CHROMATOGRAPHY

DEFINISI

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran

didasarkan atas perbedaan distribusi dari
komponen-komponen campuran tersebut diantara
2 fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase
gerak (cair atau gas).

Penemu Kromatografi

Pemisahan pigmen tumbuhtumbuhan

Mikhail Semenovich Tswett (1903)
Ahli botani Rusia

Chromatos: warna; graphos: menulis

COLOR WRITING

100 Tahun Kromatografi

- 1906: M.S. Tswett

Kromatografi kolom adsorpsi
- 1938: Izmailov & Shraiber
Kromatografi Lapis Tipis
- Martin & Synge (1941)
Kromatografi partisi
- James & Martin (1952)
Kromatografi gas
- 1964: J.F.K Huber HPLC

Pembagian Kromatografi
Kromatografi Adsorbsi

Bila fase diam yang digunakan berupa zat padat

yang aktif .
Kromatografi Partisi
Bila fase diam yang digunakan berupa zat cair.
Analog dengan ekstraksi cair-cair.

Jenis-jenis Kromatografi
Berdasarkan fase gerak yang digunakan,
kromatografi dibedakan menjadi 2 golongan besar.
Yaitu :
1. Kromatografi Gas
2. Kromatografi Cair

Pembagian Kromatografi Berdasarkan fase gerak

Kromatografi

Fase gerak gas

Kromatografi
Gas

Fase gerak cair

Krom.
Kolom
KK.
Terbuka

KLT

KK.
Vakum

Krom.
Kertas

KCKT

Kromatotron

Kromatografi (paling banyak digunakan)

KCKT = HPLC

KLT = TLC

GC = KG

Istilah
Kromatografi Lapis Tipis = Thin Layer Chromatography

Pengembangan = development = eluasi = elusi

Eluen = pelarut untuk pengembangan
Eluat = pelarut yang mengandung analit hasil pemisahan
dengan kromatografi
Kromatogram = gambar hasil pemisahan
Kromatograf = alat untuk kromatografi
Rf = retardation factor = jarak migrasi analit dari titik awal
/ jarak migrasi fase gerak setelah pengembangan

KLT
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dikembangkan oleh
Izmailoff dan Schraiber (1938).
KLT merupakan :
1. Kromatografi cair
Fase diam: padat, fase gerak: cair
2. Kromatografi planar (permukaan bidang datar)

3. Umumnya fase diam silika gel, alumina

Lapis Tipis terdiri dari:

Plat : kaca, Alumunium, plastik
Adsorben: silika gel, alumina, selulosa, dll

Macam-macam adsorben di pasaran:

Silika gel G, silika gel GF, silika gel H
Alumina H, Alumina HF

Selulosa

SILIKA GEL: SiOH (silanol), SiO2

Sifat polar
Silika gel G (mengandung pengikat gipsum CaSO4: 5-15%

Silika gel S (mengandung pengikat starch = pati)

Silika gel GF254 (mengandung pengikat gipsum & indikator
fluoresensi timah kadmium sulfida/mangan timah silikat aktif, yang
berfluoresensi pada 254 nm)
Silika gel H/silika gel N (tanpa mengandung pengikat) biasanya untuk
kromatografi vakum

Silika gel F254 (tanpa pengikat, tapi mengandung indikator floresensi)

Silika gel PF 254 & 366 (untuk pemisahan preparatif & mengandung
indikator floresensi).

 Adanya gugus hidroksil pada permukaan partikel silika gel

mengakibatkan permukaan silika gel sangat polar, sehingga analit
yg memiliki gugus fungsi polar akan terikat kuat pada permukaan
partikel silika gel & senyawa yg bersifat non-polar hanya
berinteraksi lemah dengan silika gel.
Molekul yang memiliki gugus fungsi polar dapat terikat pada silika
gel dalam 2 cara :
1. Melalui ikatan hidrogen
2. Melalui interaksi dipol-dipol
+
Si

+
Si

O
-

Si

OH
O

Alumina Al2O3
Lebih polar dibanding silika gel
Almunina basa, netral, asam

Alumina G, F, H, P

Model interaksi senyawa organik dengan

Alumina

Al

interaksi dipol-dipol

Al

ikatan hidrogen

OR

Karakter elektropositif yang dimiliki Aluminium atau Silika

dan karakter elektronegatif Oksigen menyebabkan silika &
alumina merupakan fasa diam yang sangat polar.
Oleh karena itu, semakin polar molekul yang akan dipisahkan,
semakin kuat interaksinya dengan fasa diam.
Sebaliknya, molekul non-polar yang afinitasnya lebih kecil
terhadap fasa diam akan cenderung berada dalam fase gerak
lebih lama dan akan terelusi lebih dahulu.

Beberapa jenis fasa diam untuk kromatografi

berdasarkan urutan kepolaran

Mekanisme KLT (fase diam Silika /Alumina):

1. Adsorbsi senyawa pada
adsorben/penjerap/fase diam
2. Kompetisi fase gerak & solut untuk berikatan
dengan fase diam, dimana solut lepas dari
permukaan fase diam => desorbsi
3. Senyawa dielusi oleh eluen/pengembang/fase
gerak

Ketika fase gerak melalui permukaan silika gel (plat KLT), fase gerak
membawa analit organik melalui partikel-partikel pada fasa diam.
Tetapi molekul analit hanya bisa bebas bergerak oleh adanya pelarut
apabila molekul tsb tidak terikat pada permukaan silika gel.
Kemampuan suatu analit terikat pada permukaan silika gel dengan
adanya pelarut tertentu dapat dilihat sebagai penggabungan 2 interaksi
yg saling berkompetisi.
1. Gugus polar dlm pelarut dapat berkompetisi dengan analit utk
terikat pd permukaan silika gel, shg jika digunakan pelarut yg
sangat polar, pelarut akan berinteraksi kuat dengan permukaan
silika gel & hanya menyisakan sedikit tempat bagi analit untuk
terikat pada silika gel. Akibatnya analit akan bergerak cepat
melewati fasa diam & keluar tanpa pemisahan.
2. Gugus polar pd pelarut dpt berinteraksi kuat dengan gugus polar
dlm analit & mencegah interaksi analit pd permukaan silika gel.
Pengaruh ini menyebabkan analit dengan cepat meninggalkan fasa
diam.

Pemisahan Kromatografi

Mechanism of Separation

based on polarity

Adsorption

Partition

based on ionic charge

Ion Exchange Chromatography

based on size

Gel Permeation

Gambar Kromatografi Lapis Tipis

Gambar Chamber

Cara Penentuan Nilai Rf

(retardation factor)

2 senyawa dikatakan identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika

diukur pada kondisi KLT yang sama.

Penampak Bercak:
1. Visual => analit berwarna
2. Penampak bercak kimia
Misalnya : Uap Iodium, Asam sulfat pekat,
ninhidrin.
3. Lempeng diberi fluoresensi

Penampak Bercak kimia, berdasarkan sifatnya:

1. Permanen: Asam sulfat pekat, ninhidrin
2. Sementara: Uap Iodium
Penampak Bercak kimia, berdasarkan spesifisitasnya:
1. Spesifik
ninhidrin : untuk zat dengan atom N (protein, Alkaloid, dll)
2. Umum

Uap Iodium, Asam sulfat pekat (hampir semua senyawa

organik).

Tempat penampak bercak dengan asam pekat

Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat
pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang
akan nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklat-coklatan.

Penampakan Noda dibawah Sinar

UV

1. Untuk penentuan jumlah komponen dalam campuran.

2. Untuk penentuan identitas antara dua campuran.
3. Untuk memonitor perkembangan reaksi.
4. Untuk penentuan keefektifan pemurnian.
5. Untuk penentuan kondisi yang sesuai untuk
pemisahan pada kromatografi kolom.

Bagaimana mendapatkan komposisi

fase gerak yang baik untuk KLT ????
1. Cari di pustaka (jika ada)

2. Jika tidak ada, cari yang sifatnya mirip

3. Jika tidak ada yang mirip lakukan percobaan

a. Lakukan eluasi dengan fase gerak paling non polar

b. Lakukan kenaikan kepolaran secara gradien
c. Evaluasi hasil, dan tentukan komposisi yang paling baik

Contoh Peningkatan Kepolaran secara

Gradien
Metanol:etil-asetat: (1:10)
Metanol:etil-asetat: (2:10)

Metanol:etil-asetat: (3:10)
Metanol:etil-asetat: (4:10)

Metanol:etil-asetat: (5:10)
Dst.

Tingkatkan kepolaran
Harga Rf sebaiknya 0,2 0,8
untuk memaksimalkan
pemisahan.

Turunkan kepolaran
Harga Rf sebaiknya
0,2 0,8 untuk
memaksimalkan
pemisahan.

Senyawa organik dapat bersifat polar dan Non-polar.

Berikut ini senyawa organik polar & non-polar :
Polar

Alkohol
Asam Karboksilat
Amida
Amina

Non-polar

Hidrokarbon
Alkil Halida
Aldehida
Keton
Eter

Urutan elusi (terbawa keluar oleh fase gerak ) beberapa senyawa

bergugus fungsi dari fasa diam silika atau alumina

Urutan kenaikan polaritas pelarut (deret eluotropik) :

Sikloheksana
Karbon tetraklorida
Benzena
Khloroform
Dietil eter
Etil asetat
Aseton
Etanol
Metanol
Air
(Basa dan Asam Organik)

Kenaikan Polaritas

Berdasarkan jenis fase, pengembangan dibagi:

Fase normal : jika fase diam lebih polar dari fase gerak
Fase terbalik : jika fase gerak lebih polar dari fase diam
Contoh fase normal : KLT dengan fase diam Silika dan fase
gerak petroleum eter.
Contoh fase terbalik : KLT dengan fase diam C18 dengan
fase gerak metanol.

KLT untuk Identifikasi

Umumnya parameter yang digunakan Rf
Totolkan, Jika ada senyawa pembanding
Gunakan lebih dari satu sistem eluen / fase gerak

Jika perlu gunakan fase diam yang berbeda

Jika mungkin gunakan penampak bercak yang khas
Anda dapat gunakan data Rf dari pustaka sebagai pembanding

Anda dapat menggunakan KLT Scanner untuk melihat identitas analit.

Jika perlu, dapat dikerok dan dilakukan identifikasi secara fisikokimia.

KLT untuk Preparatif

Analisis preparatif ditujukan untuk memisahkan analit dalam jumlah
yg banyak, lalu senyawa yang telah dipisahkan ini dianalisis le bih
lanjut, misalkan dengan spektrofotometri atau dengan teknik
kromatografi lain.

Sebaiknya gunakan plat dengan fase diam yang lebih tebal

Totolkan, jika ada senyawa pembanding

Anda dapat menotolkan sampel secara bergaris

Setelah pengembangan, masing-masing hasil pemisahan
dikerok dan dilarutkan dengan pelarut yang sesuai.
Jangan semprot dengan bahan kimia, sebagai penampak
bercak (gunakan UV atau uap Iod). Sifatnya non-destruktif.

KLT untuk Kuantitatif

Totolkan senyawa pembanding yang diketahui kadarnya
Gunakan pipet kapiler terukur volumenya / microsiringe

Hitung luas zona, atau intensitas dari sampel dan bandingkan

dengan senyawa pembanding
Untuk menghitung intensitas anda bisa gunakan KLT scanner atau
dikerok dan gunakan spektrofotometer

Penggunaan Metode KLT untuk Analisa Obat

Obat (sediaan)
Asetaminofen
Vitamin C

Fase Diam
Silika Gel
Silika gel

Amoksisilin

Silika

Asam folat

Silika

Fase Gerak
Heksan-aseton
(75: 25)
Metanol-asetonair (20 : 40 : 3)
Aseton-toluen-airasam asetat (650:
100: 100: 25)
Etanol-propanolamonium
hidroksida 13,5 M
(1: 1: 1)

Deteksi
UV

UV
Ninhidrin

UV 350 nm

Kasus: Suatu Campuran berisi

Dilakukan KLT dengan fase diam silika (polar) dan fase

gerak heksan. Mana yang akan mempunyai nilai Rf lebih
tinggi??

Jawab

Ikatan hidrogen

Silica gel (polar)

Non-polar

Soal Latihan
Suatu sistem kromatografi lapis tipis telah digunakan.
Dalam sistem ini, tunjukkan urutan elusi komponenkomponen yang terpisah.
Fase gerak : kloroform
Fase diam : silika gel
Senyawa yang dipisahkan :
- Parasetamol
- Fenasetin
- Asetosal

Jelaskan mengapa urutan pemisahan seperti yang Anda

ajukan !

O
HN

CH3

OH

Aspirin (asetosal)

CH3
HN

CH3

OH

p-hidroksi asetanilida
(parasetamol)

Analgetika antipiretika

Sebagai antipiretika/
penurun panas
OC2H5

p-etoksi asetanilida
(fenasetin)

Sebagai antipiretika/
penurun panas