primeira ordem: dN/dt = -kN (eq. 1)

N nmero de mos. viveis aps um tempo t de aquecimento da suspenso a uma temperatura constante; e k a constante de velocidade de destruio do mo.

 O valor de k depende do mo. (gnero, espcie, variedade, idade da cultura, existncia ou no de esporos), da natureza do meio aquoso em que se encontra e do valor da temperatura. A eq. 1 permite escrever, indicando por No o nmero inicial de mos. viveis: N = No exp(-kt) Log N = log No (k/2,303)t (eq. 2) Expresso que possibilita a partir de valores experimentais resultantes de medidas de N para diferentes valores de t, calcula-se a constante k para o sistema considerado na temperatura ensaiada. Para um determinado mo. suspenso em um dado meio aquoso, a cte. de velocidade k ser funo apenas da temperatura.

 comum representar a eq. 2 sob outro aspecto. Indicando-se como D o tempo necessrio a uma dada temperatura T, para reduzir o nmero de mo. viveis a 1/10 do inicial (destruir 90% dos mos.), tem-se: log N = log No (t/D), ento: D = 2,303/k Esse tempo D tb. chamado tempo de reduo decimal do mo, no meio considerado na temperatura T.

Clculo do tempo de esterilizao

A eq. 2 pode ser escrita:

t = (2,303/k).logNo/N
Conhecendo-se o valor de k possvel calcular o tempo necessrio para reduzir o nmero de microrganismos viveis de No at N.

1- Na prtica o meio a ser fermentado apresenta diversos gneros e espcies de microrganismos.

K varia conforme o microrganismo.

Escolhe-se um mo. de referncia (B. stearothermophilus)

 2- K varia com o meio e com a temperatura 3- Considerando-se que a esterilizao a operao que tem por finalidade destruir todos os mos., logo N=0 e a eq. 2 deixa de ser aplicvel. 4- Probabilidade de falha: Et (no. total de operaes de esterilizao realizadas nas mesmas condies) e Ef o no. de operaes que falharam, ento:

P=(Ef/Et).100

Esterilizao Descontnua
O clculo do tempo de esterilizao () pode-se ser efetuado conhecendo-se:
A variao de k com a temperatura; As curvas de aquecimento e de resfriamento do meio; A temperatura de esterilizao; A temperatura mnima letal; O nmero inicial de clulas viveis (N1); O nmero final de clulas viveis (= probabilidade de falha = N4).

Clculo de k em funo da temperatura

Curva de aquecimento (t1 a t2); Curva de resfriamento (t3 a t4) fig. 1
t2-t1 = (2,3/km).log N1/N2 = (2,3/k).log N2/N3 t4-t3 = (2,3/km).log N3/N4 Concluso: o clculo dos tempos de esterilizao nos conduz apenas a valores aproximados que podem ser considerados bons pontos de partida para a determinao experimental dos valores a adotar na prtica.

Esterilizao Contnua
A destruio dos mos. nas fases de aquecimento e de resfriamento pode ser desprezada fig. 2

= (2,3/k).log N1/N2
Onde: N1 (no. inicial de mos viveis);

N2 (probabilidade de falha); k (cte. de velocidade de destruio

dos mos. na temperatura de esterilizao)

 Processo Industrial Genrico de Fermentao

PREPARO DO MEIO

PREPARO DO INCULO

FASE

DE

LABORATRIO FASE INDUSTRIAL

ESTERILIZAO DO MEIO

FERMENTADOR

CONTROLES

AR

ESTERILIZAO

PRODUTOS TRATAMENTOS SUBPRODUTOS RESDUOS

DO

AR

Esterilizao de Ar
Fermentaes aerbias (antibiticos, vitaminas e enzimas).

Mtodos para a Esterilizao do Ar

a) Esterilizao pelo calor seco
Temperaturas elevadas e tempo longo; Instalao de tubos de reteno ou espera devidamente isolados termicamente; Encontra aplicao em pequenas instalaes.

 Aquecimento direto ou indireto do ar pela queima de um combustvel

Aquecimento direto com gs liquefeito ou leo Diesel (vazo baixa 30litros/min);

O sistema consiste: queima de combustvel dentro de uma espiral ou grade metlica e o ar passando ai); No usar em processos fermentativos; Eliminar mos.patognicos e lanar na atmosfera; Aquecimento indireto atravs de trocador de calor aquecido por gases de combusto Isento de produtos de combusto; Pode ser usado em processos fermentativos; Muito caro

 Aquecimento por meio de resistncias eltricas

Fcil de construo e controle. Caro Emprego: exausto de ar de cmaras, fermentao;

Temp. de at 370C. O ar passa por serpentinas e resfriado pelo ar que entra e ao sair da cmara resfriado pro gua.

Aquecimento por meio de compresso

Os compressores possuem na entrada do ar um filtro para reteno de partculas maiores de poeira;

Efetivo na destruio de clulas vegetativas.

 Pode ocorrer perdas do ar aquecido comprimido devido: Canalizao que transporta o ar desde o compressor at as dornas; Filtros para a esterilizao do ar;

Dispersor de ar no interior da dorna;

Altura da coluna lquida (mosto em fermentao);

Presso ligeiramente superior atmosfrica na qual se mantm a dornas para prevenir contaminaes.

b) Esterilizao por Radiao

Teoricamente muitos tipos de radiaes podem ser utilizadas na esterilizao do ar; Fatores: eficincia na destruio de mos.; custo da radiao; periculosidade e efeitos colaterais de sua utilizao; Raios ultravioleta (baixo poder de penetrao, tempo longo, no utilizado em fermentao); Usos: desinfeco do ar de um ambiente

c) Esterilizao por Filtrao

O mais importante e o de maior aplicao; Ex.: algodo, carvo, l de vidro, papel, nylon e teflon (forma de fibra), polilcool de vinila e steres de celulose (forma de placas ou folhas porosas), vidro sintetizado, metal sintetizado, materiais cermicos. Classificam-se: Filtros absolutos 100% de reteno (apresentam poros, reteno mecnica na superfcie do material filtrante); Filtros de camadas fibrosas (algodo, l de vidro);

Filtros de placas porosa (filtros de polilcool de vinila, filtros de acetato de celulose);

Filtros de vela ou de cartucho (cermica porosa, vidro sintetizado, finas membranas porosas de ster de celulose Milipore)

Agitao e Aerao em Fermentadores

Critrios de um sistema de agitao e aerao para um tanque de fermentao:
Disperso de um ou mais gases num lquido, na forma de pequenas bolhas, para acelerar os processos de transporte de massa de uma fase a outra; Suspenso de partculas slidas (mos., substratos insolveis);

Disperso de um lquido imiscvel de maneira que possa ser utilizado eficientemente pelo mo.;
Facilitar a troca de calor entre o lquido em fermentao e o sistema de resfriamento.

Mecanismo de Transporte de Massa (aerao e agitao)

Facilitar o suprimento ao mo. em desenvolvimento de quantidades adequadas de nutrientes existentes no lquido e de oxignio existentes na bolha de ar.

Resistncia do transporte de oxignio:

Resistncia da fase gasosa entre o seio do gs na bolha e a interface gs-lquido (1/k1); Resistncia da interface gs-lquido (1/k2); Resistncia da fase lquida, desde a interface at o seio do lquido (1/k3); Resistncia atravs da fase lquida (1/k4); Resistncia entre o lquido e a interface lquido-clula (1/k5); Resistncia intercelular (1/k5); Resistncia a reao do oxignio com as enzimas respiratrias das clulas (1/k7). onde: k(n=1,...7) coeficiente de conveco de massa.

A demanda de oxignio pode variar de:

Microrganismo para microrganismo;

das condies utilizadas;

A quantidade de oxignio utilizada pelo mo. pode no ser a mesma durante toda a fermentao.

Fatores que podem influenciar na velocidade de consumo de oxignio:

Clulas jovens consomem mais oxignio do que clulas velhas; O consumo de oxignio maior durante a fase logartmica de desenvolvimento.

Remoo dos produtos do metabolismo

Produtos volteis: CO2, cetonas, aldedos (arraste pelo ar); Produtos no-volteis: agitao e borbulhamento (dilui os produtos no meio de fermentao).
Instrumentao e Controle de Processos Fermentativos
Toda operao em processo fermentativo tem como objetivo a manuteno da ausncia de qualquer microrganismo indesejvel.

Princpios gerais para operao assptica em fermentao

Causas de contaminao:
Inculo; Pode ser durante a inoculao no fermentador por m esterilizao das linhas de transferncia; Esterilizao deficiente do meio de cultura ou do ar utilizado para aerar a cultura; Falta de um controle adequado da espuma.

Preveno
Equipamentos: deve permitir a esterilizao e ser de fcil limpeza.
Tanques com paredes lisas e polidas; As soldas devem ser polidas e sem cavidades; No devero existir cantos vivos dentro do fermentador; As tubulaes e vlvulas devem permitir fcil circulao de vapor e nem ter pontos que acumulem matrias-primas.

Limpeza: ambiente, tubulaes, gaxetas, vlvulas, etc.

Lembrete: quanto menor a populao bacteriana nas reas de trabalho, tanto menor o risco de contaminao.
Treinamento dos operadores: esse treinamento deve ser contnuo. Deve repassar conceitos bsicos de fermentao, assepsia, e das operaes que compem o processo fermentativo, higiene pessoal.

Superviso: garantir a execuo das operaes e controle do processo. Tomar decises sobre conduo e controle de processo fermentativo (estabelecer o momento correto para uma inoculao, interromper ou incrementar a adio de nutrientes).

Operaes de Transferncia
Transferncia de frasco a frasco preparo de um inculo

Culturas: liofilizadas, congeladas, esporos em gar.

Salas estreis Cabinas asspticas

Transferncia de frasco a tanque inoculao de um germinador (ou semeador)

Tubulaes (estril, resfriada).

Transferncia de tanque a tanque inoculao de um fermentador

Tubulao

Operaes de Esterilizao
Esterilizao do meio de cultura
Eliminar todos os microrganismos.;

Um certo cozimento pode ser vantajoso para o mo.;

Outras alteraes: prejudiciais e destruio do valor nutritivo ou produo de toxinas ou compostos estranhos que inibiro o crescimento do mo. ou da atividade metablica desejada. Essas alteraes dependem: natureza dos constituintes, temperatura, tempo, pH do mosto. Esterilizao de carboidratos e protenas separadamente: (Reao de Maillard e desnaturao protico)

Natureza da matria-prima
P fino ou granulado; Lquidos aquosos e oleosos; Facilmente esterilizados quando esto dispersos ou dissolvidos.

Armazenamento das matrias-primas

Local limpo, seco e fresco

Limpeza das reas de trabalho e do equipamento Limpeza geral e emprego de desinfetantes para a desinfeco de equipamentos e rea de trabalho.

Ordem de adio das matrias-primas no momento de preparo do meio.

Diretamente ao fermentador ou em um tanque de preparo de meio de cultura; Para ps e leos, primeiro o p depois os leos dispersos.

Esterilizao em autoclaves
Meios de cultura em pequenos volumes (121C/15min.)

Esse tempo depende: volume de lquido/volume do frasco, tamanho e material de construo do recipiente, composio do meio de cultura.

Esterilizao de um fermentador
Considerar dois processos: contnuo e descontnuo.

Processo Descontnuo
Entrada de vapor para o tanque (igual a autoclave); Resfriamento.

Desvantagens: tempo longo (6-10h), maior consumo de vapor e gua, valor elevado. Processo Contnuo (T e tempo curto):

Vapor e presso controlados;

Controles
Cuidados com o mo. ou cultura; Controle do substrato; Controle das condies fsicas ambientais.

Controle do Microrganismo
O cultivo dever conter uma quantidade de clulas suficiente para garantir a mxima produtividade no equipamento disponvel; O cultivo dever ser feito de modo a preservar ao mximo a capacidade de produo da cultura original; O cultivo dever estar isento de mos. contaminantes.

Controle do Substrato
Meio semelhante ao utilizado na fermentao; Controle quantitativo dos componentes bsicos do substrato.

Controle das Condies Fsicas Ambientais

Temperatura: manuteno (0,5C);
Presso: manuteno de presso positiva (1Kgf/cm2); Agitao: aerbia (impede a ocorrncia de diferentes concentraes de nutrientes, pH, temperatura), provocar a disperso de bolhas de ar na massa lquida e permite que o oxignio chegue ao mo.; pH: correes durante o processo; Controle da espuma: conduz a perda do caldo fermentado e uma contaminao do fermentador pelo contato do caldo com o retentor do eixo do agitador e com as tubulaes de exausto;

Controle do Oxignio Dissolvido

O oxignio dissolvido varia como consequncia de diversos fatores (viscosidade e densidade da cultura no mosto).

Controle dos gases de exausto

A medio e o registro da concentrao de oxignio e/ou CO2 no gs de exausto de um fermentador nos permite avaliar a velocidade de crescimento do microrganismo.

Biorreatores
Biorreatores so recipientes para a fermentao industrial. Controle: aerao, pH e temperatura. Biorreatores diversas reas: Alimentos (bebidas, laticnios, vinagre), lcool, Petrleo, gua, Resduo, Solo, Agricultura.

Vantagens da bioconverses:
Condies de reaes amenas; Elevados rendimentos; Os organismos contm vrias enzimas que podem catalisar sucessivos passos numa reao. Na biossntese as clulas consomem nutrientes para crescer e produzir mais clulas e produtos importantes. Esta transformao dos nutrientes em energias e bioprodutos realizada por meio de vrias enzimas (catalisadores) que a clula utiliza numa srie de reaes para produzir os metablitos.

Produtos que permanecem na clula (produto intracelular), produtos fora das clulas (produto extracelular)
Clulas + fonte de + fonte de + fonte de + fonte de + carbono nitrognio oxignio fosfato mais clulas + produtos + H2O + CO2

BIORREATORES DE PETRLEO
Revoluo Industrial: 200 anos de m gesto do lixo industrial, Contaminao: manuseamento e eliminao inadequados de materiais perigosos.

BIORREMEDIAO o processo de tratamento que utiliza a ocorrncia natural de microrganismos para degradar substncias toxicamente perigosa transformando-as em substncias menos ou no txicas.

 Biodegradao para limpeza de derramamentos de leos e tratamentos de ambientes terrestres e aquticos contaminados com compostos xenobiticos.
BIORREMEDIAO: estmulo do crescimento microbiano no local contaminado e a adio de microrganismos degradadores de hidrocarbonetos.

BIORREMEDIAO: o bom uso de seres vivos ou seus componentes para restaurar ambientes poludos.

 BIORREMEDIAO: so processos que empregam microrganismos ou suas enzimas para degradar compostos poluentes.
UTILIZA-SE: microrganismos, fungos, plantas verdes, enzimas para atacar contaminantes do solo; EXEMPLOS: 1) degradao de hidrocarbonetos clorados por bactrias; 2) limpeza de derramamento do leo pela adio dos fertilizantes de nitrato ou de sulfato para facilitar a decomposio do leo pelas bactrias locais ou exteriores.

 3) tratamento de solos e cursos dgua contaminados: eficiente, econmico, baixos danos.

FUNDAMENTADA: processo de degradao microbiana e reaes qumicas combinadas com processos de engenharia, criando condies para maximizar as transformaes dos contaminantes orgnicos do solo.

TRS ASPECTOS PRINCIPAIS Existncia de microrganismos com capacidade catablica para degradar o contaminante; O contaminante deve estar disponvel ou acessvel ao ataque microbiano ou enzimtico; Condies ambientais adequadas para o crescimento e atividade do agente biorremediador

Contaminantes do solo em ordem decrescente: cloroalifticos, pesticidas, hidrocarbonetos aromticos, cloroaromticos, aromticos simples.
Bactrias e fungos: Enterobacter, Proteus, Klebsiella, Serratia, Bacillus, Nocardia, Azospirillum, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete e Trametes.

objetivo inocular o solo com microorganismos com capacidade de metabolizar resduos txicos, proporcionando maior segurana e menos perturbaes ao meio ambiente.

Tcnicas de Biorremediao
tratamentos in situ (no local) e "ex situ" (fora do local); tratamentos de superfcie ou subsuperfcie como o caso da bioventilao, que consiste na injeo de ar no solo (ou camada) contaminado para estimular a degradao do contaminante.

Vrios contaminantes podem ser tratados biologicamente com sucesso:

petrleo bruto; hidrocarbonetos do petrleo como gasolina (que contm benzeno, xileno, tolueno e etilbenzeno); leo diesel; combustvel de avio; preservativos de madeira; solventes diversos; lodo de esgoto urbano industrial; outros compostos xenobiticos ou biognicos, existindo mais de 300 compostos individuais.

Tipos e Estratgias para Biorremediao do Solo Passiva - consiste na degradao intrnseca ou natural pelos microorganismos do solo; Bioestimuladora - consiste na adio de nutrientes, como N e P, para estimular os microrganismos; Bioventilao uma forma de bioestimulao por meio da adio de gases estimulantes, como O2 e CH4, para aumentar a atividade microbiana decompositora.

 Bioaumentao - a inoculao do local contaminado com microrganismos selecionados para degradao do contaminante. Landfarming - aplicao e incorporao de contaminantes ou rejeitos contaminados na superfcie de solo no contaminado para degradao. O solo arado e gradeado para promover a mistura uniforme do contaminante e aerao. Compostagem - o uso de microorganismos termoflicos aerbios em pilhas construdas para degradar o contaminante.

Principais Dificuldades para o Sucesso dos Tratamentos Biolgicos de Solos Contaminados. Heterogeneidade do rejeito - os rejeitos so distribudos de modo heterogneo no solo e o contaminante pode ocorrer em formas no acessivas. Concentrao do contaminante contaminantes podem estar presentes em concentraes variadas (de muito baixa a muito alta). Se muito alta, pode ser txica e inibir o crescimento.

 Persistncia e toxidade - tratamentos biolgicos so eficientes para remover matrias biodegradveis e de baixa toxidade.
Contaminantes resistentes biodegradao exigem adequadao nutricional do solo (com fonte de C). Condies adequadas para o crescimento microbiano condies ambientais favorveis umidade, temperatura e aerao do solo.

Aspectos Biolgicos das Tcnicas mais

Comumente Empregadas Landfarming - consiste na aplicao do contaminante em forma lquida ou slida na camada arvel do solo, onde se concentram 90% dos microrganismos que usam os contaminantes como fonte de energia.

 Biorremediao Fase Slida - constitui-se de pilhas de solo, que funcionam como clulas de tratamento. Nas clulas realiza-se controle mais rigoroso da volatilizao, lixiviao e escoamento superficial de material contaminado. Outro mtodo: compostagem um tratamento controlado pela gerao de calor pelos aerbios termoflicos. A elevao da temperatura na massa contaminada ideal para tratamento de rejeitos e lodos diversos, incluindo contaminantes explosivos. um processo barato e fcil de ser monitorado.

 Tratamentos in situ" - so baseados na manipulao da fase aquosa e estmulo da decomposio pela injeo de ar (bioventilao) e suplementao com nutrientes em galerias e poos de infiltrao.

comum o uso de plantas nesse tipo de tratamento, as quais fornecem substratos atividade microbiana enquanto os microrganismos transformam os contaminantes.

 BIOAUMENTAO - envolve a inoculao do solo com culturas puras de microrganismos para degradaes de contaminantes especficos ou de microrganismos transgnicos contendo plasmdeos degradadores (mais apropriada para contaminaes recentes e onde se pretende aplicar a degradao acelerada).

Aplicao: herbicidas, clorados e carbonatos.

hidrocarbonetos

 Uma estratgia que vem ganhando espao na biorremediao o uso de plantas para acelerar o processo de degradao. As plantas, alm de atuarem diretamente sobre vrios tipos de contaminantes, contribuem indiretamente atravs do efeito rizosfrico sobre a microbiota biodegradadora.

EXEMPLOS: O tratamento de um solo contaminado com hidrocarbonetos aromticos policclicos (HAP's) em concentrao de 185 mg kg-1 de HAPs total e 50 mg kg-1 de HAP's carcinognicos, sofreu reduo de 26% aps 180 dias de tratamento sem planta e de 57% quando o solo foi semeado com Panicum virgatum (switchgrass). Na frao carcinognica houve reduo apenas nas parcelas com planta, sendo esta reduo da ordem de 30%.

PRODUO DE BIODIESEL VIA CATLISE ENZIMTICA As enzimas so protenas que aceleram as reaes qumicas em sistemas biolgicos que ocorrem sob condies termodinmicas no-favorveis.

Quimicamente so polmeros formados por aminocidos e que possuem as vantagens de operarem em condies suaves (temperatura e presso).

 A catlise enzimtica sintetiza especificamente steres alqulicos, permite a recuperao simples do glicerol, a transesterificao de glicerdeos com alto contedo de cidos graxos, a transesterificao total dos cidos graxos livres, e o uso de condies brandas no processo, com rendimentos de no mnimo 90%, tornando-se uma alternativa comercialmente muito mais rentvel.

 Transesterificao uma reao qumica entre um ster (RCOOR) e um lcool (ROH) da qual resulta um novo ster (RCOOR) e um lcool (ROH).

Aplicao da Transesterificao

Na produo de Biodiesel. O processo iniciase juntando o leo vegetal com um lcool (metanol, etanol, propanol, butanol) e catalisadores (que podem ser cidos, bsicos ou enzimticos).

 A transesterificao enzimtica foi comparada com a mais utilizada comercialmente (transesterificao alcalina) e se sobressaiu nos seguintes aspectos: temperatura de reao, gua na matria-prima,

cidos graxos livres no leo no refinado,

recuperao do glicerol, rendimento e purificao de metil steres.

 As lpases hidrolisam acilgliceris em cidos graxos, diacilgliceris, monoacilgliceris e glicerol. So comumente encontradas na natureza, podendo ser obtidas a partir de fontes animais, vegetais e microbianas.

 A utilizao de uma enzima imobilizada tem como vantagens a inexistncia de rejeito aquoso alcalino, menor produo de outros contaminantes, maior seletividade, bons rendimentos, reutilizao em outras reaes, alm de melhorar a estabilidade e atividade da enzima, essas vantagens motivam a realizao de pesquisas que visem diminuir a principal desvantagem da metodologia: alto custo das enzimas puras.

Biorremediao Vantagens Biodegrada substncias perigosas ao invs de apenas transferir o contaminante de um meio para outro Baixo custo (at 85%) de seu funcionamento Possvel tratamento in situ Produtos utilizados no apresentam risco ao meio ambiente e no so txicos Muitas molculas no so Tratamento de resduos considerados de difcil degradao Mtodo pouco evoludo no Brasil Necessidade de maior entendimento No uma soluo imediata Limitaes

Acompanhamento durante o processo

biodegradveis
Substncias txicas ao Uso em reas de proteo ambiental, indstria de alimentos, entre outras tratamento microorganismo inviabiliza o

 Produo de Biodiesel

 A biorremediao microbiana, representa a principal tecnologia de remediao de solo, por ser:

De baixo custo (US$ 13 a 1.500 por tonelada de solo tratado) em relao a outras tcnicas;

Ser uma soluo permanente;

Fundamentada em processos naturais; Aplicvel a uma grande contaminantes; De grande aceitao pblica. variedade de

FERMENTAO SEMI-SLIDA
IMPORTNCIA: na utilizao integral de resduos gerados de processos industriais; O estabelecimento desta tecnologia envolve princpios e desafios que levam os cientistas a desenvolverem procedimentos tecnolgicos sustentveis;

Este pensamento atende a proposta ZERI, Zero Emissions Research Initiative.

FERMENTAO SEMI-SLIDA
A fermentao semi-slida (FSS) ou slida um processo microbiano que se desenvolve na superfcie de materiais slidos, que apresentam a propriedade de absorver ou de conter gua, com ou sem nutrientes solveis. Estes materiais slidos podem ser biodegradveis ou no. Para a FSS, necessrio que os microrganismos cresam com nutrientes sob ou sobre a interface liquido slido.

FERMENTAO SEMI-SLIDA(FSS)
Esta tecnologia tem apresentado crescimento acentuado em pases do ocidente devido a viabilidade tcnico- econmica. Muitos microrganismos foram utilizados em todas as reas da biotecnologia(ex.: agricultura, sade, energia e meio ambiente. APLICAES: biotransformao dos resduos e subprodutos (slidos e lquidos) trouxeram como conseqncias melhoria do saneamento do ambiente, o estabelecimento de indstrias secundrias e melhoria de estrutura de preos.

FERMENTAO SEMI-SLIDA (FSS)

CARACTERSTICAS desta fermentao: uma em que as condies para o estado slido so propiciadas pelo prprio substrato. Na outra FSS, o desenvolvimento do processo se d utilizando um suporte inerte.

APLICAO COMERCIAL: 1) aplicaes scio-econmicas tais como a compostagem de resduos, valorizao de produtos lignocelulsicos e fibras alimentares; 2) aplicaes economicamente lucrativas, tais como, a produo de enzimas, cidos orgnicos e alimentos fermentados.

FERMENTAO SEMI-SLIDA (FSS)

VANTAGENS FISICO-QUMICAS:
Baixa atividade de gua gerando um processo industrial limpo, com baixos nveis de gua residual, o que incorre tambm em economia energtica no processo de recuperao.

baixo gradientes produtos.

de

temperatura,

nutrientes

A heterogeneidade microscpica do substrato considerado como sua principal fora para o acrscimo de rendimento de produtos e por causar adequadas alteraes na fisiologia microbiana.

VANTAGENS FSS
O meio geralmente simples, consistindo de produtos agrcolas no refinados que podem conter todos os nutrientes necessrios para o crescimento do microrganismo. Prtratamento: cozimento com gua para umidificar ou dilatar o substrato, ou a quebra deste para aumentar a acessibilidade aos nutrientes internos ou a moagem de grandes blocos de substrato para partculas menores;

 Tratamento de efluentes e de resduos simples ou minimizado. Geralmente todo o produto utilizado como rao animal; O custo de esterilizao reduzido, pois se aquece menos gua; O espao ocupado pelo equipamento de fermentao pequeno considerando-se o rendimento do produto. Utiliza-se menor quantidade de gua e o substrato concentrado; Como a maioria das bactrias requer altos nveis de mistura lquida, a FSS exclui, ou reduz, sensivelmente, o problema da contaminao bacteriana;

 O meio facilmente aerado, desde que haja espao entre as partculas do substrato; A solubilidade e difuso de oxignio e outros gases, so maiores em FSS; O resduo remanescente possui um volume reduzido e este resduo no apresenta condies para o desenvolvimento de patgenos;

 Geralmente, o nico componente necessrio a ser adicionado ao meio gua, embora, ocasionalmente, outros nutrientes como fonte de nitrognio ou minerais possam ser adicionados;

Torna-se possvel a obteno de esporos que so impossveis de se obter em cultura submersa; Menor custo dos equipamentos;
Exige menor demanda de energia;

DESVANTAGENS
Limitao dos tipos de microrganismos devido a baixa atividade de gua; Microrganismos mais utilizados: fungos e leveduras; Gerao de calor; A transferncia de oxignio entre as partculas do meio pode se tornar um problema quando se utiliza granulometria do substrato muito grande; Medidas de pH, O2, CO2 e clculo de rendimento de produto so mais complexos;

MATRIAS PRIMAS SUBSTRATOS VIVEIS

Resduos de origem agroindustrial, so dois: celulsicos (polpa de caf, bagaos, palhas, cascas, cascas de frutas processadas, etc) e amilceos (batata, milho, mandioca, banana e seus resduos, entre outros).

Caractersticas Comuns:

so recursos naturais renovveis;

sua produo produtiva; depende de outra atividade

so produzidos em grande quantidade e constituem um problema sanitrio e ecolgico em sua regio; necessitam de um prvio tratamento fsico ou qumico para que lhes dem novas caractersticas fsicas que facilitem seu processamento e industrializao.

 FLUXOGRAMA

 Composio de agroindustrial.

resduos

de

origem

1: bagao de cana, 2: polpa de caf, 3: casca de arroz, 4: farinha de mandioca, 5: batatas de descarte, 6: palha de trigo. 7: milho

Distribuio dos resduos e o meio ambiente

1 Ton de resduo / Ton de produto principal.

RESDUOS URBANOS: faz-se uma estimativa da quantidade produzida por um indivduo (cidade grande 300 g de resduos (base mida) dirios / pessoa);

MEIO AMBIENTE: a medida de impacto ambiental no um problema simples, este depende da natureza dos meios receptores (ar, gua ou solo), do tipo de contaminantes e da quantidade de contaminantes.

 TECNOLOGIAS industrial)

LIMPAS

(resduo

QUATRO ELEMENTOS FUNDAMENTAIS: separao de linhas de resduos, isto , tratamento diferenciado segundo a natureza do resduo; reduo do consumo de gua; otimizao da recirculao e aproveitamento dos resduos; auditorias ambientais contnuas.