Contrastao Negativa

Getlio
Lucelia
Paula
Contrastao Negativa
Os ons de metais pesados e de fina granulao
(urnio, tungstnio e molibdnio)
so usados para:
- contrastar
- bloquear parte do feixe de eltrons

As suas imagens apresentam-se como num
negativo, isto , as macromolculas ficam claras,
mais transparentes aos eltrons do que o fundo da
preparao.

Partculas CMV (Cucumber mosaic vrus) - acetado de uranila 2%.
No contraste negativo, as
macromolculas no so coradas, mas
sim rodeadas pelo denso contrastante.
O contraste negativo no usado para
corar materiais seccionados, mas sim
espcimes inteiras, como vrus,
bactrias, organelas celulares, etc.
usada para avaliar/estimar fraes
celulares (ribossomos, vesculas,
tubulos, etc) e para promover um
diagnostico clinico rpido de algumas
infeces virais.
Uma boa contrastao negativa nos
revela o contorno e a forma das
estruturas que queremos analisar.
a) Bacterifago; b) Vrus da batata; c) Adenovrus; d) Vrus da
influenza



As espcimes podem ser visualizadas com apenas minutos ps-
colorao.


A obteno de uma boa imagem depende do grau de limpeza da
suspenso, do seu pH e da afinidade dos contrastantes com as
suspenses.

Principais contrastantes
cido fosfotngnstico (k-PTA):
Utilizado como contrastante padro
pH 5 a 8 ( ajustado com KOH)
Estvel por semanas refrigerado se o
pH estiver abaixo de 6
Vrus, Bactrias, fraes celulares,
seces congeladas e macromolculas
(DNA, actina, enzimas...).
Adenovrus
Influenza
Acetato de uranila (UA):
Soluo a 1% em etanol a 45% ou 2%
em gua
pH 4.8
Emprega-se preferencialmente para a
contrastao de macromolculas, vrus
de hepatite B, bactrias e microfibrilas
Deve ser centrifugado imediatamente
antes do uso para a remoo de
precipitados
Guardar protegido da luz
Quando estiver turvo descartar
Deve-se evitar o contato com solues
de fosfato, pois ir ocorrer a
precipitao dos sais de uranila.
compatvel com solues de
cacodilato e tris.

Partculas de CMV (Cucumber mosaic vrus)
Molibdato de amnia (AM):
Emprega-se de 2% a 4% em gua
pH 6 a 7.4
Precipita facilmente nas preparaes
usado para membranas, subunidades
enzimticas e fraes celulares.
O contraste obtido com esse mtodo
no to bom quanto o acetato de
uracila, mas similiar ao K-PTA.
Permite melhor resoluo para detalhes
extremamente finos.
No to estvel quanto o K-PTA, mas
possui vida til similar ao acetato de
uranila.


Influenza


Citrato de uranila (UC):
Soluo a 2% em gua
pH 6.5
Utilizado em macromolculas
Deve ser centrifugado imediatamente antes do uso pois possui uma
granulao de fundo.


Oxalato de uranila
pH 6.5 a 6.8
Usado para molculas pequenas


Silicotungstato de sdio (SST):
Usa-se a 1% em gua
pH at 7.2
Sua durabilidade fica limitada de 1 a 2 meses
excelente para ressaltar pequenos detalhes estruturais
Fornece um contraste suave

Procedimentos para contrastao
negativa
Revestir os grid com pelcula de carbono.
Mtodos de preparo
Drop method:
Grid revestido com formar preso com pina e uma gota da amostra
depositada no grid. Aguardar 30 segundos para permitir a absoro da
amostra no substrado;
Adicionar o contrastante e aguardar secar
Visualizar no microscpio
Flotation method:
Grid revestido com formar/colodium colocada flutuando em uma gota da
amostra depositada em Parafilm. Aguardar 1 minuto para a absoro da
amostra.
Transferir o grid para uma gota de contrastante e aguardar ~30 minutos.
Visualizar no microscpio
Drop method x Flotation method
Fazendo imagens de componentes
subcelulares utilizando a contrastao
negativa
Quando componentes subcelulares so liberados das clulas
importante determinar a pureza da preparao ou estudar
componentes celulares:
A estrutura ribossmica foi elucidada aps milhares de contrastaes
negativas para gerar um modelo 3d da organela.
Pode-se visualizar Membranas fracionadas, filamentos citoplasmticos como
actina e miosina, mitocndrias.
A nica limitao que as estruturas no podem ser muito espessas ao ponto
de impedir a passagem dos eltrons.
Estrutura Ribossmica em 3d

Contrastao negativa de vrus
Tcnica utilizada a mais de 50 anos;
Consiste em misturar uma gota da preparao viral com uma gota do
contrastante em seguida depositar o grid flutuando em cima da mistura por 1
minuto.
Imunomarcao na contrastao
negativa
Permite a detectar a presena/ausncia de protenas, antgenos, e
outras macromolculas sobre a superfcie e/ou interior de espcimes
biolgicos em suspenso.
Partculas virais, fragmentos de clulas, bactrias, amostras de
lipoprotenas, e outros espcimes biolgicos podem ser
imunovisualizados com esta tcnica
Imunomarcao com partculas de ouro