Centro Universitrio da Zona Oeste

Curso: Tecnologia em Produo de Frmacos e Farmcia Perodo: 5 perodo Disciplina: Microbiologia Industrial Professora: Sabrina Dias

AULA 5: Engenharia Gentica

Biotecnologia

Apenas

variando

seqncia

de

palavras do cdigo no DNA, inumerveis variaes de protenas com propriedades muito dspares podem ser obtidas,

suficiente para gerar a enorme variedade da vida biolgica.

O DNA uma corda muito longa de

palavras-cdigos", ordenadas em

uma seqncia. Contm as instrues para criar todas as protenas do corpo. As propriedades de uma protena so determinadas inteiramente por sua frmula, que se define pela seqncia de seus blocos constituintes, os

aminocidos. O conjunto das palavras

do cdigo requeridas para descrever uma protena chamado um "gene.

Biotecnologia

Biotecnologia

Na engenharia gentica, um gene ou, mais comumente, um conjunto de alguns genes, retirado do ADN de um organismo e introduzido no DNA de outro organismo. Isto ns chamamos de pacote de insero" ilustrado em vermelho:

Biotecnologia

Vantagens da utilizao de microrganismos para estudos

genticos:
Ciclo vital rpido, permitindo estudo de caractersticas hereditrias em curto tempo; sendo seres microscpicos podem ser cultivados em grande nmero em pouco espao; menos complexos que plantas e animais superior em relao s exigncias nutricionais e de cultivo; apresenta srie nica de cromossomos haplides caractersticas hereditrias manifestam-se de modo direto.

Aplicao prtica
Clonagem de fragmentos de DNA Seqnciamento de DNA. Amplificao de uma seq. especifica de DNA pela tcnica da reao em cadeia da polimerase (PCR).

Construo de bibliotecas genmicas e de cDNAs.

Vetores de expresso (procariotos e eucariotos). Plantas transgnicas.

Animais transgnicos.

Requer: Um mtodo para clivar e voltar a ligar in vitro diferentes molculas de DNA originando molculas de DNA recombinante. Um elemento transportador de genes, o vetor gentico, que, ao ser multiplicado por uma clula hospedeira, possibilitar que o gene estrangeiro que transporta tambm o seja. Um meio de introduzir o vetor numa clula viva, capaz de multiplic-lo. Uma maneira de selecionar, dentre uma grande populao de clulas, apenas aquelas que tiverem efetivamente incorporado o rDNA.

A tcnica central da metodologia do DNA recombinante a clonagem

molecular, a qual consiste no isolamento e propagao de molculas de DNA idnticas. A clonagem molecular compreende pelo menos dois estgios importantes: Primeiro, o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto ligado

a uma outra molcula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de
DNA recombinante. Segundo, a molcula do DNA recombinante introduzida numa clula hospedeira compatvel, num processo chamado de transformao. A clula hospedeira que adquiriu a molcula do DNA recombinante agora chamada de transformante ou clula transformada.

Biotecnologia

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

1. Obteno do DNA a ser clonado

2. Escolha do vetor
3. Ligao do vetor com o inserto 4. Transformao da bactria 5. Seleo dos clones recombinantes

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

OBTENO DO DNA A SER CLONADO

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

1.Obteno do DNA a ser clonado

Extrao de DNA; PCR Digesto Purificao

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

Primeiro passo: obteno do gene de interesse

Enzimas de restrio ou endonucleases de restrio Tipos de clivagem Cega ou Abrupta: no eixo de simetria; Coesiva: fora do eixo de simetria;

ENZIMAS DE RESTRIO
As enzimas de restrio ou endonucleases de restrio so divididas em vrias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos stios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, so protenas monomricas ou dimricas e clivam o DNA no mesmo stio do seu reconhecimento. O stio de reconhecimento deste tipo de enzima normalmente uma seqncia

palindrmica, isto , ela tem um eixo de simetria e a seqncia de

bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na direo oposta

Cada enzima de restrio gera ENZIMAS DE RESTRIO uma famlia nica de fragmentos quando cliva uma

EcoRI

molcula de DNA especfica.

ENZIMAS DE RESTRIO

ENZIMAS DE RESTRIO

ENZIMAS DE RESTRIO

Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia nica de bases. DNAs de origens diferentes sob a ao da

mesma enzima de restrio produzem fragmentos com o mesmo

conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactria e homem) podem ser ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a ligao for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de

bases, os fragmentos sero ligados permanentemente.

ENZIMAS DE RESTRIO

Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia nica de bases. DNAs de origens diferentes sob a ao da

mesma enzima de restrio produzem fragmentos com o mesmo

conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactria e homem) podem ser ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a ligao for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de

bases, os fragmentos sero ligados permanentemente.

ENZIMAS DE RESTRIO

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Em alguns casos no possvel utilizar enzimas de restrio, logo: procede-se mecnica do DNA; fragmentao

sntese qumica do DNA; obteno do DNA complementar (cDNA) -- obtido pela ao da transcriptase reversa a partir de um mRNA; biblioteca genmica, banco genmico ou Genoteca -- arquivo de DNA de interesse inserido num vetor para uso posterior.

Sntese de cDNA fita dupla.

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Esquema dos processos realizados numa reao de PCR:

Aps a desnaturao das fitas molde,

ocorre o pareamento
dos primers. A enzima, representada em verde, adiciona os desoxinucleotdeos complementarmente s fitas-me.

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

Depois da clivagem...

A famlia de fragmentos gerados so geralmente

detectada

pela

separao

destes

fragmentos

por

eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em funo de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente.

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Molculas de menor massa iro migrar mais rapidamente que molculas de maior massa. Isso permite a separao de molculas de DNA de diferentes tamanhos.

ESCOLHA DO VETOR

Segundo Passo: Escolha dos Vetores de clonagem molecular

Aps o isolamento de uma informao gentica, por exemplo um

fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrio, este fragmento dever ser inserido numa outra molcula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informao gentica em centenas de cpias. Este processo de amplificao obtido atravs do uso de molculas de

DNA que so os chamados vetores de clonagem molecular.

Os tipos bsicos de vetores usados na metodologia do DNA recombinante apresentam caractersticas especiais que os tornam excelentes veculos de clonagem em diferentes situaes.

VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

PLASMDEO Plasmdeos so pequenas molculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessrios para a sua replicao e pelo menos um gene que confere resistncia a antibitico. Estes elementos genticos extra cromossomais usados como veculos de clonagem desde que capacitem a amplificao do segmento do DNA neles clonado.

VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

FAGOS Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular o denominado bacterifago , o qual comporta-se como um vrus da E.coli. Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de clonagem que o DNA inserido no fago empacotado in vitro. Este processo altamente eficiente quando comparado com o da transformao bacteriana com plasmdeos.

VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

COSMDEO A clonagem de fragmentos de DNA no fago l apresenta uma limitao, pois o fragmento a ser clonado no pode ser maior do que cerca de 15kb. Os cosmdeos, so plasmdeos que contm um fragmento de DNA do fago que inclui o stio cos. Estes cosmdeos

podem ser usados como veculos de clonagem molecular empregando

o sistema de empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago (cabea e cauda) e assim usado para infectar a clula hospedeira.

As

enzimas

do

sistema

de

empacotamento

do

fago

reconhecem os dois stios cos situados de 35 a 49 kb de distncia e neste caso, somente fragmentos desta ordem de tamanho sero convenientemente empacotados.

VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular o uso de enzima de restrio que produz extremidades compatveis durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor).

Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molcula hbrida
dever ser introduzida numa clula hospedeira geralmente bactrias, por um processo chamado de transformao, para que o vetor possa sofrer replicaes e consequentemente amplificar o nmero de cpias do inserto.

VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

VRUS O vrus SV40, isolado de clulas tumorais de macacos, foi um dos primeiros sistemas virais utilizados para introduzir genes em clulas de mamferos. O DNA do SV40 apresenta 5.200 pares de bases e pode ser dividido em duas regies quanto a expresso gnica viral.

VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

BACTERIFAGO M13
O bacterifago M13 um fago filamentoso da E. coli e contm uma nica fita de DNA envolvida por protenas virais. Durante o seu ciclo, a clula hospedeira infectada pela fita (+) a qual servir como molde para a sntese da outra fita (-). A dupla fita denominada de forma replicativa, permanece no interior da clula hospedeira e amplificada at 200 cpias por clula, quando ento a fita negativa no mais se

replica e a fita positiva continua a ser sintetizada, adquire as protenas

da cpsula viral e sai da clula hospedeira atravs de processo no ltico

VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

FAGOMDEOS Apesar do bacterifago M13 apresentar grande aplicabilidade especialmente nos processos de seqenciamento de DNA, foram desenvolvidas outras geraes de fagos, os quais reunem as vantagens do fago M13 e a do plasmdeo. Estes vetores so chamados de fasmdeos ou fagomdeos.

VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

LIGAO DO GENE NO VETOR

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Terceiro Passo: LIGAO DO GENE NO VETOR

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Terceiro passo: hospedeiros do DNAr Hospedeiros do DNA recombinante Caractersticas ideais: Capacidade de crescer em meios de cultura baratos. Estveis em cultura.

No patognicos.
Organismos utilizados: Hospedeiros procariticos -- E. coli, B. subtilis. Hospedeiro eucaritico -- S. cerevesiae, clulas de mamferos em cultura.

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Terceiro passo: hospedeiros do DNAr Transformao Transfeo Microprojteis Eletroporao

Transformao -- a clula hospedeira tornada competente (cloreto de clcio e choque trmico) para o vetor de clonagem ser introduzido; normalmente empregada para procariotos.

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Transfeo -- quando o vetor de clonagem tem caractersticas de vrus ou plasmdio, a clula hospedeira pode ser transfetada para inserir a molcula recombinante; normalmente empregada para eucariotos. Microprojteis -- partculas cobertas com DNA so projetadas contra uma clula e penetram em sua membrana. Eletroporao -- a clula submetida a um campo eltrico que faz com que pequenos poros sejam abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido.

ENZIMAS DNA ligase

A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de
uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia.

DNA ligase

TRANSFORMAO DA BACTRIA

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

Quarto Passo :Transformao do vetor

2o passo:

1o passo:

3o passo:

4o passo:

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

SELEO DOS CLONES RECOMBINANTES

Seleo dos clones recombinantes

O DNA isolado presente na placa de lise positiva, identificado na placa de petri original e submetido anlises posteriores.

CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE

A obteno de uma molcula de DNA recombinante, atravs da ligao de um fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor,

um processo direto e relativamente simples. Deste modo, clonar um

determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele codificado(s) necessrio obteno de colees

de clones recombinantes, portadores de molculas representantes de

todo o genoma, ou de colees de clones de cDNAs derivados de toda a populao de mensageiros da clula ou tecido de interesse. Essas colees de clones de DNA recombinante so chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genmica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genmico ou Biblioteca de cDNA, no caso dos clones terem sido construdos a partir de DNA complementar

CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE

Bibliotecas virtuais de DNA

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi http://genome.dkfzheidelberg.de/menu/husar/w2hdkfz /index.shtml

CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE

CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE De modo resumido, o procedimento para a sntese, clonagem e isolamento de cDNAs especficos envolve 4 etapas: 1) Sntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros

isolados do tecido de interesse.

2) Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor escolhido. 3) Introduo dos cDNA recombinantes nas clulas hospedeiras, onde sero replicados. Isto resultar na amplificao dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na expresso das protenas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs. 4) Identificao dos clones de interesse atravs de um processo de triagem dos clones recombinantes.

Recombinao em Microrganismos
1 Conjugao
2 Transduo 3 - Transformao

Recombinao em Microrganismos
CONJUGAO

Recombinao em Microrganismos
Transduo

Recombinao em Microrganismos
Transformao
Transformao no requer contato entre as clulas, mas produz recombinantes. Ocorre lise da clula para que material gentico esteja livre no meio; 1) Clula receptora apta para receber DNA = competncia 2) Formao de recombinante = duplicao do DNA repassando os genes da clula doadora