BIOLOGIA MOLECULAR

PCR
Reao em Cadeia da Polimerase
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BIOLOGIA MOLECULAR

Mtodo baseado na AMPLIFICAO enzimtica de um determinado segmento de DNA.

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BIOLOGIA MOLECULAR

Extenso de oligonucleotdeos (primers ou seqncias iniciadoras) que hibridizam com as fitas complementares de uma determinada seqncia-alvo.

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BIOLOGIA MOLECULAR

O mecanismo cclico, automtico e permite a produo de mltiplas cpias do segmento inicial.

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BIOLOGIA MOLECULAR

COMPONENTES DA PCR
DNA alvo Seqncias Iniciadoras DNA Polimerase Substrato Tampo

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ETAPAS FUNDAMENTAIS BIOLOGIA MOLECULAR

1. Etapa de Desnaturao: Temperatura elevada separa a dupla hlice de DNA. 2. Etapa de Hibridizao ou Associao: Hibridizao especfica dos primers s duas fitas de DNA. 3. Etapa de Extenso: Sntese de uma nova fita de DNA, atravs da Taq polimerase, pela adio de nucleotdeos s extremidades 3livres.
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DESNATURAO DO DNA

BIOLOGIA MOLECULAR

90-100C

68-72C
POLIMERIZAO DA CADEIA

>40C
HIBRIDIZAO DOS PRIMERS
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BIOLOGIA MOLECULAR

DNA alvo dATP, dTTP, dCTP, dGTP Tampo Primers (2) Taq polimerase

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A TCNICA DA PCR

BIOLOGIA MOLECULAR

A finalidade da PCR produzir rapidamente uma grande quantidade de cpias de uma regio determinada do DNA, tornando-as disponveis para estudo.

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A TCNICA DA PCR

BIOLOGIA MOLECULAR

Uma nica molcula de DNA, aps 30 ciclos de desnaturao, hibridizao e extenso, produzir 1,4 bilho de cpias da regio limitada pelos primers. Os produtos obtidos so submetidos eletroforese em gel de agarose e corados com brometo de etdio.
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COMPONENTES DA PCR BIOLOGIA MOLECULAR Taq DNA polimerase

Polimerase termo-estvel encontrada no micrbio Thermus aquaticus, habitante natural de fontes naturais de gua quente. Permanece ativa durante todo o processo de amplificao. Sua atividade mantida por 45 minutos a 95oC.
Excesso de enzima pode prejudicar a reao, e at inibi-la.
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BIOLOGIA MOLECULAR

Desoxinucleotdios Trifosfatos (dNTP) So as bases nitrogenadas que constituiro as novas cadeias de DNA. As 4 bases devero ter concentraes equivalentes. Quando em baixas concentraes:
Diminuem os erros cometidos pela ao da polimerase.

Quando em excesso ou em desequilbrio:

Provocam erros de incorporao de bases, gerando cpias alteradas.
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BIOLOGIA MOLECULAR

O on Magnsio
Mg+2 um co-fator enzimtico que desempenha um importante papel na atividade da polimerase. Aumento da concentrao:
Hibridizao eficiente dos primers com o DNA.

Diminuio da concentrao:
Elimina a possibilidade de produto inespecficos.

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BIOLOGIA MOLECULAR

Concentrao e Seqncias de primers

A extremidade 3 no pode ser alterada. A extremidade 5 pode ser modificada.
Adio de stios para enzimas de restrio, o que facilita a clonagem.

Altas concentraes:
Sntese de produtos inespecficos. Polimerizao de primers Ligao entre primers, resultando em baixa produo do produto desejado.
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BIOLOGIA MOLECULAR

Temperatura Mdia (Tm) de Hibridizao

Depende de vrios fatores, principalmente dos primers utilizados na reao.
Quanto maior for a quantidade de bases C e G, esta temperatura tende a aumentar. Primers de 18 a 25 nucleotdeos contendo 50% a 60% de G+C so adequados.
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BIOLOGIA MOLECULAR

Tempo de Extenso dos primers

Comprimento do fragmento a ser amplificado Concentrao do DNA molde . Temperatura tima:
72oC, por 1 minuto aproximadamente, 1.250pb. para adicionar,

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Tempo e Temperatura de Desnaturao

Desnaturao incompleta Reduo do produto amplificado. Temperatura normal: 95oC por 5 minutos (desnaturao inicial) 30 segundos (desnaturao de ciclagem). Temperaturas mais altas dependem da quantidade G + C. Perda de atividade enzimtica.
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BIOLOGIA MOLECULAR

Sensibilidade da Amplificao
Uma nica clula ou uma pequena quantidade de clulas (amostras de vilosidades corinicas, esfregaos da boca, extrao de DNA).

Tamanho dos Fragmentos Amplificados

Varia de 2-3 kb.

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VARIAES DA TCNICA DE PCR

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BIOLOGIA MOLECULAR

RT - PCR
Mtodo de amplificao que utiliza molculas de RNA para converte-las em DNA complementar (cDNA). Enzima utilizada a Transcriptase reversa (RT). O cDNA obtido ento utilizado no PCR. Fornece dados quantitativos e qualitativos.

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Nested-PCR
Realizao de um PCR utilizando como molde, o produto amplificado de um primeiro PCR. Quantidade reduzida de material gentico; Confirmao de que o produto amplificado realmente o que se deseja utilizar.

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RFLP - PCR
Utiliza a atividade das enzimas de restrio para digerir os produtos amplificados numa PCR. A digesto revela stios de restrio que podem estar alterados e possveis variaes genticas no produto amplificado.

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PCR multiplex So utilizados 2 ou mais fragmentos de DNA, obtidos de diferentes organismos mas numa mesma amostra. Exemplo o homem e um vrus. Investigar a presena de um determinado microorganismo na circulao de um indivduo. Coleta-se uma amostra de sangue; Extrai DNA; Amplificao com 2 pares de primers.
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BIOLOGIA MOLECULAR

PCR em Tempo Real

Tcnica que permite o acompanhamento do nmero de cpias feitas num PCR. Utiliza-se uma sonda com um marcador fluorescente que hibridiza internamente no DNA alvo. Quando degradada pela polimerase, libera uma fluorescncia que captada e processada pelo computador.
Bastante utilizada para verificao de carga viral.
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BIOLOGIA MOLECULAR

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BIOLOGIA MOLECULAR

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BIOLOGIA MOLECULAR

APLICAES
Deteco de delees/inseres determinadas pela gerao de produtos amplificados que apresentam alteraes em seu tamanho. Deteco de mutaes pontuais (substituies de bases) conhecidas ou no, que geram polimorfismos genticos.
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BIOLOGIA MOLECULAR

Diagnstico pr-natal ou pr-implantacional (particularmente para doenas herdadas). Na tipagem para transplantes de rgos e susceptibilidade para doenas auto-imunes especficas (deteco de polimorfismo para HLA).

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BIOLOGIA MOLECULAR

No diagnstico e prognstico de doenas de ordem gentica, como cncer, atravs do estudo dos genes relacionados a essas doenas. Na medicina forense (DNA fingerprint).

No diagnstico de doenas infecciosas por agentes patognicos diversos.

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