Western blot

Soriano Torres Rosa Linda

INTRODUCCION
El Blotting supone la inmovilizacin de protenas sobre membranas sintticas, seguido de la deteccin empleando sistemas para la tincin de blots. Las protenas son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, posteriormente se transfieren a una membrana, mediante electroblotting. Una vez completada esta operacin la protenas de inters son reveladas por el agregado de un Ac especfico.

ANTECEDENTES
W. Neal Burnette:En 1981 acua termino de Western como un juego de palabras por Southern y Northern.

Edwin Southern diseara la tcnica que lleva su nombre para detectar ADN .

Se denomn Northern a la tcnica aplicada al ARN.

ELECTROBLOTING
Las protenas son transferidas desde el gel a la membrana electroforticamente. 1.-Apilar en una esponja plana, papel filtro en buffer de transferencia, el gel, la membrana, ms papel filtro y una esponja plana.

2.- Introducir en cuba con SS (buffer de transferencia) y dos electrodos. Se dispone de forma que el gel quede hacia (-) y la membrana hacia (+) . La carga neta de las protenas en el caso de los geles de SDS-PAGE es (-) debida a la carga del SDS.
3.- La electroforesis se realiza a 0,3-2 A de 1 a 4 horas. Se recomienda refrigerar el sistema y recircular el buffer.

Variantes al electrobloting
'Semi-Dry blotting' : Intensidad de corriente elevada entre dos electrodos planos entre los que se coloca una pila formada por :

Ventaja: rapidez, consiguiendo transferencias en pocos minutos.

DOT BLOT
La absorcin de la gota provoca la adhesin de la protena a la membrana, quedando en forma de dot .

Las membranas pueden incubarse fcilmente con Ac para la deteccin de protenas especficas Son ms rpidas de teir y desteir Se detectan cantidades menores de protenas. Las membranas son mucho ms fciles de manipular que el gel

Western blot modificada

TECNICAS RELACIONADAS
Deteccin en el propio gel (UnBlot In-Gel Detection). Esta tcnica conocida como UnBlot In-Gel Detection elimina la necesidad de realizar los pasos de transferencia y bloqueo, adems, permite la deteccin de protenas que no se transfieren con eficiencia desde el gel a la membrana y evita las perdidas de protenas durante el propio paso de transferencia. Far-Western Blot Detection. Utiliza una protena marcada como sonda en la membrana, la cual reconoce y se une a las protenas (protenaprotena), por lo que si se genera seal en la membrana, indica la presencia de una protena que interacciona con la protenasonda y, adems, que dicha protena posee el PM correspondiente a la banda donde se observa la seal. Se utiliza para buscar interacciones desconocidas entre protenas o para confirmar posibles interacciones.

Deteccin de inespecfica protenas totales sobre la membrana

Los colorantes que permiten teir las protenas en los geles de poliacrilamida no son utilizables en las membranas pues se unen irreversiblemente a stas. Para teir las protenas en las membranas se emplean:

Bloqueo de la membrana
Evita que los Ac se peguen inespecficamente a la membrana. El factor esencial a tener en cuenta es elegir un sistema de bloqueo compatible con el sistema de deteccin empleado. Las soluciones que son compatibles con casi cualquier sistema son la leche descremada y (BSA). Tambin se recomienda Tween-20 si hay demasiado background. Sin embargo los detergentes no inicos pueden solubilizar las protenas transferidas a la membrana.

REVELADO

Se emplea un Ac para localizar la protena de inters (Ac 1rio) y un segundo Ac que detecta el Ac 1rio (Ac 2rio). El tipo de Ac 2rio no es determinante. Como Ac 2rio se emplean Ac antiespecie. Fragmentos Fab2, producidos por digestin con pepsina de los Ac puros.

Sistema de revelado
Los sustratos cromognicos proporcionan el mtodo de deteccin ms barato y sencillo; cuando estos sustratos entran en contacto con la enzima correspondiente, se transforman en productos insolubles coloreados que precipitan sobre la membrana.

Western blot