INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

GENETICA MICROBIANA

FAGOS

5QM1
Equipo 1
Alvarado Hernndez Gladis Susana
Ruiz Madrigal Alejandro Jair

BACTERIOFAGO
Son agentes infecciosos que se

replican intracelularmente de manera

obligada en bacterias,
extracelularmente los fagos son
metablicamente inertes y consisten
en principalmente en protenas mas
cidos nucleicos(DNA o RNA uno solo
no ambos).

DESCUBRIMIENTO DE BACTERIOFAGOS
Codescubridore
s

Frederick Twort (1915)

Ernest Hanbury Hankin (1896)

Felix dHerelle(1917)

COMPOSICION
Cpside proteica (capsomeros)

Un tipo de cido nucleico, ADN

o ARN

ESTRUCTURA
MORFOLOGICA

BACTERIOFAGO
S

VIRULENTOS

Muerte de la
clula husped

TEMPERADOS

Clula husped
permanece
viva

CICLO LTICO

ENSAMBLE DE LAS PARTCULAS

DEL FAGO

CICLO NO LITICO

CICLO LISOGENICO

LISIS DE LA PARED Y MEMBRANA

CELULAR

Unidades Formadoras de
Placa (UFP)
Unidad Infectiva
capaz de
penetrar y
multiplicarse en
una clula
husped hasta
matarla,
formando una

Formacin de Placas

Multiplicidad de infeccin
(MOI)
Se define MOI a el nmero promedio
de fago absorbida por bacteria en
una mezcla bacteria-fago.
Se calcula mediante :
UFC

UFP

MOI

2.24X105

2.24X106

0.10

2.24X107

2.24X106

10.00

3.45X107

3.45X107

1.00

Relacin
1 fago por
10
bacterias
10 fagos
por
bacteria
1 fago por

Curva de crecimiento en un
solo paso

 Periodo latente: Lapso entre la infeccin y la

liberacin de la progenie.
Tamao de estallido: Cantidad de fagos
liberados/clula.
Multiplicidad de infeccin MOI: el nmero
de fagos/clulas en una mezcla bacterias-fagos.
Eficiencia de plaqueo: numero de placas
relativas que un fago puede producir, se
compara generalmente con otra estimacin de
mayor concentracin de fagos conocida
Amplitud de husped: las cepas o especies
que son susceptibles a un fago determinado

Lisis artificial

BACTERIOFAGO T4
Contiene un gran genoma de ADN de doble cadena lineal.
Receptor: lipopolisacrido , una importante protena de membrana

externa.
Contiene HMC
La glicosilacin de HMC protege de las endonucleasas del hospedero.
El DNA es repetitivo en los extremos de las cadenas o redundancia

terminal( concatmeros o repeticiones en tndem) que le permite la

replicacin en circulo rodante.
La endolisina lisa pared celular y Holin membrana celular.

BACTERIOFAGO M13
Filamentoso
Se compone de ADN de cadena sencilla circular de longitud de

6407 nucletidos
Sitio de fijacion: P3
Receptor: pili F (tip), tol AQR en membrana interna.

BACTERIOFAGO M13

BACTERIOFAGO LAMBDA
Contiene un ADN de doble cadena lineal con extremos

cohesivos.
Receptor: transportador de maltosa LamB

BACTERIOFAGO LAMBDA

APLICACIONES
Fagoterapia (D Herelle 1917)
Transduccin generalizada y especifica (J. Lederberg-

Zinder, Lederberg-Lederberg-Morse 1951, 1956

respectivamente)

ARTICULO
Propiedades estructurales y
biolgicas de
Mycoplasmavirus MVL3: Una
interaccin inusual VirusProcarionte.

ANTECEDENTES
Gourlay aisl distintos grupos de
Mycoplasma virus.
Maniloff et al. Aislaron 3 grupos.
Grupo 1 MVL51: virin desnudo en
forma de bala con DNAcs circular
de 1.5x 10^6Da
Grupo 2 MVL2: virin de DNAdc
circular 7.8x10^6Da
Ambos grupos describen un ciclo
no ltico citocida

OBJETIVOS GENERALES:
Determinar las caractersticas
estructurales y biolgicas de MVL3.
Determinar el ciclo infectivo del fago
MVL3 en las clulas husped de
Acholeplasma laidlawii.

Mtodos y materiales:
MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIN
REGULADORA:
Caldo triptosa
Agar de triptosa
Tris-EDTA-NaCl (pH 8.0)
Clulas y virus:
1305K2 Acholeplasma laidlawii
MVL3

ESTUDIOS ESTRUCTURALES
OBJETIVO
Describir la estructura de MVL3 asi como

la forma y peso molecular de su DNA

ESTUDIOS ESTRUCTURALES:
Figura 7. MVL3 teidos
negativamente con
cido fosfotungstico al
2%. Las fotografas
fueron tomadas a
50000X aumentos. Los
viriones tienen una
cabeza polidrica de
aproximadamente 60
nm y una cola corta
de 20 nm conectadas a
la cabeza por un collar.

 Figura 8. Histograma
del DNA de MVL3. El
histograma muestra el
largo de 93 molculas.
A partir de estas
medidas se determino
un peso molecular de
(26 0.6) x

CONCLUSIONES
Las cabezas de virus son polidricas
Los viriones tienen una cola corta adherida a un cuello que

frecuentemente tiene fibras.

Las molculas de DNA del MVL3 son lineales con un peso

molecular estimado de (26 + 0.6) x 106

Adsorcin de virus:
OBJETIVO
Describir la estructura de MVL3 as como
la forma y peso molecular de su DNA

Adsorcin de virus:

Cultivo
bacteriano
1:5
MOI 1

Crecimiento en un solo
paso
Objetivo:

Describir el crecimiento de MV13

despus de la infeccin

Crecimiento en un solo
paso:

10-2

Cultivo
bacteriano
MOI 0.1
37 C / 30
min

Diferentes
tiempos.

10-4

Dilucin
Caldo
triptosa
precalentad
o

 Fig. 1 Crecimiento en un solo paso

de MVL3. En el tiempo cero
clulas y virus fueron mezclados
con una MOI de aproximadamente
de 0.1 e incubados a 37C. El
cultivo fue diluido despus de 30
minutos.
Las muestras fueron
tomadas a diferentes tiempos y
analizadas para PFU. La grafica
semilogartmica muestra el inicio
de la produccin del virus
despus de un
periodo de
latencia de aproximadamente 90
min. La liberacin del virus
continua como funcin lineal
del tiempo.

CONCLUSIONES:
El tiempo de latencia de MVL3 es
de 90min
La liberacin del virus continua
por mas de 5 horas

Produccin de virus por largo

tiempo
Objetivo :
Determinar el periodo de liberacin
de partculas virales

Produccin de virus por largo

tiempo:

MOI
10

Muestras:
c/30
minutos
(1-4
horas)
c/2 horas

Monitorea
r durante
el da.
12 horas
despus

 Figura 2. Crecimiento de MVL3 por tiempo prolongado. Las clulas

fueron infectadas a una MOI de 10. El titulo final de virus es alrededor
de 120 veces mayor que el nmero de unidades infectadas.

CONCLUSIONES:
La liberacin del virus continua
por alrededor de 10 a 15 horas.
La produccin promedio de virus
fue de alrededor de 120.

Lisis artificial
Objetivo :
Determinar la existencia de
partculas virales intracelulares
infecciosas durante el perodo de
latencia.

Lisis artificial
Se diluy 100
veces.
Se tomaron
muestras por
duplicado a
diferentes
tiempos.

MOI
0.1

+ Triton
X-100
0.1%

37 C / 30
min

10-5

10-4

Figura. 3. Lisis artificial. Las

clulas fueron infectadas a
una MOI de 0.1 y 30 min
despus el cultivo fue
diluido 100 veces. Las
muestras duplicadas fueron
tomadas
a
diferentes
tiempos. Una fue sembrada
directamente
para
determinar
clulas
infectadas y virus libres (o).
La otra fue lisada con la
adicin de tritn X-100. Fue
eliminado por dilucin y la
muestra fue sembrada para
determinar
los
virus
intracelulares y virus libres.
()

CONCLUSIONES:
Se encuentran partculas
maduras del virus a partir de los
70 minutos de infeccin.
La maduracin de los virus y la
liberacin es continua en clulas
infectadas

Experimento de
estallido
Objetivo :
Determinar el tamao del
estallido

Experimento de
100 tubos
estallido: Determinaron
UFP 8
horas.

MOI 1
108 en un volumen
de 200mL
37 C / 30
min

100 tubos
Determinaron UFP 24
horas.

Tabla 1. Datos experimentales del estallido simple.

Figura 4. Distribucin de los datos obtenidos en el

experimento de estallido simple. Cada barra vertical
representa un tubo, las barras engrosadas representan
dos tubos, las flechas indican el promedio de ttulo viral
para cada tiempo.

CONCLUSIONES:
Los virus MVL3 se liberan desde
las clulas infectadas sobre un
tiempo extendido por un
mecanismo de liberacin no ltico

Cintica de estallido
Objetivo :
Determinar el tamao del
estallido

Cintica de estallido
20
mL
1 mL
es
filtrado

5
mL
Figura 5.
Ensamblaje de
jeringa- filtro
utilizado para
determinar la

Este filtrado fue

tomado
a
diferentes
tiempos.
4,8, 24 hrs.

Tabla 2. Datos de la
cintica de estallido
simple.

CONCLUSIONES:
Las clulas individuales afectadas
producen virus sobre un perodo
extendido
La liberacin total de virus por
clula infectada vara sobre un
rango de orden de 100 de clula a
clula
El tiempo en el cual las clulas
individuales afectadas comienzan
a liberar virus vara de clula a
clula

VIABILIDAD DE CLULAS INFECTADAS POR

MVL3

Objetivo :
Determinar si la viabilidad de
la clula hospedera tiene
algn efecto sobre la
produccin del virus.

VIABILIDAD DE CLULAS INFECTADAS

POR MVL3:
Se tomaron
muestras a
diferentes
tiempos.
30 min, 1
hora, 9 horas.
K2

MOI
10
37 C/9
horas
UFC

 Figura 6. Viabilidad de clulas

infectadas por MVL3. Una parte

no fue infectada y la otra fue
infectada a una MOI de 10.
Ambas fueron medidas a varios
tiempos de incubacin a 37C

Clulas infectadas
o Clulas no
infectadas

CONCLUSIONES:
Mientras
las
clulas
se
encuentren infectadas ya no son
viables sin embargo los virus de
la progenie son
liberndose
desde estas clulas durante
muchas horas.

CONCLUSIONES:
El DNA de MVL3 es lineal con un peso promedio
de (26 0.6) x106.

La adsorcin de MVL3 es de alta especificidad.

MVL3 posee un ciclo no ltico.
El total de virus liberados varia alrededor
de100 veces de clula a clula.

BIBLIOGRAFIA
Tortora F. 2007. Introduccion a la microbiologia.
9 ed. Medica Panamericana. Buenos aires ,p.p
395-400
Brown .2008. Genomas. 3 ed. Medica
Panamericana. p.p 254-257.
Jenkins.1986. Genetica. 2 ed. Reverte. Espaa ,
pp.476-482
https://learning.uonbi.ac.ke/courses/SZL311/scor
mPackages/path_2/335_bacteriophage_m13_a_le
aky_virus.html
http://genemol.org/biomolespa/fagoslambda/fago-lambda.html

DESARROLLO
EXPERIMENTAL
Aislamiento de
bacterifagos de fuentes
naturales

OBJETIVOS:
Conocer algunos aspectos de la metodologa
empleada en el trabajo con bacterifagos.
Establecer algunas de las propiedades de las
partculas fticas que permiten su
identificacin.
Aislar bacterifagos a partir de muestras de
aguas negras.
Determinar la cantidad y ciclo de vida de los

AISLAMIENTO DE BACTERIFAGOS A PARTIR

DE MUESTRAS DE AGUAS NEGRAS
a. Da 1 Preparacin de cepas indicadoras

E. coli W3110
E. coli AB1157
E. coli JC4046 o TG1
E. coli B 837
B .subtilis SB19
S. typhimurium LT2
K. pneumoniae
S. aureus

37C
5.0 ml
Caldo
L

18 hrs.
Sin agitacin

b. Da 2 Tratamiento de las
muestras
Esterilizar
por
filtrado
5ml.

Muestr
a de
Aguas
Negras
Agitar

Filtrar
10ml.
Aprox.

Conservar en
refrigeracin

c. Da 2 prueba de gota del

filtrado

E. coli W3110
0.1 ml
E. coli AB1157
E. coli JC4046 o TG1
E. coli B 837
B .subtilis SB19
S. typhimurium LT2
K. pneumoniae
3.0 ml agar
S. aureus

Agar L

3 gotas
separadas del
filtrado

Dejar
solidific
ar

37C
18 hrs.

Registrar los
resultados
hasta el tercer
da

fundido
(45)

DA 3

d. Determinacin de la concentracin de bacterifagos

en las muestras de agua
De acuerdo a la prueba de gota, preparar diluciones de los filtrados
de aguas positivas
0.1 ml
dilucin
del filtrado
3.0 ml
agar
fundid
o
(45)

0.1 ml
bacteria
indicado
ra

Agar L

37C
18-24 hrs.
(Cada dilucin
por duplicado)

DA 4
Describir la morfologa de las placas lticas obtenidas
Contar el nmero de placas lticas obtenidas
Calcular el ttulo del fago o fagos presentes en la muestra
DIFERENCIACIN DE FAGOS TEMPERADOS, LTICOS Y NO
LTICOS POR MORFOLOGA DE PLACA

DA 2
Realizar las diluciones indicadas en la tabla con solucion
esteril

Bacterifago

Dilucin

Cepa indicadora

Medio

Agar blando

10-4, 10-5

W3110

Lambda

Agar blando lambda

T4

10-4, 10-5

W3110

Luria

Agar blando

M13

10-4, 10-5

TGI o JC4046

2YT

Agar blando

0.1 ml
dilucin

3.0 ml
agar
blando
(45)

0.1 ml
bacteria
indicado
ra

37C/ 18hrs.
(Cada dilucin
por duplicado)
Medio
rico
solido

Describir la
morfologa de las
placas
Calcular el UFP/ml
de cada lisado
fgico.

DA 3
C. Determinacin de la amplitud de husped de los
bacterifagos T4, y M13

Cortar una punta de

Seleccionar
micropipeta al
tres placas
dimetro de las
lticas aisladas
colonias
y con la
seleccionadas
misma
morfologa
0.1 ml
E. coli W3110
cultivo de
E. coli AB1157
18 hrs.
E. coli JC4046 o TG1
E. coli B 837
B .subtilis SB19
S. typhimurium LT2
K. pneumoniae
S. aureus
Agar
fundido

0.5ml caldo
rico
Coloca
r una
gota
solidifica
r

37C
18-24
hrs.

Registrar los
resultados