Aula 15

Trabalho realizado pelos acadmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientao dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cludia Brodskyn, Songel Freire e Denise Lemaire, do Laboratrio de Imunologia do Instituto de Cincias da Sade da UFBA. Atualizado em outubro de 2003

Para aumentar ao mximo o tempo de sobrevida do enxerto, os receptores e os doadores potenciais devem ser histocompatveis. A tipagem tecidual feita com o auxlio de uma bateria de anticorpos monoclonais anti-HLA ou com o uso de seqncias de DNA especficas. Assim, possvel determinar as especificidades HLA expressas por cada indivduo e o grau de compatibilidade entre o receptor e o potencial doador. O ideal que o receptor no reconhea o tecido a ser enxertado como estranho, no desenvolvendo reao imunolgica. Sendo as molculas HLA os alvos principais da reao de rejeio, a compatibilidade HLA entre receptor e doador, diminui a chance de acontecer rejeio ao enxerto. O grau de compatibilidade mnima necessria entre receptor e doador depende do tipo de transplante.

A probabilidade de encontrar indivduos HLAcompatveis muito maior entre membros de uma mesma famlia do que entre indivduos no aparentados. Isto deve-se a uma caracterstica importante do HLA, o polimorfismo. Contudo, ainda que a probabilidade de dois indivduos no aparentados serem HLA-compatveis seja muito pequena, ela existe. Assim, pacientes que precisam de um transplante de medula ssea e no encontra um Doador HLA-compatvel na famlia podem encontrar um doador aps a busca em um banco de doadores voluntrios de medula ssea (quanto maior for este banco, maior ser a chance de encontrar um doador). Nos slides a seguir, voc ser apresentado (ou relembrar) a alguns importantes conceitos e conhecimentos na rea dos transplantes.

Transplante Clnico
rgos / Tecidos mais Transplantados - Rim - Corao - Fgado - Crnea - Medula ssea - Pele, etc...

Barreiras aos Transplantes

Autotransplante Isotransplantes

Tolerncia

Alotransplantes Xenotranplantes

Rejeio

Mecanismos de rejeio
1944 - Medawar,P.: publicao dos resultados de experimentos realizados em animais: A rejeio do enxerto resultante de uma resposta imunolgica, especfica e com memria, ao tecido ou rgo transplantado.

Mecanismos Imunolgicos da reao de rejeio

Mecanismos Humorais e Celulares

Linfcito Th

Linf. citotox.

Linfcito TDTH Macrfago ativado

citotoxicidade Expresso MHC Enzimas lticas

Linfcito B Plasmcito Clula NK ou macrfago

lise

lise

Aloantgeno MHC classe I

Aloantgeno MHC classe II

ADCC Receptor de Fc

ENXERTO

Kuby, 2000

Alvos da rejeio: antgenos de histocompatibilidade

Antgenos de Histocompatibilidade no Homem

HLA - Antgenos Leucocitrios Humanos (Dausset e Payne,1960)

A Compatibilidade HLA
Glicoprotenas HLA - presentes na membrana de todas as clulas nucleadas do organismo. Pessoas compatveis - possuem as mesmas molculas HLA

Molculas HLA
Grupos de protenas HLA importantes para os transplantes: HLA-A / HLA-B / HLA-DR
Designao numrica. Ex: HLA-A2; HLA-B7; HLA-DR8

Molculas HLA
Para cada tipo de molcula HLA h vrias protenas diferentes (polimorfismo) Veja: HLA-A : 124 HLA-B: 258 HLA-DR: 221

HLA - Gentica
Os genes esto localizados no cromossomo No 6. Ns somos diplides: dois cromossomos 6; dois conjuntos de genes do HLA (dois hapltipos).

Herana do HLA
O HLA herdado em conjunto (hapltipo). Um hapltipo do pai e um da me. Existem portanto um total de 4 combinaes diferentes dos hapltipos dos pais.

HLA - Herana
Pais

(0,5 / 0,5)

(0,5 / 0,5)

Filhos

(0,25) (0,25)

(0,25)

(0,25)

uma das permutaes possveis

Herana do HLA - Probabilidade

Chance que voc tem de ter um irmo: 1. HLA-idntico = 25% 2. HLA-distinto = 25% 3. HLA-haplo-idntico = 50%

HLA e Rejeio de Enxerto

Rejeio:
Hiperaguda - dentro de 48 h aps o enxerto Aguda acelerada - at 7 dias aps o enxerto Aguda - aps 7 dias Crnica (Doena crnica do enxerto) - vrios meses ou anos aps o enxerto

A Rejeio pode ser devida a:

Pr-sensibilizao do receptor a antgenos HLA do doador (transfuso de sangue, gravidez, transplante etc.) Ativao primria da resposta imune anti-enxerto aps o transplante.

Preveno da rejeio
Provas Cruzadas (Cross-Match)
Previne, principalmente, a Rejeio hiperaguda e a aguda acelerada.

Tipagem tecidual (Determinao dos antgenos HLA do doador e do receptor)

Permite selecionar os pares Receptor-Doador histocompatveis.

Imunossupresso inespecfica
Pode controlar as reaes de rejeio.

Imunossupresso especfica
Reduz as respostas anti-enxerto sem aumentar a susceptibilidade s infeces.

Provas Cruzadas (Crossmatch)

Indica se o receptor tem anticorpos pr-formados contra o potencial doador. Mistura-se uma pequena quantidade de soro do receptor com linfcitos do provvel doador e adicionase uma fonte de protenas do sistema complemento. Se o paciente tiver anticorpos contra o HLA do doador, a membrana das clulas do doador ser lesada pelo complemento e este crossmatch chamado de positivo. Um crossmatch positivo representa uma forte contraindicao ao transplante, pois significa que o receptor poder ter uma forte rejeio ao enxerto (rejeio hiperaguda)

Testes de Histocompatibilidade no Transplante de rgos - Provas Cruzadas

Prova Cruzada (Cross-Match) clssica Teste de Microlinfocitotoxicidade
(Terasaki e McClelland)

Soro do receptor + Linf. totais (T+B) do doador + Complemento +Corante vital +Formol

 As clulas do possvel doador so incubadas com o soro do paciente (receptor):

As clulas usadas so, normalmente, linfcitos T ou B, obtidos a partir de sangue perifrico (doador vivo) ou linfonodos (doador cadver). As clulas so purificadas por gradiente de densidade e aderncia l de nylon ou com o uso de esferas magnetizadas contendo anticorpos anti-T ou anti-B.

Veja a reao de microlinfocitotoxicidade:

anti-HLA-A3 anti-HLA-B5

linfcito teste

HLAA3

HLA-A3

linfcito teste

Complemento (Ativao) Corante vital (penetra na clula lesada) Linfcito com membrana lesada

Complemento (No ativao)

Corante no penetra na clula intacta

Linfcito intacto

Veja o resultado ao microscpio de contraste de fase:

a: Linfcitos no lisados (reao de citotoxicidade negativa)

b: Linfcitos lisados (reao de citotoxicidade positiva)

Kuby, 2000

A reao de microlinfocitotoxicidade realizada em placas de Terasaki, apresentada a seguir:

Testes de Histocompatibilidade no Transplante de rgos - Provas Cruzadas

Provas mais sensveis e especficas:
CM-T (HLA Classe I) CM-B (HLA Classe II) Tratamento do soro com agente redutor de IgM
(Ditiotreitol [DTT])

Adio de Anti-Gamaglobulina (AGH) Citometria de fluxo...

Anlise da Reatividade contra Painel de Linfcitos (PRA)

Tipagem Molecular Esses ensaios visam a definio das especificidades (baixa

resoluo) ou dos alelos (alta resoluo) HLA de um indivduo, a partir de amostra de DNA e com o uso de primers e sondas especficas. Dois desses mtodos cada vez mais utilizados:

Sonda seqncia-especfica (PCR-SSO)

Envolve a amplificao a amplificao pela Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) de um xon do gene do HLA, utilizando primers de oligonucleotdios que hibridizam com regies do locus HLA que so conservadas entre diferentes alelos. A seqncia amplificada ento hibridizada com diferentes sondas de oligonucleotdios, cada uma com seqncias especficas de um alelo ou grupo de alelos HLA.

Amplificao seqncia-especfica (PCR-SSP)

Esse mtodo consiste em colocar o DNA de uma amostra em diferentes tubos com dois primers PCR. Um dos primers hibridiza uma regio conservada do locus HLA que est sendo tipado, sendo adicionado a todos os tubos (ex. HLA-DRB1). O segundo primer PCR hibridiza com uma regio polimrfica do locus HLA cada tubo contm um primer de especificidade diferente. A amplificao do DNA s ser observada no tubo contendo um segundo primer especfico que corresponde ao alelo (alta resoluo) ou grupo de alelos (baixa resoluo) do HLA na amostra de DNA O produto gnico amplificado poder ser detectado em gel de agarose corado com Brometo de Etdio.

FIM