TOXICIDADE

ANA LUSA M. MOROTTI

LUIS FELIPE COSTA SILVA

Florianpolis, 2012
Introduo

Recentemente, estudos eram realizados somente
durante os ensaios clnicos.
Descarte de 20 30%.
Ensaios mais prematuros causariam:
de custos;
no tempo;
da eficcia na obteno de novos candidatos.
KERNS; DI, 2008,
Introduo
KERNS; DI, 2008,
Introduo
KERNS; DI, 2008,

Maximizar a Janela Teraputica
Introduo
KERNS; DI, 2008,
Introduo

A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes
mecanismos:
KERNS; DI, 2008,

A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes
mecanismos:
Alvo teraputico

A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes
mecanismos:
Alvo teraputico;
No-alvo teraputico;
Metablito reativo

A toxicidade pode ser desencadeada por diferentes
mecanismos:
Alvo teraputico;
No-alvo teraputico
Introduo: Termos e Mecanismos
Toxicidade aguda
KERNS; DI, 2008,
Toxicidade crnica
Carcinogenicidade Citotoxicidade
Genotoxicidade Reao idiossincrtica
Imunotoxicidade Toxicidade em orgos
Fosfolipidose Toxicologia reprodutiva
Segurana farmacolgica Teratogenicidade
Toxicidade aguda Toxicidade crnica
Carcinogenicidade Citotoxicidade
Genotoxicidade Reao idiossincrtica
Imunotoxicidade Toxicidade em orgos
Fosfolipidose Toxicologia reprodutiva
Segurana farmacolgica Teratogenicidade
Mecanismo: Alvos Teraputicos
Modulaes nos alvos teraputicos podem trazer
efeitos indesejveis ao tecido alvo ou ao
organismo como um todo.
KERNS; DI, 2008,
Observada em estudos in vivo ou ensaios
clnicos.
Mecanismo: No-Alvos Teraputicos
KERNS; DI, 2008,
Avaliao in vitro de ligao ou atividade em
diversos alvos moleculares, ou estudo in vivo
com monitoramento de diversas funes
fisiolgicas.
O composto pode inibir inesperadamente uma
enzima ou receptor, causando toxicidade ou
efeitos adversos.
Mecanismo: Metablito Reativo
KERNS; DI, 2008,
Modificao estrutural em protenas pode induzir
resposta imune Hepatotoxicidade
O metablito, ou intermedirio, pode ser um
eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos
endgenos como o DNA.
KERNS; DI, 2008,
Mecanismo
KERNS; DI, 2008,
Mecanismo
KERNS; DI, 2008,
Ferramentas Experimentais
KERNS; DI, 2008,
O metablito, ou intermedirio, pode ser um
eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos
endgenos como o DNA.
O metablito, ou intermedirio, pode ser um
eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos
endgenos como o DNA:
Genotoxicidade
O metablito, ou intermedirio, pode ser um
eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos
endgenos como o DNA:
Genotoxicidade;
Toxicidade em rgo especficos
O metablito, ou intermedirio, pode ser um
eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos
endgenos como o DNA:
Genotoxicidade;
Toxicidade em rgo especficos:
Cardiotoxicidade;
Hepatotoxicidade;
Hematotoxicidade;
Fototoxicidade;
Neurotoxicidade;
Nefrotoxicidade.
O metablito, ou intermedirio, pode ser um
eletrlito, ligando covalentemente a nuclefilos
endgenos como o DNA:
Genotoxicidade;
Toxicidade em rgo especficos:
Cardiotoxicidade;
Hepatotoxicidade;
Hematotoxicidade
Ferramentas Experimentais
KERNS; DI, 2008,
Crescente necessidade antecipar os ensaios
toxicolgicos.

Aprimorar as ferramentas existentes para melhores
rendimentos e qualidade de anlise.
Ensaios de ADME so muito mais sofisticados que os
de toxicidade.
Cardiotoxicidade
WANG; URBAN; BOJANIC, 2007
Vrios frmacos retirados do mercado afetavam
uma nica protena no-alvo.
Canal inico de K
+
, especfico do corao
(subunidade )
Parcialmente responsvel pela repolarizao do
potencial de ao.
Hepatotoxicidade
WANG; URBAN; BOJANIC, 2007; XU; HOFFMASTER, 2011
HepG2 (clula de hepatocarcinoma) Estudos
gerais de potencial de citotoxicidade.
As clulas podem ser induzidas expresso de
CYP
Avaliao de necrose celular atravs dos nveis
intracelulares de ATP.
Somente clulas saudveis so capazes de
produzir
Pode-se avaliar injria mitocondrial.
HepG2 (clula de hepatocarcinoma) Estudos
gerais de potencial de citotoxicidade.
capacidade de metabolismo;
Clulas em proliferao.
HepaRG (seleo clonal da HepG2) e THLE
Hepatotoxicidade
XU; HOFFMASTER, 2011
HIAT (Ensaio de Tecnologia de Imagem do
Hepatcito)
Indica frmaco hepatotxicos;
Baixo ndice de falso-positivo.
Genotoxicidade
WAKMSLEY; ELDERM 2011
Dano ao DNA pode tomar propores catastrficas.
Dano oxidativo Modifica as bases induzindo a
erros de replicao e quebra da dupla hlice.
Ligao do xenobionte ao DNA
Metilao das bases A alquilao rotineira,
mas a metilao pode induzir quebra da dupla
hlice.
Hidrlise Depurinizao, depirimidinao, e
deaminao.
Erro no reparo, mutao/dano.
Genotoxicidade
WAKMSLEY; ELDERM 2011
Estudo in vitro em clulas humanas e em bactrias
Bactrias so menos complexas:
No apresenta membrana que reveste o
ncleo;
Menor empacotamento do DNA;
nico cromossomo circular.
Alvos especficos podem no estar presentes em
todas as linhagens de clulas eucariticas
Mutao gnica Dano cromossomal
Induo expresso
gnica
Genotoxicidade: Ensaio Cometa
RIBEIRO et al., 2007; WAKMSLEY; ELDERM 2011
Eletroforese do contedo nuclear de clulas
A cabea contem grande quantidade enovelada de
DNA.
Calda contem pores onde houve pelo menos a
quebra de uma das duas hlices do DNA.
Estudos in vitro
A dificuldade em predizer a toxicidade em humanos
reside no mecanismo toxicolgico nico de cada
NCE.
ASTASHKINA; MANN; GRAINGER, 2012
A toxicidade de frmacos in vivo uma sequencia
de eventos multifatoriais, dinmico, e complexo.
O processo que leva ao dano, como resultado da
exposio farmacolgica, pode variar
significantemente, ou ser especfica para cada
rgo, e envolver interaes entre clulas e
frmaco, metablitos e conjugados frmacos-
protena.
Frmaco Retirados do Mercado
ASTASHKINA; MANN; GRAINGER, 2012
Terfenadina
Frmaco antihistamnico retirado do mercado por
causar toxicidade cardaca
ASTASHKINA; MANN; GRAINGER, 2012; ZHOU, 2008
Inibio da CYP2J2 enzima reguladora do tonus
vascular e de eventos anti-apoptticos.
Modelos in vivo
Distribuio especfica de CYP, distribuio do
frmaco, taxa de reaes de fase I, e via
preferencial de fase II variam significativamente em
roedores, coelhos, ces, e humanos.
DORATO; BUCKLEY, 2001
Ainda o modelo que melhor possibilita verificao
da interao entre mecanismos em rgos diversos.
Concluso
Modelos in vitro podem dar noo da capacidade
toxicolgica de NCE, mas existe necessidade de
realizao de diversos ensaios especficos. no
eliminando a necessidade de ensaios in vivo.
Existe grande variao entre espcies, o que, s
vezes, dificulta a extrapolao dos dados in vivo
para humanos, principalmente a respeito de dose
txica.
Apesar das desvantagens, a combinao destes
ensaios imprescindvel para avaliao pr-clnica
dos NCEs.
hERG K
+
Channels (I
Kr
)
Bloqueio destes canais: Altera a
repolarizao ventricular,
prolongando o intervalo QT.
Vulnerabilidade para o
desenvolvimento de taquiarritmias do
tipo torsades de pointes e morte
sbita.




Canais de potssio formados por
subunidades individuais codificadas
pelo gene Human ether- a- go- go-
related gene (hERG)
Conduzem corrente responsvel
pela repolarizao no fim do intervalo
QT (fase 3)
hERG K
+
Channels (I
Kr
)

Apesar de terem stios de ligao com formas
caractersticas e carter hidrofbico, os canais
hERG interagem com farmacos, das mais variadas
estruturas.

Dentre estes frmacos, encontram-se
antibacterianos, antifngicos, antipsicticos e
antivirais.

Interaes frmaco-frmaco: Podem aumentar os
nveis plasmticos de bloqueadores dos canais
hERG.


Como regra geral:

Intervalo de segurana > 30 x hERG IC
50
/ Cmx
esperada do composto
Muitas organizaes se direcionam, para a predio das
propriedades ADMET j nos primeiros passos:
Fail fast, fail
cheap
Modelos de 1
a
gerao: Regra dos 5 de Lipinski

Modelos de 2
a
gerao: Parmetros
farmacocinticos

Modelos de 3
a
gerao: Metabolismo de
xenobiticos
Avaliao toxicidade de canais hERG

Clamp de voltagem - PADRO OURO
Patch Clamp
Planar patch clamp
Ensaios com marcadores de fluorescncia


http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-ph1008.html
Modelagem por Homologia
Um modelo tridimensional da sequncia protena
criado baseado em estruturas homlogas.
Estruturas atmicas disponveis: Canais de K
+
de
bactrias KcsA (fechado) e MthK (aberto)

KvAP
Modelagem por Homologia
QSAR

Identificao e quantificao das propiedas fsico-
qumicas de um frmaco e relao destas com atividade
biolgica.

Assim, pode-se estabelecer uma relao que permite a
determinao de propriedades que desempenham um
papel inportante na farmacocintica ou no mecanismo de
ao.
QSAR
1
o
farmacforo sugerido por Ekins et al:
15molculas de literaturas
4 grupamentos hidrofficos; 1 grupamento de carter
ionizvel positivo.


Predio de IC
50
de 22 frmacos, a maioria
antipsicticos, conhecidos por inibir hERG.



Expanso para 66 molculas:
R=0,90
R=0,83
R=0,86
Adio de mais 25 molculas da literatura
diminuiu o ndice de confiabilidade, obtendo um
valor de correlao R=0,67.
QSAR
Cavalli et al,
Farmacforo a partir de 31 molculas da literatura
conhecidas como por prolongarem o intervalo QT
3 grupamentos aromticos ligados a uma amina terciria



Predio de IC
50
6 frmacos da literatura

R=0,952
R=0,744
QSAR
Pearsten et al,
Modelo baseado em dados de um patch clamp in house
de 28 compostos, 18 deles eram anlogos do Sertindol:
QSAR
Keseru,
55 compostos da literatura para criar um modelo de
QSAR baseado em 5 descritores:
CLog P
Refrao molar calculada
rea de superfcie negativa
Polarizabilidade
Hidrofobicidade

Modelo testado com 13 compostos para validao
R= 0,94
R= 0,56
Mtodos de Classificao

Distribuio dos frmacos em classes ou categorias
baseadas em alguma observao funcional.

Compostos foram separados em ativos e inativos em
relao ao bloqueio de hERG:
Mtodos de Classificao
Roche et al:
Modelo com 244 compostos: diversas tcnicas de classificao.
A tcnica mais precisa para a classificao foi baseada numa rede
neural artificial.
Para a validao, 95 compostos (57 com valores IC
50
obtidos in
house e 38 com valores da literatura) foram avaliados. 93% dos
compostos inativos e 71% dos ativos foram classificados
corretamente.

Buyck et al,
Experimentos in house, avaliando caracteristicas fisico-qumicas.
Fatores sugestivos de inibidores de hERG: Clog P3,7;
110CRM* <176 e pKa mx 7,3.


*Refrao molar calculada
Mtodos de Classificao
Aronov e Goldman,
3 pontos para verificao de farmacforos bloqueadores
de hERG.
Consideraes Estruturais
1) A afinidade dos canais
hERG decrescem
significativamente com
agente bloqueadores
quando h ligantes
polares e de baixo peso
molecular. Possivelmente
relacionado ao carter
lipoflico dos canais hERG
e pela largura de seus
poros.
Consideraes Estruturais

2) Grupamentos bsicos solveis ou nitrognio positivamente
carregado aumenta a afinidade do bloqueador pelos canais hERG.

3) Flexibilidade da molcula inibidora ajuda os ligantes a
encontrarem uma conformao compatvel para os diversos
ligantes dos canais hERG.

4) O arranjo dos ligantes em meta ou para parecem menos ativos
como bloqueadores hERG. A colocao do grupo solubilizante, se
presente, pode ter um forte impacto sobre os canais hERG.



Referncias
ASTASHKINA, A.; MANN, B.; GRAINGER, D. W. A critical evaluation of in vitro cell
culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology &
Therapeutics, v. 134, p. 82-106, 2012.

DORATO, M. A.; BUCKLEY, L. A. Toxicology testing in drug discovery and
development. Current Protocols in Toxicology, San Diego: John Wiley & Sons, Inc.
2001.

KERNS, E. H.; DI, L. Drug-like properties: Concepts, structure design and
methods: from ADME to toxicity optimization. 1. ed. San Diego: Academic Press.
2008, 549 p.

RIBEIRO, M. L.; PRIOLLI, D. G.; MIRANDA, D. D. C.; PAIVA, D. A.; PEDRAZZOLI
JNIOR, J.; MARTINEZ, C. A. R. Avaliao do dano oxidativo ao DNA de clulas
normais e neoplsicas da mucosa clica de doentes com cncer colorretal. Revista
Brasileira de Coloproctologia, v. 27, p. 391-402, 2007.

XU, J. J.; HOFFMASTER, K. Genetic Toxicity: in vitro approaches for medicinal
chemists. In:TSAIOUN, K.; KATES, S. A. ADMET for medicinal chemists: a practical
guide. 1. ed. New Jersey: John Wiley & Son, Inc. 2011. 524 p.
Referncias
WALMSLEY, R. M.; ELDER, D. Hepatic Toxicity. In:TSAIOUN, K.; KATES, S. A.
ADMET for medicinal chemists: a practical guide. 1. ed. New Jersey: John Wiley &
Son, Inc. 2011. 524 p.

WANG, J.; URBAN, L.; BOJANIC, D. Maximising use of in vitro ADMET tools to
predict in vivo bioavailability and safety. Expert Opinion on Drug Metabolism and
Toxicology, v. 3, p. 641-665, 2007.

ZHOU, S. F. Drug behave as substrates, inhibitors and inducers of human cytochrome
P450 24. Current Drug Metabolism, v. 9, p. 310-322, 2008.