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HGP 2000
Microarray
PCR
PCR Real-time 1998 1st Diagnostic Sequencing Kit HIV Genotyping 2001
Sequencing
Immunology
PCR
Reaccin en Cadena de la Polimerasa: Kary Mullis (1983) Mtodo enzimtico in vitro para sintetizar DNA La reaccin utiliza dos partidores (oligonucletidos) que hibridizan en hebras opuestas del DNA y abarcan la porcin del gen que se desea amplificar Una serie repetitiva de ciclos (denaturacin, annealing y extensin) dan una acumulacin exponencial de un fragmento especfico de DNA El nmero de molculas de dsDNA aumenta al doble en cada ciclo (20 ciclos 220 106 copias)
Real-Time-PCR Instruments
SmartCycler LightTyper
Roche Diagnostics Cepheid
SDS7700
Applied Biosystems
Opticon
MJ Research
iCycler
BioRad
SDS7000
Applied Biosystems
LightCycler
Roche Diagnostics
7900HT
Applied Biosystems
RotorGene
Corbett Research
Mx3000/4000
Stratagene
Superconvector
AlphaHelix
10
Application Principles
Mutation detection
Product identification
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FORMATOS DE DETECCIN
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Assay Formats
SYBR Green I SimpleProbe Probes HybProbe Probes Hydrolysis Probes and Universal ProbeLibrary Probes
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SimpleProbe Probes
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SYBR Green l
530
SYBR Green I
HybProbe Probes
LightCycler RED 610 LightCycler RED 640 LightCycler RED 670 LightCycler RED 705
FAM VIC, HEX
TaqMan Probes
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Punto de Fusin
-d(F)/T
50C
75C
95C
T
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Cuantificacin
Melting Curve
Template: human genomic DNA; Target: -Globin; Detection Format: SYBR Green I
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LightUp Probe
Scorpion Primers QuantiProbes QZyme Lux Primers
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DISEO DE PRIMERS Un buen diseo ahorra TIEMPO Y DINERO qPCR buen diseo de primers (pej MULTIPLEX)
concentracin de primers
tiempo
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UN BUEN PRIMER DEBERIA TENER... 18-24 pb 40-60% GC Distribucin balanceada de dominios ricos en G/C y A/T Tm que permita Tann de 55-65 C Sin estructura secundaria interna (Hairpins) UN BUEN PAR DE PRIMERS DEBERIA TENER Tm similares
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PROBLEMA DE LOS DMEROS DE PRIMERS Primers unidos tb son amplificados en el PCR Esta reaccin compite con el PCR correcto y podra afectar a la eficiencia de la reaccin
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DISEO COMPUTARIZADO Softwares gratis en Internet Primer3 FastPCR NetPrimer mFold Softwares comerciales
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OK
Si
Run PCR y
NCBI o Celera
Electroforesis
en gel para chequear especificidad
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Dim Prim
Tm de la sonda 68-70 C
No G en extremo 5 Evitar extructura secundaria Evitar dimerizacin con primers Elegir secuencias con mas Cs que Gs
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Crec Exponencial
Plateau
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Ct
Threshold line
Ct: ciclo terico donde las muestras intersectan a la lnea threshold Cp: propio del sistema LightCycler (mximo de la segunda derivada)
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D Threshold line
Muestra A > Muestra B > Muestra C > Muestra D La seal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de DNA (prod PCR) en la muestra La seal de fluorescencia de la muestra A comienza a incrementar antes que la muestra B La muestra A tiene mayor nmero de copias al inicio (NoA > NoB)
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CURVA ESTNDAR Estndars = templados diludos de concentracin conocida Curva estndar = Ct de cada muestra estndar es graficada en funcin de su concentracin conocida
Pend = entrega la eficiencia del PCR 10-1/pend = 1 + eficiencia Interc = # ciclos para detectar una molcula
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PCR
Diluir y usar
componentes del
buffer
(106-10 copias/uL)
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ECUACIN DE LA AMPLIFICACIN
NCt = No (1+E)Ct
Nct = nmero de molculas luego de Ct ciclos de amplificacin No = nmero inicial de molculas
Ct = ciclo threshold
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100 % Eficiencia
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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN
UN GEN, DOS MUESTRAS EFICIENCIA DEL PCR
NCt = No (1+E)Ct
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Series de dilucin
E = 10 -1/pend -1 * 100
Pend ~ 3.3 100% eficiencia
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EFICIENCIA DEL PCR Expresada usualmente en porcentaje Muchos qumicos inhiben al PCR Cada muestra biolgica es nica en su composicin INHIBICIN
AFECTA A LA CUANTIFICACIN
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referencia
target
Dos muestras son corridas y dos genes son medidos. Por ejemplo, un gen target y un gen de referencia (housekeeping) o un control endgeno (spike)
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referencia
target
(NCt)Atarg = k * (NCt)Aref
NoAtarg/NoAref = k * 2DCt muestra A NoBtarg/NoBref = k * 2DCt muestra B
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referencia
target
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RT-PCR Quantification
Influencing Factors
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Tipos de Cuantificacin
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Tipos de Cuantificacin
Cuantificacin Absoluta
Con estndares externos
Efectos desconocidos de los inhibidores del PCR
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Tipos de Cuantificacin
Cuantificacin Relativa
RNA blanco en una muestra RNA referencia en una muestra
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Cuantificacin Relativa
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DUDAS Y CONSULTAS ?
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