ADN Recombinante

Mblgo. Rubn Asalde

El Dogma Central
DNA

RNA Protena

Lenguaje Protena
Tres letras en lenguaje DNA se traducen a una letra en lenguaje protena
MTMITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFA SWRNSEEARTREQWIMNCCPPTLTDRPSQQLRSLN GEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNW QMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSL TFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWLG YGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGS YLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATR FNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGET QVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKL WSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAEACDVGFREV RIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQ TMVQDILLMKQNNFNAVRCSH

Tecnologa ADN recombinante

1. Identificar el ADN de inters. 2. Cortar el ADN (endonucleasas de restriccin) 3. Seleccionar ADN (otro) capaz de autorreplicarse (vectores de clonacin). 4. Unir fragmentos obtenidos (ADN ligasa) 5. Insertar los vectores de clonacin a clulas especficas para la expresin de la informacin. 6. Seleccionar o identificar las clulas que contienen el ADN recombinante.

Tecnologa ADN recombinante

Endonucleasas de restriccin
Existen unas 3000 enzimas de restriccin especficas para aprox. 200 secuencias de ADN. Las enzimas diferentes que tienen especificidad por la misma secuencia de ADN y que cortan en el mismo sitio se les llama isoschizmeros. Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugar al ADN se les denomina neoeschizmeros.

Enzimas de Restriccin
La primera fue purificada de E. coli k12 (1968) Cortan enlaces fosfodister en secuencias palindrmicas. Toman el nombre de las bacterias que las producen: Ej. EcoRI
E = gnero Escherichia. co = especie coli

R = cepa RY 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Palndromes

Enzimas de Restriccin

1865

1972 - Paul Berg

El primer DNA recombinante utilizando EcoRI
Sitios de reconocimiento EcoRI DNA plasmdico EcoRI corta el DNA en fragmentos

Extremos pegajosos

SV40 DNA

DNA recombinante

DNA ligasa

Tipos de Enzimas de Restriccin

Sitios de reconocimiento

Metilacin-Restriccin
El ADN del fago es degradado por una enzima restrictiva El hospedero protege su ADN metilando bases nitrogenadas

Sistemas M-R
Tipo I.
Enzima = 2 subunidades restriccin + 2 metilacin + 1 reconocimiento Metilacin y corte requieren ATP El corte ocurre a una distancia del reconocimiento Poco valor en la manipulacin gnica.

Sistema M-R Tipo I

Complejo enzimtico pentamrico
Responsable de la restriccin Responsable del reconocimiento de la diana
5 3 R

Responsable de la metilacin
S M
Punto de restriccin

Sitio de reconocimiento

1000pb
3 5

TGANNNNNNNNTGCT ACTNNNNNNNNACTA

*
Punto de metilacin

Sistemas M-R Tipo II

Tipo II.
Diversas enzimas cortan y modifican No requieren ATP o s-adenosilmetionina Requieren Mg++ como cofactor El corte ocurre en el sitio de reconocimiento

Tipo IIs.
La restriccin ocurre en lugares alejados del reconocimiento

Sistema M-R Tipo II

Enzima de restriccin
R EcoRI
M

Enzima de metilacin

MEcoRI

Sitio de reconocimiento 5 3

* GAATTC
CTTAAG

diana de restriccin = diana de metilacin

Formas de Corte de Enzimas Tipo II

AT GC
5 3 5 3

3
EcoRI

3 EcoRV

5
3

Extremos cohesivos

Extremos romos

Restriccin o corte

Sistemas M-R
Tipo III.
Tienen actividad de restriccin y metilacin Son ATP dependientes El corte ocurre cerca de la zona de reconocimiento (24-26 pb antes o despus) Poco valor en la manipulacin gnica.

Sistema M-R Tipo III

Responsable de la restriccin R

S-M

Responsable del reconocimiento de la diana y de la metilacin

EcoPI
Sitio de restriccin Sitio de reconocimiento 24-26pb 5 3

* AGACC
TCTGG

Factores que afectan restriccin

Pureza del ADN (interfieren protenas) pH y temperatura Tipo de ADN Buffer adecuado

Mapas de Restriccin
Diagrama que muestra distribucin lineal de sitios de restriccin en un fragmento de ADN. Construidos sobre fragmentos obtenidos por digestin de ADN a diferentes tiempos. La separacin de fragmentos es por electroforesis. La distribucin de tamaos de fragmentos se logra con digestin parcial.

Electroforesis de ADN
Cuando molculas cargadas son colocadas en un campo elctrico, stas migran hacia el polo positivo (nodo) o polo negativo (ctodo) de acuerdo a su carga. El ADN, por la presencia de los grupos fosfatos, migra del nodo

2,2 kb

2,6 kb

4,1 kb 1,2 kb

Endonucleasa de Restriccin Digestin parcial Kb Composicin de bandas Digestin completa Kb Nombre arbritario

6,3 5,3 7,9 4,8 3,8 6,0 8,9

B+D A+D A+C+D B+C A+C A+B+C B+C+D C

1,2 2,2 2,6 4,1

B

A B C D

D A

Disposicin deducida de fragmentos

Clonacin
Proceso mediante el cual se obtiene una o varias copias (clones) de una molcula o individuo progenitor. Clases:
Segn el material clonado: molecular, celular Segn su finalidad: reproductiva, teraputica Segn su origen: natural, antropognica

Transferencia de material gnico

Transformacin. Natural o por uso de vectores. Transduccin. Cuando se clona material gnico de virus en procariotas. Transfeccin. Cuando se clona material gnico en eucariotas. Si la transfeccin se hace en clulas germinales se llama transgnesis; los seres originados, transgnicos u OGM.

Transferencia de material gnico

Transferencia de material gnico

1865

1973 - Boyer, Cohen & Chang

Transformacin de E. coli con plsmidos recombinantes

Gen resistente a la kanamicina

Plasmid pSC101

Gen resistente a la tetraciclina

Stanley Cohen & Annie Chan

Medio con kanamicina y tetraciclina

E. coli transformada con plsmidos recombinantes

Slo crecen colonias recombiantes

Herbert Boyer

Transfeccin

Mtodos de transfeccin

Transgnesis

Vectores de Clonacin
Plsmidos: pBR322 Fagos Lambda: ZAP, gt10 Fagos filamentosos: f1, M13 Csmidos Cromosomas artificiales bacterianos (BACs) Cromosomas artificiales de levadura (YACs) Virus (retrovirus)

Caractersticas de los vectores de clonacin:

Replicacin autnoma Marcador gentico de seleccin Sitios nicos de restriccin ADN no esencial mnimo.

Plsmidos
Extracromosmicos Circulares Replicacin autnoma (secuencia ori)

tiles para fragmentos de hasta 15 kbp aprox.

Componentes esenciales:
Origen de replicacin. Gen de resistencia a antibitico(s) Polylinker (MCS).- Regin de clonacin

Plsmido pBR322

Actividad b-galactosidasa (seleccin por presencia de inserto) Polylinker o Regin de clonacin

Gen de resistencia a Ampicilina (seleccin por Presencia de plsmido)

Origen de replicacin en E. coli

pUC18

pUC19

Fago Lambda
LISIS Expresin de la protena Cro

LISOGENIA

Expresin de la protena represora de , cI

DNA fago

DNA fago 12 nt

Extremo cos 12 nt

Extremo cos

48.502 pb

Csmidos
Pequeas molculas de DNA circular (5-7 Kbp)
Secuencia ori Marcadores de seleccin Secuencia COS: permite el empaquetamiento como bacterifago para la infeccin en E. coli pero se mantiene en la clula como un plsmido. Permite clonar fragmentos de hasta 45 Kbp.

Apropiados como vectores en fases iniciales de proyectos de secuenciacin.

Csmidos
Pueden albergar hasta 45kpB

Cromosoma artificial bacteriano (BAC)

Insertos entre 100 y 300 kbp

Resistencia a antibitico
Estabilidad mediante ori.

Una o dos copias por clula.

Cepas de dbil pared celular (electroporacin)

Cromosoma artificial bacteriano (BAC)

Cromosoma artificial de Levadura

Elementos bsicos de un cromosoma: Secuencias ARS (Autonomous replication sequence)

Secuencias CEN (Centrmero)

Secuencias TEL (Telmero) Posibilidad de replicarse en E. coli y en levadura. Insertos del orden de 1-2 Mbp.

YAC

Vectores de Expresin
Se utilizan para expresin gnica de ADN forneo Tiene elementos para clonacin bacteriana:
secuencia Shine-Dalgarno (AGGAGG), ori, marcador de seleccin, sitios mltiples de clonado (MCS o polylinker).

Vector de expresin bacteriano

Vectores de Expresin en Eucariotas

Seal de poliadenilacin Secuencias Kozak (ACCAUGG) y codn ATG Tags-protenas de fusin ori derivado de virus como el de SV40 (opcional) Marcador de seleccin para clulas eucariotas (para transfecciones estables) Segmentos de DNA para recombinacin homloga

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Amplificacin de ADN in vitro por medio de la polimerizacin en cadena utilizando un termociclador. El propsito de la PCR es hacer muchas copias de un fragmento de ADN. La amplificacin de un segmento especfico de ADN se realiza teniendo poco material disponible.

PCR
Diseada por el Dr. Kary Mullis en 1984. Gan el premio Nbel de Qumica en 1993 por su invento. Utiliz PCR para amplificacin del gen de b-hemoglobina humana y el diagnstico prenatal de anemia falciforme.

PCR
La PCR se realiza en un Thermal Cycler Termociclador. Es una mquina que calienta y enfra la reaccin en intervalos cortos de tiempo.

El proceso de PCR incluye 3 pasos bsicos que se repiten 25 veces o ms:

1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. Se usa una temperatura de 94C - 97C, por 15 a 60 segundos; el tiempo depende del tamao del genoma.

2. Recocido o annealing: Los cebadores primers previamente diseados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares especficos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura. Ej.: 54C por 45 segundos. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores segn sea el caso.

3. Polimerizacin o Extensin: La polimerasa de ADN extiende los primers y coloca dinucletidos trifosfatados (dNTPs) de 5 a 3 leyendo el ADN de 3 a 5. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de ADN molde. Se efecta a 72C por 120 segundos (puede variar segn sea necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

1 Ciclo PCR.

2 Ciclo PCR.

3 Ciclo PCR.

En la PCR hay una amplificacin exponencial

Anlisis de la Muestra
La deteccin del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electrofortico. Dependiendo del tamao de la amplificacin y la resolucin que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

Anlisis de la Muestra
La posterior visualizacin se puede realizar con bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata, fluorescencia, radioactividad.
Ladder: pesos conocidos 1: Fragmento a 1857 pb 2 y 4: Fragmento a 800 pb 3: No hay producto 5: Mltiples bandas (primers inespecficos se pegan a varios sitios)

Otros tipos de PCR

PCR MULTIPLEX. Se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. PCR ANIDADA. El producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin, con primers que se sitan dentro de la primera secuencia amplificada. PCR EN TIEMPO REAL. Permite cuantificar el ARN o ADN amplificado. RT-PCR. El molde es ARN y re quiere transcriptasa inversa.

Aplicaciones
Deteccin de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros
Anlisis de ADN de cualquier organismo vivo o muerto, anlisis de fsiles Investigacin forense Pruebas de paternidad

Pruebas de Paternidad

Criminalstica

Criminalstica
Si se observan las bandas podr comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantaln (Jeans) del sospechoso (S), coinciden con el perfil gentico de la vctima (V).

Ventajas de la PCR
A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar. El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y analizar secuencias de inters.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.

Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense, diagnsticos, anlisis prenatales, etc.

Desventajas de la PCR
Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40 pb. Se necesitan primers especficos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN.

Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro).

Secuenciacin de ADN
Determinacin de la secuencia de bases en el ADN. 1995; se secuenci Haemophilus influenzae por primera vez. Dos mtodos desarrollados:
Maxam Gilbert: De la rotura qumica Sanger: Enzimtico

Actualmente se utilizan secuenciadores automticos.

Mtodo de Maxam-Gilbert
Requiere: Marcaje de nucletido terminal (32P) Hidrlisis selectiva del enlace fosfodister para generar fragmentos con 1, 2, 3 o ms bases Separacin cuantitativa de fragmentos. Determinacin cualitativa del marcaje.

Mtodo de Maxam-Gilbert

Mtodo de Sanger
Mtodo enzimtico de terminacin de cadena (mtodo dideoxi de Sanger) Polimerizacin interrumpida de ADN. Se lleva a cado polimerizacin de ADN en presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerizacin en diferente momento, obtenindose fragmentos de diferente tamao. Se examinan por electroforesis, se lee secuencia directamente del gel.

Mtodo dideoxi de Sanger

Mtodo dideoxi de Sanger

Mtodo dideoxi de Sanger

Mtodo secuenciacin automtica

Electroferograma de la secuenciacin automtica

Geles de secuencia

Secuencia automtica

Secuencia Manual

Southern Blot
La transferencia del ADN en forma de molculas de cadena sencilla a nitrocelulosa permite la deteccin de secuencias especficas dentro de una mezcla compleja de DNA. La hibridacin con sondas de ADN marcadas puede mostrar si una secuencia determinada de ADN se presenta en una o varias regiones del genoma.

c. Nucleicos Antisentido