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Tecnologa del ADN recombinante

PCR Southern Blot

PCR
El aislamiento de grandes cantidades de segmentos especficos de ADN puede ser realizado utilizando varias tcnicas, una de las cuales es la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).

La PCR est basada en una reaccin de sntesis de DNA llevada a cabo in vitro por la enzima Taq Polimerasa, una polimerasa de DNA resistente a la temperatura.

Componentes de la reaccin:
El tampn (buffer) Los nucletidos (dNTPs) Los cebadores (primers) El ADN (muestra) La polimerasa (taq Polimerasa)

Parmetros de la reaccin:
Temperaturas en cada parte del ciclo Duracin de cada parte del ciclo Velocidad de enfriamiento y calentamiento Nmero de ciclos

En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa, o PCR. Esta tcnica ha invadido de tal forma la Biologa Molecular, que hoy en da es muy difcil imaginar esta ciencia sin ella. En 1989, Science seleccion el PCR como el principal desarrollo cientfico, y la Taq polimerasa como la molcula del ao. En 1993, Kary Mullis recibi por este descubrimiento el Premio Nobel de Qumica.

Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" ya no es una limitacin en la investigacin en Biologa Molecular, ni en los procedimientos de diagnstico basados en el estudio del ADN. El nmero de aplicaciones de esta tcnica parecen infinitas, y continan creciendo sin parar. Una de sus posibles aplicaciones se centra en la secuenciacin del ADN de muestras biolgicas.

Desnaturalizacin
Dos pequeos fragmentos de ADN, tpicamente de 10 pares de bases, llamados primers, son sintetizados a travs de otra tcnica. Esos primers son pequeos fragmentos de ADN que son complementarios a cada una de las extremidades de la secuencia de ADN de inters. En un tubo de reaccin son adicionados los primers, nucletidos libres de todas las bases nitrogenadas (adenina, guanina,, timina y citosina), el ADN y una enzima especial resistente al calor llamada Taq polimerasa, que promueve la sntesis de ADN. La mezcla es calentada a 95C lo que provoca la separacin de las dos cadenas de ADN.

Alineamiento
Enseguida, la mezcla es enfriada hasta 55C, temperatura en la cual los primers se unirn a las regiones complementarias de las molculas de ADN que estn separadas. En este momento, dentro del tubo de reaccin, todo el ADN est en forma de cadena simple, menos las dos pequeas regiones en las cuales los primers de 20 pares de bases se ligarn a los dos lados de la secuencia de ADN.

Alargamiento (polimerizacin)
La temperatura se eleva entonces hasta 72C y la Taq polimerasa comienza a sintetizar un nuevo ADN, comenzando por las regiones en doble cadena, en donde cada uno de los primers se uni al molde de la muestra de ADN. La Taq polimerasa promueve la sntesis de ADN apenas en la regin de doble cadena. La sntesis ocurre a una tasa de aproximadamente 20 nucletidos por segundo, y en un minuto es sintetizada una nueva copia del fragmento que se quiere analizar.

Repeticin del ciclo


La reaccin entonces es nuevamente calentada a 95C causando nuevamente la separacin de todo el ADN en las cadenas simples. Al final del primer ciclo hay dos cadenas de la molcula original de ADN mas dos copias de la regin de inters.

La temperatura es disminuida de nuevo a 55C y ahora los primers se irn a unir a los cuatro sitios en las dos copias nuevas y tambin en la molcula original de ADN. LA temperatura del ciclo es nuevamente elevada a 72C y se multiplican entonces las cuatro cadenas individualizadas.

Estos ciclos son repetidos varias veces, tpicamente 30 veces, en un aparato llamado termociclador. Al final de 30 ciclos de amplificacin existen aproximadamente un milln de copias del segmento de ADN de inters por cada molcula molde original de la muestra inicial. Es as que podemos seleccionar un fragmento especfico dentro de todo el ADN.

Estos ciclos son repetidos varias veces, tpicamente 30 veces, en un aparato llamado termociclador. Al final de 30 ciclos de amplificacin existen aproximadamente un milln de copias del segmento de ADN de inters por cada molcula molde original de la muestra inicial. Es as que podemos seleccionar un fragmento especfico dentro de todo el ADN