OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL
Determinar a estrutura do biofilme e a biodiversidade dos microrganismos em mucosas de
pacientes com RSC, usando mtodos de imagem, bioqumicos e cultura convencional.
OBJETIVOS ESPECIFCOS
Caracterizar a estrutura do biofilme presente em pacientes acometidos de rinossinusite
crnica;
Determinar os microrganismos presentes no biofilme de pacientes acometidos de
rinossinusite crnica;
Estabelecer uma correlao entre dados demogrficos, hbitos e sintomas dos pacientes
acometidos com rinossinusite crnica e o tipo de biofilme e microrganismo isolados;
Investigar as macromolculas que compe a matriz extracelular (cidos nuclicos, protenas
e polissacardeos) do biofilme formado in vitro por microrganismos isolados de paciente com
rinossinusite crnica;
Avaliar as caractersticas hidrofbicas do biofilme formado in vitro a partir de microrganismos
isolados de paciente com rinossinusite crnica.

METAS A SEREM ALCANADAS

Contribuir para o conhecimento acerca da estrutura e composio biofilme produzido por
microrganismos causadores de RSC;
Estimular o estudo de novas abordagens para o desenvolvimento de condutas teraputicas
para RSC;
Apresentar resultados em dois eventos cientficos anuais, totalizando quatro (04) resumos
apresentados;
Elaborar uma dissertao de mestrado;
Obter artigos tcnicos cientficos para publicao em revista internacional;
Formar mais um mestre na rea de Microbiologia Mdica;

Formao de um estudante de Iniciao Cientifica que ir acompanhar o projeto proposto.

METODOLOGIA
Tipo de estudo
Estudo do tipo prospectivo.
Locais do estudo
Ambulatrio de otorrinolaringologia do Hospital Universitrio Walter Cantdio - Universidade
Federal do Cear.
Laboratrio de Bacteriologia do Departamento de Microbiologia Mdica, Centro de Cincias da
Sade - Universidade Federal do Cear
Comit de tica
O estudo ser submetido ao Comit de tica de Pesquisa em Seres Humanos do Hospital
Universitrio Walter Cantdio UFC (Fortaleza CE) de acordo com a Resoluo 466/12 do
CNS.

METODOLOGIA
Pacientes

Sero selecionados os pacientes de seguimento do ambulatrio de otorrinolaringologia do

Hospital Universitrio Walter Cantdio UFC, que apresentarem diagnstico positivo para
rinossinusite crnica (RSC) e concordem em participar da pesquisa (termo de
consentimento).
No sero includos na pesquisa:

Menores de 18 anos de idade;

Mulheres grvidas;
Imunocomprometidos;
Pacientes com diminuio da funo ciliar;
Pacientes com fibrose cstica;
Pacientes com sndrome de Kartagener;
Pacientes com mucosa inadequada para anlise;
Pacientes em uso de corticosteroide ou antibitico sistmico (trs semanas).

Tambm sero coletados dados demogrficos (sexo, idade, uso de medicamentos, tabagismo,
presena de alergias e presena de asma), alm de achados da endoscopia nasal.

METODOLOGIA
Coleta do material
Pacientes com RSC tero o tecido da mucosa sinusal colhido a partir dos seios etmoidais
durante cirurgia endoscpica.

Fragmento de tecido

Meio Eagle modificado

por Dulbecco
Aspirado sinusal

Meio de transporte

METODOLOGIA
Identificao das culturas bacterianas e fngicas
Aspirado sinusal

Meio de transporte
gar Sangue

gar Chocolate

gar Saboraud

Colorao de Gram

Identificao de bactrias

Catalase, coagulase, DNAse, prova da bile

esculina, fator CAMP, resistncia e sensibilidade a
bacitracina e optoquina, oxidase, Bactray 1, 2 e 3.

Identificao de fungos

Provas de assimilao de carbono e nitrognio,

urase, zimograma e observao do
crescimento macro e microscpico

METODOLOGIA
Ensaio de anlise da cintica dos biofilmes isolados
Tubo 3 da
escala de
MacFarland

Incubao
35C/ 24h

Suspenso
microbiana

Incubao
35C/ 6h

Ajuste da
turbidez

Cultura microbiana
isolada

Caldo BHI
Glicose 1%

9 x 108 UFC/mL

200 L em cada poo

Quantificao
da biomassa
(Cristal violeta)

Quantificao
da biomassa
(Cristal violeta)

Incubao 35C
por 12h, 24h e 48h

Troca total do
meio de cultivo

modificado de SHIELDS et al., (2013)

METODOLOGIA
Ensaio de anlise da cintica dos biofilmes multiespcie
Tubo 3 da
escala de
MacFarland

Incubao
35C/ 24h

Suspenso
microbiana

Incubao
35C/ 6h

Ajuste da
turbidez

Culturas
microbianas
isoladas

Caldo BHI
Glicose 1%

9 x 108 UFC/mL

200 L de cada
suspenso celular

Quantificao
da biomassa
(Cristal violeta)

Quantificao
da biomassa
(Cristal violeta)

Incubao 35C
por 12h, 24h e 48h

Troca total do
meio de cultivo

modificado de SHIELDS et al., (2013)

METODOLOGIA
Anlise do biofilme por MEV
Fragmento de tecido

Fixao com glutaraldedo 2%

- 2h

Observao em microscpio
eletrnico de varredura Quanta
600 FEG

Metalizao

Lavagem 3x
(NaCl, sacarose e gua
destilada)

Secagem ao ponto crtico em

CO2

Ps-fixao em OsO4 a 1% 1h

Desidratao em concentraes
crescentes de lcool etlico
70% - 100%

(BEZERRA et al., 2009)

METODOLOGIA
Ensaio de avaliao da hidrofobicidade da superfcie celular

Biofilme formado aps

diferentes tempos de
cultivo 6, 12, 24 e 48h

Lavagem com PBS

Leitura da turbidez da soluo

aquosa a 660 nm

HI = (OD controle OD teste) x 100/OD controle

OD controle = densidade ptica a 660 nm, antes do tratamento xileno
OD teste = densidade ptica a 660 nm aps tratamento xileno

Leitura da suspenso celular a

660 nm

Repouso 20 min
Temperatura ambiente

Xileno 2,5:1 (v/v)

Agitao por 2 mim

(FELDMAN et al., 2012)

METODOLOGIA
Extrao e anlise de DNA extracelular (eDNA) no biofilme formado
Incubao 1h
Proteinase K

Remoo do biofilme

Agitao (20 seg)

Biofilme formado aps
diferentes tempos de
cultivo 6, 12, 24 e 48h

Centrifugao
16000g/2min

Remoo do meio de cultura e

adio de 200 L de PBS
Coleta do sobrenadante

Coleta da
fase aquosa

Anlise em Nanodrop

Pellet ressuspenso em Tris

(10 mM) - pH de 8,5

Centrifugao
16000g/10min

Precipitao do DNA com

isopropano

Centrifugao
16000g/5min

Extrao com fenol:

clorofrmio: lcool (25:24:1)

(SHIELDS et al., 2013)

METODOLOGIA
Ensaio de quantificao de polissacardeos no biofilme formado

Remoo do biofilme

Agitao (20 seg)

Biofilme formado aps
diferentes tempos de
cultivo 6, 12, 24 e 48h

Centrifugao
16000g/2min

Remoo do meio de cultura e

adio de 200 L de PBS
Coleta do sobrenadante
Precipitao
com etanol

Ressuspenso
com gua
Colorao com azul de toluidina
a 0,1% em cido actico (1%) e
etanol (50%)

Precipitao dos
polissacardeos com cetavlon
(brometo de cetiltrimetilamnia)
0,1% - > 2h

Determinao quantitativa por

densitometria a 525 nm

Eletroforese em gel de
agarose (0,6%)

Protelise com
Prolav 750
(Prozyn)

Sobrenadante liofilizado e
pesado

modificada de NARDER et al., (1984)

METODOLOGIA
Ensaio de quantificao de protenas totais na matriz no biofilme formado

Remoo do biofilme

Centrifugao
16000g/2min
Biofilme formado aps
diferentes tempos de
cultivo 6, 12, 24 e 48h

Remoo do meio de cultura e

adio de 200 L de PBS

Coleta do sobrenadante

1h

Leitura (595 nm)

100 L de cada diluio

+
2 mL de reagente de
Bradford

Liofilizado
ressuspenso em
soluo salina nas
diluies de 1:10,
1:20 e 1:50

Sobrenadante liofilizado e
pesado

(BRADFORD, 1976)

METODOLOGIA
Ensaio de quantificao de lipdeos totais na matriz no biofilme formado

Remoo do biofilme

Amostra sonicada
Biofilme formado aps
diferentes tempos de
cultivo 6, 12, 24 e 48h

Remoo do meio de cultura e

adio de 200 L de gua
destilada

Banho-Maria
100C /10 minutos

Resfrio em gua
corrente
Adio de 5ml de
reagente de cor
(vanilina)

Retirada de 20 L
do sobrenadante

Leitura em espectrofotmetro a 540nm

Centrifugao
1000g/5min

Diluio (3:1) com

soluo de etanol,
clorofrmio (2:1)

Congelamento
-20C

(FOLCH et al., 1957)

METODOLOGIA

Anlises estatstica
Os resultados deste estudo sero analisados utilizando o programa GraphPad Prism
5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Ser realizada estatstica descritiva dos dados
individuais dos pacientes participantes da pesquisa, atravs de medidas de frequncia para as
variveis qualitativas, e medidas de posio e de variabilidade para as variveis quantitativas. A
anlise bivariada (Teste do Qui-Quadrado, Exato de Fisher e Teste de Mann-Whitney) foi
utilizada para comparar as caractersticas do biofilme microbiano associado a RSC com fatores
scio demogrficos dos pacientes (sexo, idade, uso de medicamentos, tabagismo, presena de
alergias e presena de asma), e variveis clnicas relacionadas RSC. A anlise de regresso
logstica ser realizada para avaliar o efeito das variveis independentes. O nvel de
significncia adotado ser de p<0,05.