Por qu es importante un diagnostico correcto?

Es necesario el diagnostico de laboratorio?

Consideraciones en la toma de muestras

La posibilidad de aislar el virus es mayor durante el

perodo inicial de la enfermedad, cuando el ttulo del virus es ms alto y an no ocurri la infeccin bacteriana secundaria. La mejor muestra es la que proviene de un animal vivo o de uno sacrificado recientemente. Los virus dependen para su replicacin de clulas vivas por lo tanto no deben extraerse muestras de zonas necrticas, con exudado purulento, o fuerte olor porque ello es debido a la infeccin bacteriana.

 Las muestras deben conservarse a 4C o por

debajo de 40C (hielo seco o nitrgeno lquido). De ser posible las muestras deben remitirse en un medio de transporte adecuado para el diagnstico virolgico. Los medios para bacteriologa no sirven y los hisopos de madera resultan txicos. Utilice envases apropiados para recoger y remitir muestras.

Procedimientos diagnsticos
Los procedimientos bsicos para el

diagnstico de laboratorio de virus son: Aislamiento del virus La demostracin del virus o algn producto viral en las muestras clnicas (mtodo directo) La deteccin y medicin de los anticuerpos especficos contra un virus (mtodo indirecto).

Tiempo de espera para resultados

Aislamiento viral:
3 semanas

Diagnostico serolgico:
Entre 24 y 48 horas

Diagnostico molecular:
6 -8 horas

Aislamiento viral
Durante la fase aguda de la enfermedad es el

mejor momento para demostrar y aislar virus. A medida que la enfermedad avanza, se desarrollan los anticuerpos, se reduce la excrecin de virus y el virus es despejado de los tejidos.

 Las manifestaciones clnicas de la

enfermedad generalmente encausan la seleccin de la muestra clnica apropiada:

Hisopos nasales y oculares en las infecciones

de las vas respiratorias altas Heces de infecciones entricas, Sangre de infecciones sistmicas, etc.

Cultivos celulares
Los virus requieren de clulas vivas para

poderse replicar. En el laboratorio, se proporcionan clulas vivas como cultivos celulares, cuyas clulas han sido obtenidas por digestin enzimtica de tejidos animales. Las clulas son cultivadas en superficies de vidrio o plstico.

 Cuando las muestras clnicas que contienen

virus son inoculadas en cultivos celulares susceptibles El virus (si est viable) se replica y a menudo produce un comportamiento caracterstico de patologa celular, caracterizado por cambios en la apariencia celular, llamado efecto citoptico (CPE por sus siglas en ingles).

Efecto citoptico
El efecto citoptico son cambios

degenerativos especficos observados en una lnea celular como consecuencia de la replicacin de un virus infectante. ste puede aparecer despus de 3 4 das. A travs de stos cambios morfolgicos celulares es posible poner en evidencia la presencia de un virus en determinado tipo de cultivo de clulas.

Clulas HeLa

Clulas VERO

 En algunos casos, el virus se replica sin

ningn efecto apreciable sobre las clulas Debe ser demostrado mediante pruebas de tinciones especiales que revelan cuerpos de inclusin viral o anticuerpos fluorescentes (AF), para detectar antgenos virales.

Inoculacin de animales susceptibles

Aislamiento primero de algunos agentes

etiolgicos Estudios de infectividad Patogenia viral Respuesta inmune Oncogenesis viral

 El mtodo que se utiliza para inocular los virus a los animales depende de la sensibilidad del husped respecto al virus, as como de la naturaleza de la prueba.
Intravenosa Intracerebral Intraperitoneal Intranasal Intratraqueal Intradermica

Inoculacin de embriones de pollo

Se han utilizado huevos fecundados para

cultivar virus durante mas de 70 aos. El cultivo de virus de influenza en huevo embrionado fue empleado por primera vez por Burnet en 1935 El embrin de pollo es un medio muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo adems un medio estril y poco costoso.

 Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrin en desarrollo.
Tambin se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de incubacin mas prolongado que el pollo

Sigue usndose huevo de gallina de 6 a 8 das de incubacin aproximadamente

Inoculacin de embriones de pollo para diagnostico de influenza aviar

Estructura y puntos de inoculacin en un embrin de pollo

Diagnostico serolgico
Los mtodos utilizados para reconocer las

infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS Demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antgeno o genoma viral) o La respuesta de anticuerpos especficos por parte del husped en el curso de la infeccin.

Sensibilidad y especificidad
Sensibilidad:
Se refiere a la cantidad mnima de

anticuerpos o antgenos o material nucleico que es necesaria para que una prueba sea positiva Especificidad: Entre mas alto sea este valor (en %), disminuye la probabilidad de una reaccin cruzada

Inmunofluorescencia directa
Muestras clnicas apropiadas son

recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especficos marcados con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan con los antgenos vricos en el interior de las clulas.

 El advenimiento de los anticuerpos

monoclonales, ha incrementado la especificidad y en algunos casos la sensibilidad de estos ensayos. Esta tcnica requiere slo 2-4hs, y se ha reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada con cultivos celulares para la identificacin de virus Herpes Simple, 8095% para VRS y 71% para Influenza A.

Prueba de ELISA (Inmunoensayo ligado a enzima)

En la tcnica ELISA el anticuerpo se marca

con una enzima: Fosfatasa alcalina (FA) Peroxidasa de rbano (PR) Para revelar la reaccin se coloca el sustrato especfico para la enzima que es modificado por sta y produce un compuesto coloreado.

ELISA en emparedado

Western blot
Utilizada para confirmar muestras positivas

a ELISA Deteccin especifica de protenas o fragmentos de protenas virales, por ejemplo, de la cpside Muy especifica si se utilizan anticuerpos monoclonales

Ventajas de los mtodos serolgicos

Son relativamente rpidos
Su especificidad y sensibilidad son altas

(mayores a 70%) Son baratos Permiten trabajar con muchas muestras al mismo tiempo

Desventajas de los mtodos serolgicos

Se requiere de personal experimentado
Requieren de infraestructura especial Su especificidad y sensibilidad dependen de

una buena muestra

Diagnostico molecular
La posibilidad de analizar la presencia de los

cidos nucleicos del agente infeccioso en la muestra clnica mediante tcnicas de diagnstico molecular. Este procedimiento permite, entre otras ventajas, detectar de una forma rpida microorganismos difcilmente cultivables, como muchos virus (VIH, hepatitis B)

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Permite incrementar el numero de

molculas de l DNA blanco de las muestras Tiene una sensibilidad tan alta (99.999%) que puede amplificar una nica molcula de DNA y una sola copia de genes puede ser extrada, de mezclas complejas de secuencias genmicas (especificidad del 99.99%)

 La PCR es, por tanto, una amplificacin de

secuencias especficas del DNA. Se basa en la utilizacin de secuencias cortas de nucletidos sintticos llamados primers o cebadores, que se hibridan de forma especifica con cada una de las cadenas de DNA llamadas moldes o templados.

 Consiste en 3 pasos:
1 Desnaturalizacin del ADN doble

cadena 2 Acoplamiento de los cebadores (primers) sintticos 3 Elongacin del cebador usando una ADN polimerasa.

BITACORA PARA REGISTRO DE ELECTROFORESIS MTODO:

FECHA: FOTO: RESPONSABLE: Luz Dary Rodriguez-Claudia Caldern

PCR 15/04/2008

ENFERMEDAD ESPECIE:

LARINGOTRAQUEITIS-ILTV

005

10

11

Concentracin del gel:

1,50%

80v, 60 min,

MW: trackit 100bp INVITROGEN

CARRIL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

NUMERO DEL CASO CCE 1326-11771G1 1326-11771G2 IVAX MPM CCE 1326-11771G1 1326-11771G2 IVAX

CDIGO INTERNO AGUA 005 904 905 C+ NA AGUA 005 904 905 C+

RESULTADO OK OK POSITIVO NEGATIVO OK NA OK OK POSITIVO POSITIVO OK

RFLP: Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin

00 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

HaeIII Sau96I NciI HaeIII Sau96I NciI

Producto amplificado de 1300 pb gen TK 1ra PCR 650 pb 350 pb 300 pb

Sau96I

Sau96I

Cepa virulenta

Cepa vacunal o campo baja virulencia

Ventajas de los mtodos moleculares

La unin entre cidos nucleicos es ms

fuerte que la avidez del anticuerpo por el antgeno. Tambin los cidos nucleicos son mucho ms estables que las protenas a alta temperatura, alto pH, solventes orgnicos y otros compuestos.

 Los agentes infecciosos involucrados en la

patognesis de una enfermedad pueden ser cuantificados aun cuando estn presentes en cantidades de subpicogramos o como infecciones latentes.

 Son rpidos para identificar a las partcula

viral, en tiempo de 4 a 8 horas(PCR). Permite detectar cantidades muy pequeas de virus. Presenta una sensibilidad y especificidad alta.

Desventajas de los mtodos moleculares

Son caros, tienen un alto costo. La necesidad de cebadores especficos para encontrar

determinado microorganismo , lo que implica un conocimiento adecuado de la secuencia de nucletidos del agente. La aplicacin de estas tcnicas exige una infraestructura y entrenamientos adecuados. La prueba se tiene que efectuar en condiciones adecuadas de astringencia es decir, a una temperatura, pH y concentracin de cebadores y nucletidos adecuados.

Deteccin de Ac especficos
Las mtodos indirectos a comparacin de las pruebas

directas son aquellas en las que se demuestra, un contacto del husped con el agente viral, mediante la determinacin de anticuerpos especficos contra el virus. Estos mtodos o tcnicas serolgicas son las que se usan con mas frecuencia para descubrir anticuerpos contra un determinado agente viral, teniendo en cuenta que la exposicin al agente viral produce una respuesta por parte del sistema inmune del husped.

Fijacin de complemento
Prueba semicuantitativa
Se basa en la activacin de la va clsica del

complemento por la unin de un Ac con un Ag Induce la formacin del MAC, capaz de romper la membrana celular Prueba que sirve como estandar de oro

Se dejan reaccionar
Eritrocito

Ag

Suero de cobayo
Comple

Ac
Suero problema

Ac

Sistema indicador

No hay lisis del sistema indicador: positiva

Se dejan reaccionar
Eritrocito

Ag

Suero de cobayo
Comple

Ac

Suero problema: sin Ac

Sistema indicador

Lisis del eritrocito del sistema indicador: negativa

Inmunofluorescencia indirecta
Es un mtodo rpido y confiable que

permite la deteccin de anticuerpos o antivirales en el suero de paciente. Se basa en la unin de anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los antgenos virales expresadas en la superficie de clulas infectadas.

ELISA indirecta