Laboratorio de alimentos

Instituto de Medicina Preventiva Veterinaria UACH

Qu son los medios de
cultivo?
Son una mezcla de nutrientes, que en
concentraciones adecuadas y en condiciones
fsicas ptimas; permiten el crecimiento de los
microorganismos.
Son esenciales en el laboratorio, por lo que un
control en su preparacin, conservacin y uso,
asegura la exactitud, confiabilidad y
reproducibilidad de los resultados obtenidos.
Para disear un medio de cultivo se debe tener en
cuenta no slo los nutrientes requeridos por el
microorganismo que se desea estudiar, sino
tambin las condiciones fsicas que le permitan
crecer, los cuales son:
Nutrientes
pH
Grado de humedad
Presin osmtica
Esterilidad
Suministro de luz: organismos fotosintticos



Necesidades de gases
Aerobios: desarrollo en presencia de O2 libre.

Anaerobios: desarrollo en ausencia de O2 libre.

Anaerobios facultativos: desarrollo en presencia o
ausencia de O2 libre.

Microerobios: crecimiento en presencia de pequeas
cantidades de O2 libre.
Temperatura
Psicrfilos: desarrollo a 0 C menos. Su temperatura
ptima es alrededor de los 15 C.

Mesfilos: crecen mejor entre 25 y 40 C.

Termfilos: crecen mejor entre 45 y 60 C.

Clasificacin
Enriquecimiento

Selectivos

Diferenciales
Medios de Enriquecimiento
Son medios lquidos que favorecen el crecimiento
de un tipo de microorganismo en particular.

Usualmente contienen una o ms sustancias
inhibidoras de crecimiento, con excepcin de los
que se quiere cultivar.
Medios Selectivos
Son medios de cultivo slidos y estn diseados
para el aislamiento de microorganismos
especficos.
Plate Count Agar
Medio no selectivo

Inhibidor de m.o. Gram +
En combinacin con un
Indicador de pH, aporta
coloracin a las colonias
Agar Rambach
Medio selectivo
Agar Rambach
Medio selectivo
E. coli
Salmonella
enteritidis
Medios Diferenciales
Son medios que contienen indicadores de
productos derivados de la actividad microbiana de
los microorganismos.

Permitan revelar caractersticas fisiolgicas de los
microorganismos.

Agar TSI : diferencial
1 2 3 4 5
Fermentacin glucosa
- + +/- + +/-
Fermentacin lactosa
- sacarosa
- - - + +
H
2
S
- - + - ++
Pseudomona Shigella Salmonella E. coli Salmonella

Agar TCBS
Azcar fermentable
Inhibidores de Enterobacterias
Indicadores de pH
Inhibidores de Enterococos
Tipos de Medios de Cultivo
Slidos

Lquidos

Semi-slidos
Almacenaje
Los medios de cultivo deshidratados son
higroscpicos, por ello los frascos deben abrirse en
ambiente seco y durante su almacenaje debe
conservarse su hermeticidad.
Almacenaje
En general, los medios deshidratados se deben
almacenar entre 15 y 25C, a menos que el
proveedor recomiende otras condiciones.


Almacenaje
Debe evitarse:

Humedad

Luz solar directa





Almacenamiento de Medios
preparados (refrigeracin)
Agares plaqueados

2 semanas
Medios en tubos tapa cap-o-
test

2 semanas

Medios en tubos tapa rosca

3 meses
Agares solidificados cierre
hermtico

3 meses
Almacenamiento de placas

Debe prevenirse la desecacin, sellando cada placa
con cinta adhesiva a lo largo del cierre entre la tapa
y la base, luego embalar varias placas en bolsas
plsticas hermticas.
Alteraciones
Desarrollo de microorganismos
Variaciones de pH
Alteraciones de color
Aglomeraciones
Endurecimiento
Preparacin
A partir de :

Componentes
Medios preparados deshidratados

Preparacin
Leer las instrucciones del
envase.
Pesaje
Pesar la cantidad indicada por la formulacin el
proveedor.
Hidratacin

Utilizar agua clase 4, segn NCh426/2
Utilizar envases limpios
Utilizar envases de vidrio borosilicatado

Agua Clase 4
Unidad Lmite

Frecuencia
Conductividad a 25C S/cm 5 Diario o en
cada uso
pH a 25C Unidad de pH 5 7

Diario o en
cada uso
Carbono orgnico total mg/L * *
Metales pesados (Cd, Cu, Pb,Zn) mg/L N.D.

Anual
Metales pesados (Cr, Ni) mg/L 0.05 Anual
Cloro residual total

mg/L N.D.

Diario o en
cada uso

Recuento heterotrfico u.f.c./mL 1.000

Mensual
Recomendaciones
No preparar medios en envases mayor a 1L.
Aadir una porcin de agua y homogenizar.
Luego, aadir el volumen restante del agua y
homogeneizar completamente.
Hidratacin
Todo tipo de medio de cultivo es sensible al
calentamiento.
Por este motivo, no debe calentarse ms de lo
estrictamente necesario .
Hidratacin
Los medios nutritivos que no contienen agar ni
gelatina se pueden disolver, por lo general, en agua
fra o bajo ligero calentamiento.
Hidratacin
Los medios nutritivos que contienen agar o gelatina
deben ser calentados para conseguir una disolucin
completa (baomara).
Hidratacin
En el caso de medios de cultivo no autoclavables es
imprescindible prestar atencin a su disolucin
completa.

Esto se aprecia cuando, al agitar, no se adhiere a la
pared interna del recipiente partcula alguna de
agar y la solucin, viscosa, resbala libremente.

Hidratacin
Para medios no autoclavables:

Utilizar agua estril

Utilizar envases estriles

Pesar al lado de mechero
Medicin de pH
Calibrar el equipo.
Medir pH
Ajustar pH a 25C,
segn especificacin
del medio
Ajuste pH
Para el ajuste de pH se utilizan:

HCl 1N
NaOH 1N

Distribucin
Distribuir el medio en envases, segn uso en botellas o
tubos.
Esterilizacin
Esterilizacin por calor hmedo = Autoclave

Esterilizacin por filtracin = Equipo filtracin
de vidrio
Verificar nivel de agua del autoclave.
Seleccionar ciclo de esterilizacin, generalmente se
utiliza 15 minutos a 121C.
Esterilizacin x Calor Hmedo
Esterilizacin x Calor Hmedo
No cerrar los envases hermticamente, para permitir la
libre circulacin del vapor y evitar riesgos de ruptura
durante el ciclo de esterilizacin.
Esterilizacin por filtracin
Utilizar envases estriles (matraz, embudo, vaso)

Se utilizan filtros de poro de 0.22m estriles
Verificacin de pH
Medios lquidos:
Tomar una porcin del medio
Medir pH con electrodo normal
Verificacin de pH
Medios slidos:
Plaquear un control
Dejar solidificar
Medir pH con electrodo de contacto
Control de Calidad
Esterilidad

Selectividad

Productividad

* Se deben hacer 3 controles por cada medio
preparado
Esterilidad
Por ciclo de medio preparado:

Tomar un tubo o una placa.
Incubarlos por el tiempo y temperatura
correspondiente.
Leer.
Esterilidad
Un medio estril corresponde a:

Tubo sin turbidez

Placa sin crecimiento

Selectividad
Significa la supresin del crecimiento de un
microorganismo que se espera que sea inhibido en
el medio de cultivo.
Productividad
Rendimiento, recuperacin o crecimiento de un
microorganismo que se espera que se desarrollo en
el medio de cultivo.
Control de Calidad
Selectividad y Productividad se verifican
sembrado cepas controles (positivos y negativos)
segn los medios de cultivo.
Control de Calidad
Control negativo : Vibrio cholerae
Control positivo : Vibrio parahaemolyticus
Control de Calidad
Control
positivo :
E. coli
productividad

Control
negativo :
S. selectividad
Control de
esterilidad
Importante
Los medios de cultivo no deberan ser utilizados
antes de verificar los controles de calidad.
Fuentes posibles de errores durante la
preparacin y almacenamiento.
Alta humedad de almacenamiento
El envase fue dejado abierto o no fue sellado firmemente despus de
que haber sido abierto.
El medio de cultivo deshidratado vencido
pH inapropiado
El medio de cultivo fue recalentado durante la preparacin
Grumos
Turbiedad o precipitacin (excepcin: medios de cultivo obligatorio
turbios!
El agua no fue desmineralizada adecuadamente

Fuentes posibles de errores durante la
preparacin y almacenamiento.
Envases usados para la preparacin no limpios
Prdida de agua del medio de cultivo preparado debido a la
evaporacin.
Punto de la solidificacin demasiado alto
Demasiado medio de cultivo deshidratado fue pesado
Menos medio de cultivo deshidratado fue pesado
Agar-agar no conveniente, estabilidad del gel demasiado baja.
El medio de cultivo deshidratado no fue disuelto totalmente
El medio no fue homogeneizado antes de verter las placas
El medio de cultivo cido no fue preparado bajo condiciones suaves
Cambios en la coloracin de los medios de cultivo
que contenan indicadores
pH incorrecto
recalentamiento durante la preparacin
pigmentos coloreados destruidos
azcares caramelizados
Medio de cultivo listo para utilizar
contaminado

Esterilizacin inadecuada
Secado de las placas en una incubadora contaminada (por
esporas)
Contaminado despus de la esterilizacin, el durante el
plaqueado
Placas Petri contaminadas
Almacenaje en un lugar contaminado (refrigerador)
Adicin de suplementos no estriles
Residuos de sustancias inhibidoras del crecimiento presentes
en los recipientes (ej. detergente)
Crecimiento invasivo

El medio de cultivo fue inoculado con demasiado
material de la muestra
La superficie del medio de cultivo era demasiado
hmeda

Crecimiento anormal

Medio de cultivo preparado incorrectamente
El medio de cultivo deshidratado era demasiado viejo
Condiciones incorrectas fueron utilizadas para el
cultivo
Residuos de las sustancias inhibidoras (ej. detergentes)
Fusin de Medios Slidos
Evitar el sobrecalientamiento.
Mantener el medio, previo a su uso, en un bao
termorregulado a 48 2C.
Nunca se debe emplear un medio >50C.
Preferible no mantener ms de 8 horas un medio
fundido.
Importante
Los medios de cultivo autoclavados, enfriados y
posteriormente fundidos no deben ser
resolidificados para uso posterior.
Preparacin de placas
Homogeneizar
Para evitar condensacin en
la tapa, verter el agar entre
46 y 50C.
Plaquear bajo campana o al
lado de mechero.
Preparacin de placas
Antes de sembrar, secar la superficie hmeda del
agar (t no superior a 30-40 C).
Para ello, se coloca la parte inferior de la placa,
con su cara interna hacia abajo, algo desplazada
sobre la tapa que ahora le sirve de apoyo.
Medios de Cultivos cidos
Los medios de cultivo a base de Agar y con un pH
inferior a 5,0 deben prepararse con sumo cuidado,
pues el agar se hidroliza al ser calentado en medio
cido y, por tanto, disminuye la estabilidad del gel
del medio de cultivo.
Eliminacin de los cultivos
La desinfeccin trmica de cultivos debe realizarse
sometindolos al autoclave (121 C, aprox. 30 min.)

Si existen instalaciones incineradoras adecuadas, la
muerte y eliminacin de los cultivos tambin puede
llevarse a cabo incinerndolos.


Eliminacin de los cultivos

Descontaminar todos los materiales asociados a la
siembra de cultivos.








Fin presentacin