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Falha no sistema de nonsense mediated decay (NMD) em clulas neuronais como base para toxicidade de mutaes em TDP-43

PROJETO IC / PIBIC 2013 ALUNO: FELIPE EDUARDO CIAMPONI ORIENTADORA: DR KATLIN BRAUER MASSIRER

Lab Meeting - 08/05/2013

CONCEITOS IMPORTANTES...
NMD (Nonsense Mediated Decay):
uma via de vigilncia de RNAs existente em eucariotos. Sua principal funo reduzir erros na expresso do genoma, eliminando mRNAs que possuem stop codons prematuros.

http://sm.nwsuaf.edu.cn/mb/admin/upload/files/gzk/htm/chapter7_5.htm

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CONCEITOS IMPORTANTES...
TDP-43 (TAR DNA-BINDING PROTEIN 43):
uma protena que pode se ligar tanto ao DNA quanto ao RNA, possuindo diversos papeis na regulao da expresso gnica.

Figura 01: TDP43 e seus domnios. Trinta mutaes, espordias (vermelho) e familiares (preto), relacionadas a ALS. (Lagier-Tourenne et al, 2009)

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(Lagier-Tourenne et al., 2010)

Figura 02. Mecanismos de ao da TDP-43 na regulao da expresso gnica

CONCEITOS IMPORTANTES...
ELA (Esclerose Lateral Amiotrfica):
uma doena neurodegenerativa progressiva que incapacita o portador.

Aproximadamente 10% dos casos tem origem gentica familiar.


caracterizada pela degenerao progressiva do neurnio motor.

Leva a atrofia muscular, causando:


Dificuldade na locomoo Perda de destreza nas extremidades Impedimentos da fala e deglutio Eventual bito por impedimento na respirao.

No afeta as capacidades cognitivas

do portador

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CONCEITOS IMPORTANTES...
miRNAs (micro RNAs):
So pequenos RNAs no codantes, normalmente entre 19 e 25 nt.
Atuam na regulao ps-transcricional em eucariotos. Reconhecem seus alvos no mRNA por pareamento de bases So incorporados a complexos de protenas de silenciamento (RISC*).

(*Tambm pode ser chamado de miRNP ou miRISC quando complexado ao miRNA)

(Hannon et al., 2004)

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(Hannon et al., 2004)

Figura 03: Biogenese dos miRNAs e seus mecanismos de ao

INTRODUO
Doenas neurodegenerativas apresentam um acmulo de

proteinas truncadas, impedindo o desenvolvimento normal dos neurnios..

A formao desses agregados est ligada a ubiquitinao

e fosforilao anormal da protena e falha no sistema de translocao da TDP-43 do nucleo para o citoplasma.

Uma porcentagem da forma familiar da ELA est

associada a mutaes em proteinas de regulao do mRNA, como a TDP-43


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(Chen-Plotkin et.al, 2010)

Figura 04. Formao de agregados proteicos de TDP-43 no citoplasma

INTRODUO
Falhas

no processo de splicing levam a incluso de introns contendo stop codons prematuros.

Esses mRNAs defeituosos

devem ser reconhecidos pela via de NMD e ento degradados.

Quando a via falha ou

Figura 05: Consequncias da via NMD no mRNA

sofre inibio, protenas truncadas se acumulam na clula.

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INTRODUO
Camundongos submetidos a inibio da TDP-43

apresentaram um aumento na quantidade de mRNAs defeituosos.


Neurnios em cultura apresentam o microRNA

miR-128. Esse miRNA altamente expresso em clulas neuronais em diferenciao, onde leva a represso da via de NMD.

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(Bruno et al, 2011)

Figura 06: Alvos de atuao do miR-128 durante a inibio da via NMD

HIPTESE

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OBJETIVOS E CRONOGRAMA
1.

Definir a lista de mRNAs-candidatos truncados que podem ser gerados em decorrncia da depleo/mutao de TDP-43 Verificar se o nvel de expresso destes mRNAs truncados naturalmente menor no crebro que em outros tecidos Avaliar a dependncia destes mRNAs truncados em relao a via de NMD

2.

3.

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METODOLOGIA
Analise de dados computacionais
Lista de mRNAs truncados Seleo de RNAs candidatos

Avaliao da expresso

Transcrio reversa e RT-PCR

Extrao de RNA total

Desenho de Primers

Bloqueio da via de NMD

Transfeco de siRNA

Avaliao da expresso

Comparao dos resultados em diferentes grupos de neurnios


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RESULTADOS ESPERADOS
Ns esperamos que a expresso desses mRNAs truncados

seja naturalmente mais baixa em tecidos nervosos, como balano fisiolgico pela inibio da via de NMD devido a ao do miR-128
Tambm acreditamos que a inibio do NMD leve a um

acumulo dos transcritos truncados, mostrando que sua produo dependente da via de vigilncia de RNAs.

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POSSIBILIDADES FUTURAS...
Avaliar se existe um aumento sinegstico da toxicidade de

TDP-43 mutado com a inibio da via de NMD.

O acumulo de protenas truncadas dever ser txico para a celula, levando a morte neuronal e recapitulando a situao da ELA.

Verificar se a ativao de NMD em neurnios maduros

reflete resistncia a mutao de TDP-43

A reativao da via de NMD em neurnios j diferenciados dever resultar em clulas nervosas defeituosas reverterem para um fentipo normal.

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