Dosis letal 50

Sandra Paola AviaGamio

Jos Alejandro Franco Guerrero
Esteban Galicia Romero
Dayn Snchez Lpez
La presencia de los virus se reconoce
por la manifestacin de algn
anormalidad en los organismos o en
las clulas hospedero.
A travs de stos cambios
morfolgicos celulares es posible
poner en evidencia la presencia de un
virus en determinado tipo de cultivo
de clulas.
Efecto citopatognico ltico por Herpesvirus
EFECTO CITOPATOGNICO: sincicios, c.
de inclusin
Las tcnicas de titulacin viral son en
muchos casos un paso previo y
necesario para desarrollar otros tipos
de estudios .
TITULACIN VIRAL
"Titular" significa determinar la
cantidad del elemento en cuestin que
esa preparacin contiene.

La estimacin del nmero de virus o
unidades infecciosas por unidad de
volumen se conoce con el nombre de
titulacin.

Mtodos empleados

Basados en la constitucin fsico-qumica


Basados en sus propiedades biolgicas

Mtodos fsico-qumicos
Microscopa electrnica

Hemaglutinacin

Presencia de enzimas especficas

Propiedades antignicas (Precipitacin,
Fijacin de complemento)

Propiedades biolgicas.
Determinar la actividad o potencia de una
suspensin viral.



Debe observarse el efecto que el virus produce
en el husped inoculado.
Para titular un virus, primero hay que definir
muy bien las lesiones que produce.

Se toma en cuenta la interaccin de la partcula
viral con la clula hospedero.


Virus + Clula Efecto observable


Por unidades formadoras de placas (UFP)



Mtodo del punto final 50%
Existen dos mtodos para titular un
virus:
Preparar un grupo de tubos marcados desde 10
-1
y hasta 10-
9
,
dependiendo del ttulo viral sospechado.
Pipetear aspticamente 0.9 ml del diluyente en cada uno de los
tubos.
Descongelar rpidamente un vial del virus (preferiblemente a
37 C).
Transferir 0.1 ml del virus al primer tubo con diluyente, eliminar
la pipeta. Mezclar.
Transferir con una pipeta nueva 0.1 ml de la dilucin de virus 10-
1 al siguiente tubo y as sucesivamente.
PREPARACION DE DILUCIONES VIRALES
Para calcular el nmero de partculas infecciosas
de una determinada suspensin viral, se aplica el
mtodo de la dilucin limite.



A dicha dilucin se le denomina Punto Final
(PF).
Mtodo del punto final 50%
Mtodo del punto final 50%
Referencia 100% de actividad vrica: determinacin
inexacta.



Se prefiere tomar de referencia 50% de la actividad viral:
los valores fluctan alrededor del punto medio.
Curva Dosis- Respuesta
La respuesta se mide como porcentaje de efecto

La dosis se expresa como dilucin de la muestra viral.
Es preciso hacer referencia al sistema hospedador
empleado:
Aplicando mtodos de cuantificacin adecuados
y perfectamente estandarizados.


Mtodo de Reed y M ench
TITULACIN VIRAL
Como se hace??
Mtodo de Reed y Mench
Son datos derivados de una respuesta cuantal
en la que no se observan el 50% de respuestas
positivas ni el 50% de respuestas negativas,
para calcular el punto final de la actividad del
virus.
Se basa en la suposicin de que el nmero de
unidades de prueba afectadas vara
proporcionalmente al log
10
de la dilucin, es
decir que a diluciones menores (mayor
concentracin de virus) el porcentaje de
efecto ser mayor que a diluciones mayores
(menor concentracin de virus).
Mtodo de Reed y Mench
El punto final se determina por interpolacin a partir de
las frecuencias acumuladas de respuestas positivas y
negativas.


Valor estadstico del mtodo dado por el aumento del
nmero de repeticiones que se obtiene por el cmputo de
los valores acumulativos de las respuestas positivas o
negativas.
Mtodo de Reed y Mench
Bioestadstico

Respuestas positivas sobre el total de los
eventos posibles

Gradiente de actividad

(a > dilucin < actividad)

SI o NO

POSITIVO o NEGATIVO

Mtodo de Reed y Mench
a) Disponer los resultados obtenidos en forma
tabular

b) Abarcar diluciones tanto las ms bajas donde
se obtienen las respuestas positivas, como las
diluciones mas altas donde se obtienen todas las
respuestas negativas.

c) Anotar el nmero de respuestas positivas sobre
n.
Mtodo de Reed y Mench
d) Separar el nmero de respuestas positivas y
negativas.

e) Hacer la acumulacin de respuestas positivas,
sumando desde la dilucin ms alta a la mas baja.

f) Hacer la acumulacin de respuestas negativas,
sumando desde la dilucin ms baja a la mas alta.
Mtodo de Reed y Mench
g ) Obtener el total acumulado por dilucin,
sumando R (+) mas R (-)

h) Anotar la de R (+) sobre el total acumulado


i) Aplicar la frmula de Distancia
proporcional (DP) a la que se estima debe
estar el punto final 50%

Mtodo de Reed y Mench

%>50%- 50
DP = ------------------------
%> 50% -% <50%
j) Determinar el punto final 50% con la siguiente
frmula:




k) Determinar el ttulo con la siguiente frmula:

Mtodo de Reed y Mench
PF50%= log de la dilucin del % > 50% +
(DP x log del factor de dilucin)
Ttulo= Inverso del PF 50%
EJEMPLOS
Se emplea la formula con el resultado
redondeado al decimal mas prximo para
interpolar la distancia proporcional a la que
se estima que debe estar el PF50% entre las
dos diluciones.
Para determinar el PF50%:
Log de la diolucion mas baja = -8.0
Distancia proporcinal (0.2) x log
del factor de disolucion (10) (0.2x(-1)) = -0.2
Suma (PF50%) = -8.2

Antilog del reciproco del
PF50% =158500000 DL50
Titulo en DL50 por 0.1c.c =10E8.2=
1.585X10E8
Titulo en DL50 por c.c
=10E9.2=1.585X10E9

El mtodo del PF50% puede emplearse con
diluciones distintas a las decimales o de factor
10.
Si trabajamos con diluciones de factor 2 y que
los totales acumulados sean 60% de mortalidad
en la dilucin 1/16 y la mortalidad nula en la
dilucin 1/32. La DP es 0.2
El PF50% se calcula:
Log de la dilucin mas baja(16) =-1.2041
DP(0.2) x log del factor dilucin(2)
(0.2x (-0.301030)) =-0.0602
Suma (PF50%) = -1.2643
Antilog PF50% (dilucin) 1/18
Antilog del reciproco del PF50% 18DL50
Ejemplo.
Se titul una suspensin de virus de
Newcastle en embrin de pollo, usando
como criterio indicador de la replicacin del
virus la letalidad, el volumen de inoculo fue
de 0.1 ml por embrin obteniendo los
siguientes resultados.
Dilucin del
virus
10 10 10 10 10 10 10
Respuestas (+)
/n
10/10 9/10 7/10 6/10 4/10 2/10 0/10
Respuestas (+)
10 9 7 6 4 2 0
Respuestas (-)
0 1 3 4 6 8 10
respuestas (+)
38 28 19 12 6 2 0
respuestas (-)
0 1 4 8 14 22 32
Total
acumulado (+
y -)
38 29 23 20 20 24 32
respuestas (+)
/ total
acumulado
38/38 28/29 19/23 12/20 6/20 2/24 0/32
% de
respuestas (+)
del total
acumulados
100 96.5 82.6 60.0 30.0 8.3 0

DISTANCIA PROPORCIONAL (DP)









Determina el PF50% con la siguiente frmula:






PF50% = -5 + (0.3 x - 1)= -5.3






Determinar el Ttulo con la siguiente frmula:

Ttulo = inverso del PF 50%










Ejemplo
Para titular una suspensin de virus de la rabia
se us como criterio indicador de la replicacin
viral, la letalidad en el ratn lactante, el volumen
de inoculo fue de 0.02mL
DILUCIN DEL
VIRUS
10 10

10

10

10

10

10

Respuestas (+)/n 10/10 9/10 7/8 6/10 4/10 2/10 0/10
Respuestas (+) 10 9 7 6 4 2 0
Respuestas (-) 0 1 1 4 6 8 10
Respuestas (+)

38 28 19 12 6 2 0
Respuestas (-)

0 1 2 6 12 20 30
Total acumulado 38 29 21 18 18 22 30
Respuestas (+)/
total acumulado
38/38 28/29 19/21 12/18 6/18 2/22 0/30
% de Respuestas
(+) del total
acumulado

100 96.5 90.4 66.6 33.3 9.0 0
Si 0.02 mL cabe 50 veces en 1 mL entonces
habr que multiplicar la concentracin
obtenida en 0.02 mL por el logaritmo de
50.
Para obtener el titulo por 1cc

Ejemplo
Dilucin del
virus
10

10

10 10

10

Respuestas (+) /n
6/6 6/6 4/6 1/6 0/6
Respuestas (+)
6 6 4 1 0
Respuestas (-)

0 0 2 5 6
respuestas (+)
17 11 5 1 0
respuestas (-)

0 0 2 7 13
Total acumulado
(+ y -)
17 11 7 8 13
respuestas (+) /
total acumulado
17/17 11/11 5/7 1/8 0/13
% de respuestas
(+) del total
acumulados
100 100 71 13 0

71- 50 21
DP= = = 0.36 0.4
71- 12.5 58


PF50% = -3 + (0.4 x -1) = -3.4


Titulo = 10
-

.4
LD 50% /0.1 ml


Clculos para preparar las DL
50

En los dos ejemplos anteriores se
obtuvieron los siguiente resultados:

10
-3.4
y 10
-5.3
hacer los clculos para preparar 10 ml de estas
diluciones a partir de la dilucin anterior a la
DL
50

METODO SPEARMAN-KARBER
En base a los datos del cuadro XXXIV,
tenemos:
Ejemplo 2
Para titular una suspensin de virus de la rabia
se us como criterio indicador de la replicacin
viral, la letalidad en el ratn lactante, el volumen
de inoculo fue de 0.02mL
DILUCIN DEL
VIRUS
10 10

10

10

10

10

10

Respuestas (+)/n 10/10 9/10 7/8 6/10 4/10 2/10 0/10
Respuestas (+) 10 9 7 6 4 2 0
Respuestas (-) 0 1 1 4 6 8 10
Respuestas (+)

38 28 19 12 6 2 0
Respuestas (-)

0 1 2 6 12 20 30
Total acumulado 38 29 21 18 18 22 30
Respuestas (+)/
total acumulado
38/38 28/29 19/21 12/18 6/18 2/22 0/30
% de Respuestas
(+) del total
acumulado

100 96.5 90.4 66.6 33.3 9.0 0
Si 0.02 mL cabe 50 veces en 1 mL entonces
habr que multiplicar la concentracin
obtenida en 0.02 mL por el logaritmo de 50.

Para obtener el ttulo por 1 mL:



Ejemplo 3
Dilucin del
virus
10

10

10 10

10

Respuestas (+) /n
6/6 6/6 4/6 1/6 0/6
Respuestas (+)
6 6 4 1 0
Respuestas (-)

0 0 2 5 6
respuestas (+)
17 11 5 1 0
respuestas (-)

0 0 2 7 13
Total acumulado
(+ y -)
17 11 7 8 13
respuestas (+) /
total acumulado
17/17 11/11 5/7 1/8 0/13
% de respuestas
(+) del total
acumulados
100 100 71 13 0

71- 50 21
DP= = = 0.36 0.4
71- 12.5 58


PF50% = -3 + (0.4 x -1) = -3.4


Titulo = 10
-

.4
LD 50% /0.1 ml


Clculos para preparar las DL
50

En los dos ejemplos anteriores se obtuvieron los
siguiente resultados:

10
-3.4
y 10
-5.3
hacer los clculos para preparar 10 ml de estas
diluciones a partir de la dilucin anterior a la DL
50

En animales de experimentacin:
Dosis letal 50%:
Cantidad de virus necesaria para provocar la muerte al
50% de los animales.
Equivale a la Dosis Infecciosa de Cultivos Celulares 50%.
segn el hospedero en el que se realice la medicin, ser
el nombre que se le d a la cuantificacin.
Se define como la mxima dilucin (mnima
concentracin) del virus necesaria para producir
efecto (muerte, ECP, etc) en el 50% de los
hospederos usados (animal, clulas etc).
Dosis Infecciosa Cultivo Celular
50 DICC
50%
Cantidad de virus necesario para causar
Efecto Citoptico en el 50% de las
monocapas de clulas tratadas.

Platos de 96 pozos
50000 clulas / pozo
37C
5%CO
2
24 Horas
o mas
Evaluar
efecto
Citoptico por
tincin con CV
Observacin
al M. invertido
Infectar con
diluciones
decimales del
virus ( 10
1
, 10
-
2
...10
-12
)
Cuantificacin Viral
(DICC
50%
, DL
50%
)
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
DICC
50
= 10
4
C
C
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
C
C

































14/14
1
14/14
1
10/14
0.71
0/14
0
0/14
0
0/14
0
=2.71
DICC
50%
= 0.5 + ( log > [ ] virus) - prop Inf.

= 0.5 + (-2) 2.71

1 DICC
50%
= - 4.21
10 DICC
50%
= - 3.21
100 DICC
50%
= - 2.21
DICC
50%
Spearman Karber
CC CC
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
-9
10
-10
10
-11
10
-12






































7/7 7/7 7/7 7/7 7/7 3/7 1/7 0/7 0/7 0/7 0/7 0/7
DICC
50%
= 0.5 + ( log > [ ] virus) - prop Inf.

= 0.5 + (-1) 5.57

1 DICC
50%
= - 6.07
10 DICC
50%

= - 5.07
MTODO DE REED Y MUENCH
Para calcular la DL50%
DP = % mayor al 50% - 50%
% mayor al 50% - % menor al 50%
DP es la distancia proporcional que hay entre las dos
diluciones entre las cuales est el 50% y este valor se
le agrega a la dilucin superior al 50%.
Usos de la cuantificacin viral
Determinar el grado de infeccin de una
solucin de virus.
Estudios bsicos de gentica viral.
Mecanismos de resistencia natural.
Evaluacin de Actividad antiviral.
Control de calidad de vacunas.