MS. J ESUS RUIZ BACA .

PRODUCCION DE AMILASA
.
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BIOTECNOLOGA
Mundialmente, la produccin de enzimas esta
desarrollndose aun ms, bajo el principio de
optimizar procesos y convertirlos en bioprocesos.
La aplicacin de esta industria gira en torno a pases
industrializados que tienen la capacidad de investigar
y producir a gran escala estas protenas, lo cual
margina a pases menos desarrollados a causa de
carencia de recursos, infraestructura y desarrollo en
el campo biotecnolgico.
Sin embargo, esta afirmacin no ha sido un
impedimento para que en diversos lugares del mundo
se investigue en el rea de la enzimologa y el impacto
que estas ocasionan en los procesos y reacciones
qumicas.
Enzimas amilasas son las mas estudiadas en este
campo debido a su influencia directa en la
degradacin del almidn, uno de los productos
alimentarios mas explotados a nivel mundial.
Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan
molculas de almidn dando como productos dextrinas
y polmeros compuestos progresivamente por
unidades de glucosa.
Esta familia de enzimas hidrolticas esta compuesta
por a protenas catalticas: alfa-amilasa, beta-amilasa;
glucoamilasa; isoamilasa.
Se encuentran ampliamente distribuidas en tejidos
vegetales, donde juegan un rol muy importante en la
degradacin del almidn en la germinacin de las
semillas; en tejidos animales, cumpliendo una misin
digestiva; y en diversas especies de microorganismos
como hongos y bacterias.
Enzima amilasa: Accin y clasificacin
Mundialmente la comisin enzimologica (E.C.) es el
encargado de identificar a todas y cada una de las
enzimas existentes.
Esta Universidad reconoce la enzima alfa-Amilasa
como E.C. 3.2.1.1.
Su nombre sistemtico es alfa-1,4-glucan-4-
glucanohidrolasa.
Otros nombres comunes en el comercio y el mbito
cientfico son glucogenasa y endoamilasa.
Estas se caracterizan en llevar a cabo la reaccin de
endohidrlisis que se sita de los enlaces 1,4-alfa-D-
glucosidicos en polisacridos que contienen 3 o ms
enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos.
Obtener amilasa microbiana por fermentacin lquido
para aplicacin en procesos agroindustriales de
alcohol carburante a base de almidones.
Objetivo
Metodologa Propuesta
Aislamiento e identificacin de los microorganismos
Los microorganismos se obtienen de chips de yuca expuestos a la
intemperie a contaminacin ambiental, por un tiempo de entre 10 a 15
das.
Para ello se realizan chip con grosores comprendido entre 1 y 15 mm. y
se disponen en bandejas.
Una vez obtenido el o los microorganismos que estn ejerciendo un
proceso degradativo de los chips, se pasan a una solucin con 10% de
harina de yuca, con agitacin constante a 120 rpm, durante 5 das.
Al cabo del cual se realizan pruebas de azucares reductores, para
determinar el o los microorganismos con mayor capacidad de
degradacin, y se sembran en medio solido de YPS, para su purificacin
e identificacin.
Medio Slido de YPS (Yeast Peptone Soluble starch).
De acuerdo con distintos microorganismos
presentes en la solucin de yuca, se asla cada uno
de ellos de manera independiente y se colocan en
cajas de Petri esterilizadas sobre las que se sirve
medio microbiolgico YPS.
Para descartar contaminacin ambiental, se siembra
2 blancos con 1 ml de agua destilada estril sobre
medio el mismo cultivo.
Medio para fermentacin.
Se preparan 700 ml, en un Erlenmeyer de 1 Litro, de
medio de cultivo YPS lquido. Conteniendo en (g/l): 0.5
de extracto de levadura; KH2PO4, 10; (NH4)2SO4,
10.5; MgSO4 7H2O, 0.3; CaCl2, 0.5; FeSO4 7H2O,
0.013; MnSO4 7H2O, 0.004; ZnSO4 H2O, 0.004, CoCl
6H2O, 0.0067 y harina de yuca al 1 10% como fuente
de carbono.
Se Esterilizan a 110C durante 15 minutos y se
colocan en agitacin orbital a 120 r.p.m por un periodo
de 5 das.
El medio de cultivo para fomentacin es inoculado con
un complejo de dos microorganismos aislados,
utilizando 5 ml de solucin del complejo microbial.
Cuantificacin de Biomasa del complejo
Se hace determinacin por el mtodo de peso seco
y el mtodo de protenas.

Peso Seco. Se toma una muestra de 3 ml cada 3
horas durante 5 das. Las muestra de llevan hasta
peso seco constante en una estufa a 105 grados.

Se toman 3 ml de medio cada 3 horas.
El proceso se lleva a cabo realizando choque trmico y
centrifugado de las muestras durante 10 minutos a 5000
rpm.
El sobrenadante obtenido se le determina protenas totales
por el mtodo de Biuret.
Las muestras se leen a una longitud de onda de 550 nm.
Los datos obtenidos se comparan con una curva patrn
de BSA, para determinar la concentracin de protenas
presentes en la muestra.
Determinacin de protena.
Se toman 3 ml del medio de cultivo, cada 3 horas
durante 5 das y se realiza prueba de azucares
reductores con 3,5 acido dinitrosaliclico.
Las lecturas se hacen a 540 nm, para glucosa y a
520 nm para maltosa, los datos obtenidos se
comparan con curvas patrones de glucosa y maltosa
respectivamente.

Medicin de producto
Se toman 3 ml de muestra de la fermentacin cada
3 horas, a las cuales se le se agregan del reactivo
yoduro-yodato y se realizan lecturas de
absorbancia a una longitud de onda de 620 nm.
Los datos se compararan con la curva estndar
preparada con harina de yuca para determinar la
concentracin presente de sustrato en la muestra.
Medicin de sustrato.
Se hacen determinaciones de protenas
partiendo de una protena conocida (Albmina
del suero Bovino o BSA de Sigma).

Para ello se preparara una solucin estndar de
BSA al 0,5 % y se diluye como se muestra en
la Tabla 1.
Curva de Calibracin para protena.
Tubos
Solucin (ml)
1 2 3 4 5 6
Biuret 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0
Solucin Estndar BSA 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0
H
2
O 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
Tabla 1. Diluciones para la construccin de la curva de calibracin
para Biuret.

Se mezcla bien, y se deja reposar por 30 minutos, para leer en el a
una . = 550 nm
Se establece una curva con D-Maltosa y otra con D-
glucosa, para convertir las lecturas de absorbancia
de las muestras de fermentacin a unidades de
actividad enzimtica de la amilasa, es decir, la
liberacin de un micromoles de azcar reductor,
calculado como maltosa o glucosa por minuto bajo
las condiciones del ensayo (ver Tabla 2).
Curva de Calibracin para Maltosa y Glucosa.
Tabla 2. Diluciones para la construccin de la curva de
calibracin para Maltosa.
Tubos
Solucin (ml)
1 2 3 4 5 6
DNS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Solucin Estndar Maltosa o
Glucosa al 0,5%
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
H
2
O 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
A las solucin de D-maltosa y D-glucosa se les adiciona
DNS y se pone en agua hirviendo por 5 minutos, se
deja reposar, y se le agrega agua hasta completar 10 ml
segn la tabla, las lecturas se realizan a = 520 nm
para maltosa y a 540 nm para glucosa
El complejo enzimticos obtenido en cada muestra en
los diferentes das, se leen a la misma longitud de onda
que las curvas de calibracin.
Para ello se realizan 3 repeticiones para cada muestra,
tanto para determinar maltosas, glucosas y protenas.
El comportamiento enzimtico del complejo obtenido por
la fermentacin lquida se compara con el complejo
comercial de amilasa (stargen 001).
Determinando los factores que afectan la accin cataltica
del complejo de amilasas, analizndolos bajo un modelo
superficie de respuesta, con diseo compuesto central:
2^3 + principal, de acuerdo con los niveles y factores
mostrados en la tabla 3.
Los datos obtenidos se analizaran con el software
estadstico Statgraphics versin 5.1
Cintica del complejo enzimtico.
Tabla 3. Factores y niveles para evaluar la actividad
enzimtica
Factores Unidades
Niveles
Inferior Superior
Dosis ml de caldo enzimtico/g de pulpa
base seca
0.5 1.0
pH Adimensional
4 5.5
Temperatu
ra
C
30.0 50
La base del estudio, anlisis, desarrollo y aplicacin
de este proyecto es producir un complejo de
enzimas amilasas a partir de hongos, con el objeto
de determinar la aplicabilidad de dichas protenas en
los procesos agroindustriales del departamento.
Este complejo servir como base para la planeacin
de muchos procedimientos industriales como la
hidrlisis del almidn, el cual presenta elevados
costos en las empresas del departamento de la
Libertad, especialmente plantas de biocarburantes.
Resultados Esperados
El que investiga genera nuevos
CONOCIMIENTOS, que pone a
disposicin de otros como
DATOS, que al ordenarse son
INFORMACIN, que puede llegar
a ser CONOCIMIENTO til,
apropiado o adaptado, por la
infraestructura de investigacin
de C&T que posea un pas.
REFLEXIONES
La incidencia positiva que las actividades de I+D tienen sobre el
desarrollo de los pases ha conducido a los gobiernos de los
diferentes estados a destinar una parte de sus recursos financieros a
potenciar ambas actividades. De esta manera ha sido posible
diversificar las lneas de investigacin con la finalidad de abarcar
cada vez ms campos y, al mismo tiempo, asegurar la formacin de
personal cualificado.

CHINA, actualmente a la vanguardia en el desarrollo
cientfico y tecnolgico mundial, fundament en 1980 su
productividad y competitividad, mediante Polticas de Ciencia y
Tecnologa, que form miles de Ph.D. en todas las disciplinas de la
C&T, en las ms prestigiosas Universidades del mundo.

CHILE, pas al que imitamos constantemente, ejecuta la
estrategia de las tres (C) COPIAR, COMPRAR,
CREAR, para lo cual cuenta con recurso humano calificado.
REFLEXIONES
Es de urgencia para el pas
apostarle a una Poltica de
Nacin de Ciencia y de
Tecnologa, que identifique
los nichos de conocimiento
a ocupar, y promueva la adquisicin
de infraestructura necesaria y la
formacin de recursos humanos con
capacidad de investigar, desarrollar y
aprovechar tecnologas que ayuden a
mejorar la calidad de vida de los
peruanos.
REFLEXIONES
MUCHAS GRACIAS
POR SU ATENCION
Atentamente:
Ms. Jess Ruiz Baca
jerubaunt30@gmail.com