Blga.

Mercedes Palomino Garca

Emplea luz natural o luz artificial. Generalmente se utilizan colorantes. Especial para ver muestras coloreadas.

Clulas descamadas del epitelio bucal. a) imagen obtenida de clulas sin teir, b) imagen obtenida con clulas teidas con azul de toluidina, 400x.

Estructuras oscuro.

brillantes

sobre

fondo

Necesita condensadores especiales.

Especial para ver clulas vivas

Se observa el recorrido de los rayos luminosos, en el sistema ptico del condensador y la desviacin de los rayos luminosos oblicuos, en el microscopio de campo oscuro.

Se basa fundamentalmente en el retraso que se produce en las ondas de luz al atravesar objetos de distintos ndices de refraccin, aprovechando y amplificando dichos retrasos

Cultivo tardo de B. thuringiensis.

Se utiliza para observar clulas sin necesidad de colorearlas y es especialmente til para visualizar clulas vivas.
Vorticella rodeada de amebas

CONTRASTE DE FASE POSITIVO Y NEGATIVO

Paramecium con contraste positivo (a la derecha) y en contraste negativo (a la derecha)

 Puede analizar preparaciones ms gruesas en comparacin con la microscopia de contraste de fases. La imagen generada tiene un efecto de relieve.

Permite estudiar la superficie de las clulas. Utilizado en procesos de fertilizacin in vitro. Microcinetomatografia

 Se

observan coloraciones proporcionadas por las sustancias fluorescentes sobre un fondo oscuro.

-- Fluorescencia natural -- Fluorescencia secundaria

Basado en la presencia de fluorocromos.

Esquema bsico de la iluminacin en el microscopio de fluorescencia. La luz blanca emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo, solo la luz azul. El espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azul) pero deja pasar otras. Filtra la luz azul que excita al fluorocromo (fluorescena) pero por el contrario, deja pasar la luz verde emitida.

Figu ra.Micr ogra fias de clul as en divis in, tom adas con un micr osco pio de fluor esce ncia. Se emp lear on tres fluor ocro mos : DAP I (emi te luz azul ) para mar car cro mos oma s, GFP (prot ena verd e fluor esce nte intra celul ar que emit e luz verd e) y roda min a (luz roja) para mar car micr otb ulos. Cad a fluor ocro mo ame rita el uso de filtro s espe cfic os, depe ndie ndo de la longi tud de onda nece sari a para su excit aci n, sea lada arrib aya la izqui erda en cada ima gen y expr esad a en nm. Tom ada de wiki pedi a.or g

Micrografias de clulas en divisin, tomadas con un microscopio de fluorescencia. Se emplearon tres fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas, GFP (protena verde fluorescente intracelular que emite luz verde) y rodamina (luz roja) para marcar microtbulos. Cada fluorocromo amerita el uso de filtros especficos, dependiendo de la longitud de onda necesaria para su excitacin, sealada arriba y a la izquierda en cada imagen y expresada en nm.

 Utilizada en mtodos inmunohistoqumicos (inmunofluorescencia)

 Para

la tincin de ADN.

 Posee

dos filtros polarizadores de la luz

Este tipo de microscopio se usa para poder identificar sustancias cristalinas ( ) o fibrosas (como el ), , ,

Isotrpicas y Anisotrpicas

Son tcnicas que permiten observar clulas en funcin de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante.
TEJIDOS MUERTOS (NECROPSIA) O BIOPSIAS

ORGANISMOS O CLULAS VIVAS

Tincin vital (colorantes incuos)

Tincin supravital

Obtencin, fijacin,

adicin de colorante a clulas extirpadas de organismos.

Cationicos

Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las tien.

Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina, Hematoxilina , Hematoxilina frrica; Derivados de la anilina (metacromatica): Azul de toluidina, rojo neutro, verde de janus.

Aninicos

Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tien las clulas, sino el entorno. En este caso se habla de tincin negativa.

Eosina, Nigrosina, cido pcrico (cromo tropo) diazoico (azul de tripana, rojo de tripano

Liposolubles Se mezclan con los lpidos celulares y los tien

Negro Sudn

Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos mtodos.

SIMPLES

Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas (Azul de metileno, safranina) o no (Nigrosina).

DIFERENCIALES

Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cidoalcohol resistencia (de ZiehlNielsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante

SELECTIVAS

Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes

 Primarios Secundarios De

lneas establecidas

IMPORTANTE: Para realizar cultivos celulares se emplean medios de cultivo en suspensin que poseen todos los requerimientos nutricionales, hormonas y alguna macromolcula de la matriz extracelular.

 Clulas

HeLa Fibrolasto 313 del ratn Fibroblastos BHK del rion del hamster Mioblastos L de ratn Clulas CHO del ovario de rata.

Equipos para cultivo celular A) Cmara de flujo laminar B) Incubadora de CO2 C) Microscopio C

El fraccionamiento celular es un conjunto de mtodos y tcnicas que tienen por objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas de un determinado componente celular, ya sea ste un orgnulo (mitocondrias, ncleos, peroxisomas, etc.) una fraccin de membrana (membrana total, plasmtica, dominio basolateral, etc. complejos) multiproteicos (citoesqueleto, poros nucleares, etc), etc.

ROTURA DE CLULAS O TEJIDOS

Se consigue usando procedimientos mecnicos suaves conocidos como homogenizacin. Estos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, liberando el contenido celular.

SONICACIN

DETERGENTES NO IONICOS

HOMOGENIZADORES

Etapas de fraccionamiento celular

SEPARACIN DE LA FRACCIN DESEADA

CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL CENTRIFUGA

centrfugas (de pocas g a 3000 g). supercentrfugas (de 2000 xg a 20000 g). ultracentrfugas (de 15000 xg a 600000 g).
SUCROSA CLORURO DE CESIO DMSO

DENSIDAD CONTINUA

DENSIDAD DISCONTINUA