Deteco do gene da nucleoprotena do vrus da cinomose

canina por RT-PCR em urina

de ces com sinais clnicos de cinomose
Universidade do Vale do Rio dos Sinos
Cincias Biolgicas
Biologia celular e molecular Prof. Dra. Dbora Gazzana Flores
Cristiane Cardoso
Giuliano Conrad
Glenda Villarroel
Luana Alves
Lucas Schvambach
So Leopoldo, junho de 2014.
INTRODUO
O vrus da cinomose canina (canine distemper
vrusCDV), considerado um dos mais importantes
patgenos de ces jovens e adultos em todo mundo
(Appel e Summers, 1995; Frisk et al. 1999).

Classificado no gnero Morbillivirus da famlia
Paramixoviridae (Van Regenmortel et al., 2000), o
CDV um vrus de RNA fita simples de polaridade
negativa.
INTRODUO
Os sinais clnicos da cinomose canina podem variar de acordo
com a virulncia da estirpe viral infectante, com o estado
imunolgico e com a idade dos ces.

Com maior freqncia so observadas alteraes oculares,
respiratrias, gastrointestinais e neurolgicas.

Esses sinais podem, isoladamente ou em associao, ser
encontrados em outras doenas infecciosas, dificultando o
diagnstico clnico (Rude, 1987; Shell, 1990; Tipold, 1995).
INTRODUO
Os mtodos que empregam a biologia molecular, e em
particular a reao em cadeia da polimerase (PCR), tm
contribudo com o diagnstico etiolgico de diversas viroses
em animais.
As principais vantagens dessa tcnica, precedida por uma
etapa de transcrio reversa (RT-PCR), para os vrus RNA
incluem:

Rapidez na obteno dos resultados.
No exigncia da infecciosidade da partcula viral.
Altos nveis de sensibilidade e especificidade.

INTRODUO
A RT-PCR tem sido empregada com sucesso na
deteco do CDV em diferentes tipos de amostras
biolgicas como sangue, soro, urina e fragmentos de
rgos (Shin et al., 1995; Frisk et al., 1999; Saito,
2001; Gebara et al.,2004).

O presente trabalho teve como objetivo utilizar a
tcnica da RT-PCR para a deteco do CDV em urina
de ces com sinais clnicos sugestivos de cinomose.

MATERIAIS E MTODOS
A estirpe do CDV, amplificada em clulas de MDCK (Madin
Darby canine kidney) ,foi utilizada como controle positivo na
tcnica da RT-PCR.
No perodo de janeiro a dezembro de 2001 foram colhidas 87
amostras de urina de ces com sinais clnicos sugestivos de
cinomose e 20 amostras colhidas de ces assintomticos.
A evoluo clnica dos animais foi acompanhada por 15 dias.
Os ces foram distribudos em quatro grupos constitudos por:
Grupo A- 41 ces com alteraes clnicas sistmicas;
Grupo B- 37 ces com alteraes clnicas neurolgicas;
Grupo C- 9 ces que apresentaram ambas alteraes;
Grupo D- 20 ces assintomticos que constituram o grupo
controle;

MATERIAIS E MTODOS
As amostras de urina, foram processadas imediatamente aps a
colheita ou armazenadas a 4C por no mximo 48h.

A extrao do RNA do CDV foi realizada a partir de uma
alquota de 300l de urina.

O cido nuclico das amostras foi eludo a 56C/15min em
40l de gua ultrapura auto clavada, tratada com 1l (26
unidades/l) de inibidor de RNAse.

Como controle negativo, alquotas de gua ultrapura auto
clavada foram includas em todas as extraes.

MATERIAIS E MTODOS
Para a realizao da RT-PCR foram utilizados os
oligonucleotdeos iniciadores CDV1 e CDV2, que amplificam
um produto de 287 pares de bases do gene que codifica a
nucleoprotena do CDV.
A transcrio reversa foi realizada com 9l de RNA e 20pmol
do iniciador CDV1, que foram desnaturados a 70C por 10min
e imediatamente transferidos para banho de gelo por 5min.
Posteriormente, foi adicionada a soluo RTMIX e gua
ultrapura auto clavada para o volume final de 20l.
Aps homogeneizao, a soluo foi incubada a 42C por
30min, seguida da inativao da enzima a 70C por 10min.

MATERIAIS E MTODOS
Para a reao da PCR foram utilizados 5l do cDNA, 20pmol
de cada um dos iniciadores (CDV1 e CDV2), 0,2mM de cada
dNTP, 1x tampo-PCR, 1,5mM de MgCl2, 2,5 unidades de
Taq DNA polymerase, recombinant e gua ultrapura auto
clavada para o volume final de 50l.

A reao foi realizada em termociclador, utilizando as
seguintes condies de tempo e temperatura:
i) uma etapa de desnaturao inicial a 94C por 1min;
ii) 40 ciclos de 94C por 1min, 59C por 2min e 72C por
1min;
iii) uma etapa de extenso final a 72C por 7min.

MATERIAIS E MTODOS
Todas as reaes foram realizadas na presena de
controles negativos da extrao do cido nucleico e
do sistema de PCR, representados por urina de ces
assintomticos e gua ultrapura auto clavada.

Os produtos amplificados pela RT-PCR foram
analisados por eletroforese em gel de agarose a 2%
em tampo TBE pH 8,4, sob voltagem constante por
aproximadamente 45min. O gel foi corado em
soluo contendo 0,5g/ml de brometo de etdeo e
visualizado sob luz ultravioleta.

MATERIAIS E MTODOS
A especificidade dos produtos amplificados na RT-
PCR foi avaliada pela anlise do perfil de restrio
com a enzima Hinf I , selecionada por meio da anlise
da seqncia do CDV pelo software Gene Runner.

A clivagem dos amplicons foi realizada de acordo
com as recomendaes do fabricante. Os fragmentos
obtidos foram tambm analisados por eletroforese em
gel de agarose como descrito anteriormente.

MATERIAIS E MTODOS
Para avaliar as diferenas entre amostras positivas e
negativas, utilizou-se o teste do qui-quadrado com
nvel de significncia de 5%.

Para a realizao dos clculos estatsticos foi
empregado o programa EpiInfo 6,04b (Dean et al.,
1997).

RESULTADOS
Das 87 amostras de urina coletas (grupo A, B e C), a RT-PCR
detectou 41 amostras positivas para o CDV;



Fonte: GEBARA ET. AL
RESULTADOS
Fonte: GEBARA ET. AL

RESULTADOS
Fonte: GEBARA ET. AL

RESULTADOS
No grupo A, a confirmao da CDV permite adoo de
condutas teraputicas apropriadas. Nos casos negativos, abre
perspectiva da realizao de novas condutas de diagnstico.

No grupo B, o diagnstico diferencial essencial para o
prognstico da doena, assim como a escolha do tratamento
adequado, visto que outras doenas infecciosas ou no,
apresentam alteraes neurolgicas similares a cinomose.

No grupo C, o resultado do estudo demonstra que situaes
onde ocorrem simultaneamente sinais clnicos sistmicos e
neurolgicos, a probabilidade do diagnstico maior.
RESULTADOS
A leucocitose foi a alterao mais
freqente nos grupos de ces com
sinais clnicos (grupos A, B e C).
Nos ces do grupo D, 2 animais
apresentaram anemia e
leucocitose, e retornaram a
valores normais 15 dias aps a
primeira anlise.
Estes dados ratificam que apenas
os dados hematolgicos no so
suficientes para o diagnstico
diferencial, pois eles podem ser
influenciados por diversos outros
aspectos.
DISCUSSO
A taxa de mortalidade de 58.5% observada nos ces positivos para
o CDV foi maior do que a encontrada nos ces com resultado
negativo na RT-PCR.

No foram realizados testes em paralelo para a identificao de
outros agentes infecciosos que podem ocasionar sinais clnicos
semelhantes aos apresentados pelo ces includos neste estudo.

Todos os animais do grupo controle (D) foram tambm avaliados
por at 15 dias aps a colheita de material biolgico e nenhum deles
apresentou qualquer sinal clnico sistmico e/ou neurolgico durante
esse perodo.
DISCUSSO
Exceto nas situaes em que o animal apresenta sinais
clssicos de mioclonia, com freqncia, o diagnstico, tanto
clnico quanto laboratorial, da cinomose canina de difcil
realizao.

Em vrios casos o diagnstico clnico incerto(Shell, 1990) e
alteraes hematolgicas, bioqumicas e mesmo exames
realizados no lquor podem no ser conclusivos (Greene, 1998;
Frisk et al., 1999; Moritiz et al., 2000).
DISCUSSO
Mtodos moleculares como a RT-PCR vm sendo
desenvolvidos para proporcionar o diagnstico de forma
rpida e, para contornar os inconvenientes da no sntese de
protenas virais nas formas subaguda e crnica ou da presena
de anticorpos, que podem interferir substancialmente na
maioria dos mtodos de diagnstico ante mortem.

Apesar de sensvel e especfica, a RT-PCR pode tambm no
excluir a infeco. Resultados podem sofrer interferncia de
diversos fatores, pois o genoma constitudo por RNA de fita
simples, e pode facilmente sofrer degradao.
CONCLUSO
A RT-PCR para a deteco do gene da nucleoprotena do CDV,
utilizando a urina como amostra biolgica, proporcionou o
diagnstico ante mortem da cinomose em ces com sinais clnicos
sugestivos da infeco.

O emprego de um mtodo sensvel de diagnstico ante mortem do
CDV permite que condutas adequadas de tratamento e profilaxia,
tanto da cinomose canina quanto de outras enfermidades que
apresentam sinais clnicos semelhantes, possam ser adotadas com
antecipao e eficincia.
Referncias
Artigos e livros:

C.M.S. Gebara, S.R. Wosiacki, F.J. Negro, D.B de Oliveira,S.N.E. Beloni, A.A. Alfieri, A.F. Alfieri.
Deteco do gene da nucleoprotena do vrus da cinomose canina por RT-PCR em urina de ces
com sinais clnicos de cinomose. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.56, n.4, p.480-487, 2004.

DE ROBERTIS, E. M. F.; HIB, J. Bases da biologia celular e molecular. 3. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara-Koogan, 2003

ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da clula. 5. ed. Porto Alegre: ArtMed, 2010.