INTRODUCCIN

El 40 % de los productos acuticos se deriva de la acuicultura, siendo valuada en 125 millones de USD a nivel mundial , Mxico es
un pas con grandes zonas costeras donde existe una gran diversidad biolgica con fines pesqueros, entre ellos est el langostino el
cual deja ganancia de ms de 6 millones de pesos para el estado de Tabasco (CONAPESCA, 2013). Durante la ltima dcada,
muchos pases de amrica latina han incrementado el inters por el cultivo de peces de agua dulce (Gleaves, 2009) en especial de
Macrobrachium carcinus, que debido a la sobrepesca y contaminacin de ros ha disminuido su captura, esta es una especie
potencialmente comercial, que atraviesa dificultades en la supervivencia de su estado larvario en granjas acucolas, por lo cual la
produccin masiva de juveniles sigue estando obstaculizada por el conocimiento limitado de los requerimientos nutricionales y al
pobre conocimiento de las fisiologas digestivas Los probiticos han sido uno de los mtodos ms empleados para controlar los
patgenos bacterianos potenciales, aumentar la sobrevivencia y mejorar el crecimiento de los animales, lo que les ha otorgado el
ttulo de microorganismos benficos y es de vital importancia conocer la flora bacteriana del Macrobachium Carcinus L. para
descubrir si existen en el consorcios bacterianos que ayuden a esta especie a un mejor desarrollo

OBJETIVO

General
Seleccionar y caracterizar cepas y consorcios bacterianos aislados del sistema digestivo del langostino Macrobrachium carcinus L, que demuestren antagonismo bacteriano in
vitro, y por consecuente caractersticas probiticas.

Especficos
Aislar cepas bacterianas usando medios selectivos a partir del sistema digestivo del langostino M. carcinus capturados en el ro Usumacinta.
Evaluar la capacidad probitica in vitro y susceptibilidad antimicrobiana de las cepas y consorcios bacterianos aisladas de langostinos.
Caracterizar bioqumicamente y genticamente las cepas BAL aisladas.

MTODOLOGA
Zona de muestreo y recoleccin de muestras
Para la obtencin de las cepas y consorcios bacterianos se utilizarn 25 langostinos
silvestres capturados va pescador en cinco comunidades rivereas del ro
Usumacinta en el municipio de Tenosique. Los organismos se transportarn vivos
con oxigenacin constante a 35C al laboratorio donde se mantendrn en completo
ayuno hasta su diseccin.

Aislamiento bacteriano
Los langostinos se diseccionarn bajo campana de flujo laminar, se tomarn
aspticamente el sistema digestivo completo. Las muestras se homogenizarn en
solucin NaCl al 0.85% estril y se efectuarn diluciones hasta 1x10
-7
; estas
diluciones se inocularn (1 ml) en caldo MRS (5ml) (De Man, Rogosa y Sharpe
DIBICO) Las diluciones sern sometidas a incubacin en microaerobiosis a 30C
por 72 h. De las diluciones que muestren crecimiento, nuevamente se prepararn
diluciones en solucin NaCl al 0.85% estril hasta 1x10
-8
, de cada una de estas
diluciones se tomaran 100 l. Este medio suave inoculado se aadir sobre agar
solido de MRS. Se incubar en microaerobiosis a 30C por 72 h. Se seleccionarn
aquellos fenotipos presuntivos BAL, en base a la coloracin y forma que tomaron
las colonias (Zamudio-Maya et al. 2007), se continuar con el proceso de
purificacin de las cepas obtenidas de este medio de cultivo durante 3 das. Las
cepas aisladas sern caracterizadas mediante su morfologa por tincin de Gram, as
como pruebas de catalasa y bioqumicas (Cervantes et al., 2006)

Pruebas probiticas.
A las cepas bacterias y consorcios (BAL putativas) obtenidas del aislamiento, se le
realizarn pruebas de tolerancia de crecimiento a diferentes concentraciones de
NaCl, pH y bilis de cerdo. Se desarrollarn pruebas fisiolgicas en caldo MRS a 30C
por 7 das: tolerancia de crecimiento en presencia distintas concentraciones de
NaCl adems de anlisis de crecimientos a diferente pH, diferentes porcentajes de
bilis de cerdo v/v y crecimiento con diferentes azucares.

Antagonismo bacteriano
Los consorcios y cepas de BAL aislados sern sometidas a pruebas de inhibin
microbiana frente a cepas patgenas de coleccin ATCC: Salmonella typhi,
Staphylococcus aureus y Salmonella sp. Utilizando el mtodo de doble capa descrito
por Dopazo et al. (1998)

REFERENCIAS
Bauer A., Kirby W., Sherris I., Turck M., 1966. Antibiotic susceptibility testing a standardized single disk method. Amer. J. Clin. Pathol. 45: 493-496 pp.

Cervantes C., Espino-Saldaa A. E., Aguilar F. A., Len Rodrguez I. L., Rivera M. E., 2006. Interacciones microbianas con metales pesados. Revista Latinoamericana de Microbiologa. 48 (2): 203-210.

Cole J.R., Chai B., Marsh T.L., Farris R.J., Wang Q., Kulam S.A., Chandra S., McGarrell D.M., Schmidt T.M., Garrity G.M. 2003. The Ribosomal Database Project (RDP-II): previewing a new autoaligner that allows regular updates and the new
prokaryotic taxonomy. Nucleic Acids Research. 31: 442-443

Gleavez Lopez, V. (2009). Elaboracin de microdietas suplementadas con levadura Debaryomyces hansenii para la alimentacin de larvas de peces marinos. (Tesis de Maestra), Centro de Investigacin Bilogica del Noroeste, S.C, La paz, Baja
California Sur, Mxico.

CONAPESCA (2013). Consulta especifica por especie. Disponible en: http://www.conapesca.sagarpa.gob.mx/wb/cona/consulta_especifica_por_produccion
Dopazo C, Lemos M, Bolinches J, Barja J, Toranzo A . 1988. Inhibitory activity of antibiotic-producing marine bacteria against fish pathogens. Journal of Applied Bacteriology 65: 97-

Zamudio-Maya, M., Narvez-Zapata, J., Rojas-Herrera, R. 2008. Isolation and identification of lactic acid bacteria from sediments of a coastal marsh using a differential selective medium. Letters in Applied Microbiology. 46: 402-407.
Determinacin de la resistencia a antibiticos
Para la realizacin de la prueba de susceptibilidad se emplear el mtodo de difusin en
agar descrito por Bauer et al., (1966), segn los lineamientos establecidos por el Instituto
para Estndares Clnicos y de Laboratorio . Finalmente se medirn los halos de inhibicin
con un vernier electrnico interpretando segn las tablas de estndares. Para la validacin
del mtodo se incluir la cepa control de P. aeruginosa ATCC 27853 y S. aureus de
sensibilidad conocida.

Identificacin molecular de las cepas BAL
Previo a la amplificacin se inocularan en medio lquido (caldo MRS o el indicado), las
cepas purificadas obtenidas de ambos medios de cultivo y se incubaran en agitacin (50
rpm) a 30C por 24 h. De ah, se tomar una alcuota de 1ml del cultivo bacteriano en fase
de crecimiento y se centrifugara a 10,000 xg durante 10 min; se desechara el
sobrenadante y la pastilla obtenida se lavar con agua estril centrifugando con las
condiciones antes mencionadas y se transferir una muestra de la pastilla por picadura
con un palillo de madera estril a un tubo de PCR de 0,2 ml. La muestra del cultivo celular
bacteriano recuperado ser amplificado con los iniciadores 16SS (forward) (5-
AGAGTTTGATCCTGG-CTCAG-3) y 16SR (reverse) (5-CGGGAACGTATTCA-CCG-3) presentes
en el gen ARNr 16S de Escherichia coli (posicin 8-1385). Cada mezcla (con un volumen
final, 25 l) deber contener: 14.05 l de agua bidestilada estril (H
2
O), 2.5 l de bfer de
PCR a 5X, 4.5 l de cloruro de magnesio (MgCl
2
) a 4.5 mM, 0.25 l de albmina de suero
bovina (BSA) al 0.1 %, 0.5 l de la mezcla de desoxinucleotidos (dNTPs) a 10 mM, 1 l de
cada uno de los iniciadores (16SS y 16 SR) a 5 mM, 0.2 l Taq Polimerasa (Invitrogen) a 1
U y muestra de cultivo celular ( o 1 l del ADN blanco). La amplificacin ser realizada en
un termociclador (Bio-Rad) con las siguientes condiciones trmicas: 10 min a 90 C en la
desnaturalizacin inicial, seguido por 25 ciclos de 1 min a 94C, 45 s a 45C y 1 min a 72C,
con una extensin final de 7 min a 72C. La verificacin de los productos de PCR se
analizarn en gel de agarosa al 1% (p/v) teido con bromuro de etidio (0.3 g/ml),
inyectando en el pozo del gel el amplicn junto con solucin acarreadora (relacin 1:1). Se
utilizar un marcador molecular de referencia (100 pb DNA Ladder, Invitrogen).
La electroforesis ser corrida en amortiguador TAE (Solucin stock 50X: 24.2% de Tris
base, 5.71% de cido actico glacial, 3.72% Na
2
EDTA2H
2
O) 1X a 60 V por 30 min. Se
observar en un transiluminador de radiacin UV y la imagen se almacenar en un equipo
foto-documentador Gel Doc XR system (BioRad), utilizando el programa Quantity One
(BioRad imaging systems).
Est. Leydi Yazmin Hernndez Arvalo
Dr. Jos Ulises Gonzlez de La Cruz
Dra. Mara Concepcin De la Cruz Leyva