MANIPULACION DEL ADN EXTRADO

ENDONUCLEASAS Y ENZIMAS MODIFICADORAS DEL ADN

A. ENZIMAS DE RESTRICCIN
Son enzimas con capacidad de reconocer, unirse y cortar el enlace fosfodister de los nucletidos Reconocen secuencias de 6-8 nt.

B. ENZIMAS QUE MANIPULAN EL ADN

1. 2. 3. 4. Nucleasas Ligasas Fosfatasa alcalina Polinucletido cinasa

2.1 nucleasas
Estas enzimas degradan el ADN rompiendo los enlaces fosfodiester

LAS NUCLEASAS MAS UTLIZADAS

DNasa I Y RNasa A, Endo y exonucleasas Purificadas a partir de pncreas bovino

DNasa I
Tambien llamada deoxiribonucleasa I Corta el ADN de cadena sencilla o doble Preferentemente las pirimidinas (C o T) Aplicaciones:
Eliminacin del ADN partir de extracciones de ARN

RNasa A
Tambien llamada ribonucleasa A Endoribonucleasa Corta el ARN de cadena sencilla en residuos de pirimidina Aplicaciones
Eliminacin de ARN a partir de extracciones de ADN

2.2 Ligasas
Catalizan la formacin del enlace fosfodiester entre el PO4 5` de una hebra y el OH 3`de otro fragmento Usos:
Unin covalente entre dos molculas de ADN (ADN recombinante: ADN + vector) Se extrae del bacterifago T4 (T4 DNA ligase)

 Ligacin: unin de dos fragmentos lineales de ADN mediante enlaces covalentes

fragmentos con extremos cohesivos (preferentemente)

 INGREDIENTES
FRAGMENTOS DE ADN (CON EXTREMOS COHESIVOS ) UN BUFFER QUE CONTENGA ATP LIGASA T4 (USAR 1 a 0.01 U DE ENZIMA) Temp 16 C (4C OV, TA 2 hrs)

3. Fosfatasa alcalina

REMUEVE EL GRUPO FOSFATO 5` DE UN FRAGMENTO DE ADN TRABAJA A pH alcalino Calf intestinal alkaline phosphatase (CIP)

 USOS:
1. Remover grupos PO4 5` de los vectores que han sido cortados con enzimas de restriccin. Por tanto, se previene la recircularizacion del vector Si se tratan extremos lineales, agregar un exceso de la enzima o prolongar el tiempo de incubacin
2. Remover PO4 5` de los fragmentos de ADN para su marcaje con fosfato radiocativo

4. Polinucletido cinasa (PNK)

Cataliza la transferencia de un grupo fosfato desde el ATP al extremo 5`del ADN o ARN

 Usos
Fosforilacion de fragmentos de ADN previo a su LIGACION en vectores Marcaje radioactivo con P32

C. POLIMERASAS

E. coli DNA Polymerase I Klenow Fragment of E. coli DNA Polymerase I T4 DNA Polymerase T7 DNA Polymerase Terminal Transferase Thermostable DNA Polymerases (Taq, Pfu, Vent, etc.) Reverse Transcriptases Bacteriophage RNA Polymerases

 Son enzimas que incorporan nucletidos (dNTPs o ddNTPs) para alargar una cadena de ADN o ARN a partir de otra llamada templado o cadena molde. Estas sintetizan en direccin 5---- 3 Requieren de la presencia de in cebador o primer que contenga un extremo 3OH libre

 Pueden presentar 3 actividades:

Actividad polimerasa 5 3

 Actividad exonucleasa 3 5 actividad correctora: hidroliza el enlace fosfodister y elimina el nucletido errneo

 Actividad exonucleasa 5 3

 El fragmento Klenow (extrado de la ADN pol I) Presenta actividad de exonucleasa 3---5

 Aplicaciones:
Sntesis de ADN de doble cadena (dsDNA) a partir de templados de cadena sencilla, eliminando los primers rio abajo Pej. Durante la sntesis del ADNc o sntesis de sondas radioactivas Durante la secuenciacin

 Rellenar fragmentos de ADN

Cuando se han dejado extremos cohesivos, despus del corte con enzimas de restriccin, para rellenar esos espacios y dejar extremos lineales

 Las ADN Polimerasas termoestables son empleadas en la PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) La mas comn es purificada a partir de Thermus aquaticus Aislada por primera vez en 1976 La Taq ha revolucionado el mundo de la Biologa molecular

 Funciona como polimerasa Su actividad cataltica requiere los 75-80C

Polymerase Taq 3'->5' Exonuclease No Source and Properties From Thermus aquaticus. Halflife at 95C is 1.6 hours. From Pyrococcus furiosus. Appears to have the lowest error rate of known thermophilic DNA polymerases.

Pfu

Yes

Vent

Yes

From Thermococcus litoralis; also known as Tli polymerase. Halflife at 95 C is approximately 7 hours.

 La transcriptasa inversa, utiliza como templado ARN no ARN Se obtiene de retrovirus (copian su propio genoma de
ARN en ADN antes de integrarlo al genoma del husped)

Moloney murine leukemia virus, Avian myeloblastosis virus Comnmente empleada para generar el ADN complementario o ADNc, a partir de una cadena sencilla de ARN.

 Esta enzima tiene actividad de polimerasa y de RNasa H (degrada el ARN de los hbridos ADN-ARN) ARNm + oligo dT----- alineacin con la cola de poliA + transcriptasa ---sntesis de la hebra complementaria ss (ADNc ss) RT-PCR

LIGACION
El paso final en la reconstruccin del ADN recombinante

 Los extremos pegajosos incrementan la eficiencia de ligacin

 Colocando extremos cohesivos en una molcula con extremos lisos: linkers

INTRODUCIENDO EL ADN ENCLULAS VIVAS

TRANSFORMACIN: INTRODUCCION DEL ADN EN BACTERIAS

E. coli, Bacillus y Streptococcus Clulas competentes: tratamientos fsicos o qumicos que aumentan su habilidad para incorporar material gentico

 Seleccin de las clulas transformadas: resistencia a antibiticos

Seleccin de las clulas transformadas: seleccin por lac Z

Introduccin de ADN en clulas no bacterianas

El termino transformacin cambia dependiendo de la clula a tratar Clulas animales: transfeccin

A.

VECTORES DE CLONACION PARA CLULAS EUCARIONTES 1. Menciona las caractersticas de los vectores YACs as como usos y aplicaciones de stos. 2. Describe las caractersticas de los vectores de clonacin para plantas: A. tumefasiens, transferencia directa, vectores virales (geminivirus y caulimovirus) 3. Que son los elementos P y cul es su aplicacin 4. Describe el proceso de clonacin mediante el empleo de baculoviruses 5. Menciona 2 vectores de clonacin para mamferos 6. Describe brevemente la tcnica de clonacin en mamferos sin el empleo de vectores

CUESTIONARIO
B. VECTORES DE EXPRESION 1. Que son los vectores de expresin 2. Describe el funcionamiento general de los vectores de expresin. 3. Menciona las caractersticas del pTracer-EF/V5-His tales como promotor, marcadores de seleccin, genes reporteros, deteccin de la protena expresada.

C. TECNICAS PARA LA SELECCIN DE LAS CLONAS RECOMBINANTES 1. En qu consiste la hibridacin en colonia. Realiza un esquema 2. Para qu sirven las tcnicas conocidas como Southern Blot, Northern Blot y Western Blot. Realiza un esquema 3. Describe la tcnica de deteccin inmunolgica por medio de anticuerpos para el anlisis de los productos expresados

3. Que es la PCR 4. Describe los pasos a seguir durante la PCR. Realiza un esquema 5. Que caractersticas deben contener los primers o cebadores durante la PCR 6. Que es la Tm, cmo se calcula y cual es su importancia durante la PCR 7. Describe la tcnica de PCR cuantitativa o en tiempo real. 8. Menciona dos aplicaciones de la PCRq.