Microbiologa Agropecuaria

Microscopa
Msc: Annarella Chea Gonzlez.

Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas

CARRERA DE BIOLOGA. Tercer Ao

Microscopa
Sumario:
1. Generalidades del microscopio.
2. Tipos de microscopios.
3. Partes del microscopio ptico.
4. Pasos a seguir para su uso.
5. Parmetros pticos.
6. Mantenimiento del microscopio
7. Conclusiones.

1.0 Generalidades

El microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones

nfimas, entre ellos la clula, base de la vida.
Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de
formacin de imgenes pticas aumentadas a travs de lentes
convergentes, permiten la observacin de pequeos detalles de
una muestra dada que a simple vista no se percibiran.
Surge en el siglo XVII los microscopios compuestos, utilizados por
el holands Antonie van Leewenhock en el estudio de la microfauna
de los estanques y charcas, unidas a las de Robert Hooke,
establecieron la microscopia como poderosa herramienta cientfica.
Zacharias y Hans Janssen construyeron en los aos 1590's el
primer microscopio registrado.

2.0 Tipos de Microscopios

Optico

Confocal

Electrnico de Transmisin

Electrnico de Barrido

Microscopa de campo prximo

- De barrido efecto tnel
- De fuerzas atmicas

Microscopio

estereoscpico

Tipos de Micoscropio ptico

Campo claro :La muestra se observa ms oscura que el campo que

la rodea.
Campo oscuro: Posee un condensador paraboloide, hace que los
rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que
iluminan oblicuamente la preparacin.

De contraste de fase: Se basa en modificaciones de la trayectoria

de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la
preparacin.

De fluorescencia: La fluorescencia es la propiedad que tienen

algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas
radiaciones energticas, tratar el material biolgico con flurocromos
facilita la observacin al microscopio .

Microscopio de campo claro

La muestra se observa ms
oscura que el campo que lo
rodea.

Microscopio de campo oscuro

La muestra se observa
brillantemente iluminada sobre un
fondo oscuro.

Microscopio de contraste de fases

Se observa una imagen con
diferentes grados de brillo y
oscuridad.
El material denso aparece
brillante, mientras que las
partes de la clula que tienen
una densidad cercana al agua
(citoplasma) aparecen oscuras.
Se utiliza para visualizar
estructuras celulares sin
necesidad de usar colorantes o
matar microorganismos.

Microscopio ptico de fluorescencia

Una molcula que fluorece emite
luz de longitud de onda que se
encuentra dentro del espectro
visible, cuando es expuesta a una
fuente de luz ultravioleta.
Microscopio compuesto
modificado con una fuente de
radiaciones ultravioletas y un filtro.
Se usan colorantes que emiten luz
visible cuando se bombardean con
rayos UV.

Microscopio confocal

Se usa para estudiar la estructura de los materiales

biolgicos.

Emplea un sistema de iluminacin con rayo lser que

es muy convergente y, en consecuencia produce un
punto de barrido muy poco profundo.

Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo

lser a travs del espcimen, iluminando un solo punto
por vez. Se registran los datos de cada punto de la
muestra recorrida con este rayo mvil y se guardan en
una computadora. Luego se puede llevar la imagen a
un monitor de alta resolucin.

Este mtodo tiene la ventaja de que se pueden tomar

imgenes de la muestra en cortes muy finos.
Las regiones fuera de foco se restan de la imagen
mediante un programa para dar una definicin mxima
a la imagen.
Es posible tambin crear imgenes mltiples a
diferentes profundidades dentro del espcimen y
realizar reconstrucciones tridimensionales.

Microscopio Electrnico

En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio

electrnico a base de lentes electrostticas, ese mismo ao Knoll y
Ruska dan a conocer los primeros resultados obtenidos con un
microscopio electrnico Siemens, construido con lentes
magnticas. As nace el microscopio electrnico, en 1936 ya se ha
perfeccionado y se fabrican microscopios electrnicos que superan
en resolucin al microscopio ptico.

Utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta

fundamentalmente de un tubo de rayos catdicos, en el cual debe
mantenerse el vacio.

El Microscopio electrnico consta de:

* Un filamento de tungsteno (ctodo) que emite
electrones.
* Condensador o lente electromagntica, que
concentra el haz de electrones.
* Objetivo o lente electromagntica, que ampla el
cono de proyeccin del haz de luz.
*Ocular o lente electromagntica, que aumenta la
imagen.
*Proyector o lente proyectora. que ampla la imagen.
* Pantalla fluorescente, que recoge la imagen para
hacerla visible al ojo humano.
Aplicaciones
Permiten estudiar la estrutura celular.
La resolucin y el aumento son mayores.
Los virus, y los objetos ms pequeos, como las macromolculas
solamente pueden verse a travs del microscopio elctronico.

Microscopio Electrnico de Transmisin

Utiliza un chorro de
electrones en lugar
de luz visible para
definir el objeto.

Microfotografa electrnica de Transmisin de

paredes celulares.

Requiere que se
aumente el
contraste por
sombreado metlico
utilizando un metal
pesado.

Pasos para la preparacin

1. Fijacin con
de rutina de los
glutaraldehdo.
especimenes en la
2. Lavado con un buffer.
microscopia electrnica
de transmisin
Fijar piezas de tejidos no 3. Fijacin con tetrxido de
osmio.
mayores de 1mm 3

Microscopio electrnico analtico de transmisin de alta

resolucin JEOL-2000 FXII
Permite observaciones de hasta 0,28
nm. de resolucin.
Puede focalizar el haz de electrones
hasta 2 nm. de dimetro y trabaja con
voltajes de aceleracin variables de 20 a
200 kV.
Lleva acoplado un sistema
computerizado de anlisis de energa de
rayos X dispersados eXL-10 de LINK
ANALYTICAL que permite determinar la
composicin qumica de la microregin
sobre la que se focaliza el haz
electrnico.

Aumentos entre 5 000X y 1 000 000X

Microscopio Electrnico de Barrido

Bombardea la superficie del espcimen con un
rayo de electrones.
Produce imgenes con una profundidad
aparentemente tridimensional.
Tcnica verstile para la visualizacin y el anlisis
de las caractersticas microestructurales de
muestras slidas(elevada resolucin es 2nm y
campo de resolucin) .
Tcnica de inters en campos como :Medicina,
Biologa, Ciencias de Materiales, Metalurgia,
Arqueologa, etc.
Microfotografa
electrnica de
Barrido de
paredes
celulares.

Microscopio de fuerzas atmicas

Instrumento mecnico- ptico que detecta fuerzas a nivel atmico
(del orden de los nanoNewton) a travs de la medicin ptica del
movimiento sobre la superficie.
Obtiene imgenes tridimensionales de la superficie de muestras
(Sin preparacin especial de las muestras).
Lleva acoplado un microscopio ptico( permite la visualizacin del
conjunto punta-muestra y poder situar la punta sobre una zona
determinada de la muestra).
Distingue detalles en la superficie de la muestra con una
amplificacin de varios millones( Resolucin de menos de 1nm).
Anlisis de:
Cristales de aminocidos.
ADN y ARN
Cristales moleculares.
Aplicaciones
Complejos Protena Polmeros y biomateriales
cidos nucleicos.
Componentes de las
Cromosomas.
Membranas celulares. membranas de la clula.
Protenas y ppticos

Microscopio de barrido efecto tnel

Forma parte de los instrumentos llamados
'nanoscopios( visualiza objetos del tamao de
nanmetros (10 a la menos nueve metros).
Inventado en 1981 por G. Binning y H. Rhrer,
(IBM, Zurich) (galardonados con el Premio Nobel
de Fsica en 1986 por su invencin).
Dispone de una aguja tan afilada que en su
extremo slo hay un tomo.
La punta se sita sobre el material y se acerca
hasta la distancia de 1 nanmetro (10 a la menos
9 metros).
Una corriente elctrica dbil genera una
diferencia de potencial de 1 voltio. Al recorrer la
superficie de la muestra, la aguja reproduce la
topografa atmica de la muestra.
Imgenes atmicas de molculas de ADN.
Aplicaciones

Mover tomos individuales.

Mapas precisos de superficies de metales o de
semiconductores, cada tomo puede distinguirse
de su vecino.

Microscopio estereoscpico

Visin tridimensional de los

objetos, para observaciones que
requieren pequeos aumentos

3.0 Partes del micoscropio ptico

Partes del microscopio ptico.

SISTEMA MECANICO

Platina
Lugar donde se
deposita la preparacin.

Pe

Base sobre la que se

apoya el microscopio.

Tubo

Forma cilndrica En su
extremidad superior se
colocan los oculares.
(Es ennegracido
internamnete para evitar
los reflejos de luz).
Brazo

Sostiene el tubo en su
porcin superior y por el
extremo inferior se adapta al
pie.

Platina:Presenta un orificio en el eje ptico del tubo que permite el paso de

los rayos luminosos a la preparacin,puede ser fija, en cuyo caso
permanece inmvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir,
mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos
circulares.
Pinza

Escala

SISTEMA MECANICO

Revlver
Pieza giratoria en los
cuales se enroscan los
objetivos. Permite, al

girar, cambiar los

objetivos .

SISTEMA DE Mecnico
Tornillos de enfoque
Freno.

Tornillo
micromtrico
Se logra el
enfoque exacto
y ntido de la
preparacin

Tornillo
macromtrico
Aproxima el
enfoque,permite un
enfoque rpido de la
preparacin.

Partes del microscopio ptico.

SISTEMA PTICO
Oculares:

Los oculares estn

constituidos
generalmente por dos
lentes, dispuestas
sobre un tubo corto .
Objetivos:
Producen aumento de las
imgenes de los objetos y
organismos.

Sistema de
lentes

Partes del microscopio ptico.

SISTEMA PTICO
Sistema de lentes:
Objetivos

Estn colocados
revolver.

en

el

Tienen un sistema
amortiguacin.

Un anillo coloreado indica

los aumentos.

Poseen un aumento de 4x,

10x, 40x y 100x aumentos.

de

Partes del microscopio ptico.

SISTEMA PTICO
Sistema de lentes:
Objetivos
Rojo
4x

Amarillo
10x

Blanco
100x
(Inmersin)

Azul
40x
amortiguacin

Partes del microscopio ptico.

SISTEMA PTICO
Sistema de lentes:
Oculares

Estn colocados en la
parte superior del tubo.

Poseen un aumento
10x, 15x y 20x.

de

Partes del microscopio ptico.

SISTEMA PTICO
Sistema de lentes:
Objetivos
ACEITE DE INMERSIN

Hoy no son de madera de cedro,

sino sintticos.
Los hay de baja, media y alta
viscosidad.
Su empleo es imprescindible con el
objetivo de inmersin (100x).

Partes del microscopio ptico.

SISTEMA PTICO
Sistema de Iluminacin:
Fuente de luz
Dirige los rayos luminosos
hacia el condensador.

Condensador
Lente que concentra los
rayos luminosos sobre la
preparacin.

Diafragma
Regula la cantidad de luz
que entra en el
condensador.

Partes del microscopio ptico.

SISTEMA PTICO
Sistema de Iluminacin:
Fuente de luz
Suele ser una lmpara halgena de
intensidad graduable.
Se enciende
interruptor.

apaga

con

un

En el exterior puede tener un filtro.

graduacin de
la luz

Filtro

lmpara

Interruptor

Partes del microscopio ptico.

SISTEMA PTICO
Sistema de Iluminacin:

diafragma

Condensador
Concentra la luz de la lmpara en
un punto de la preparacin.

Diafragma o iris
Dentro del condensador.
Al cerrarse mejora el contraste,
pero empeora la resolucin.

condensador

4.0 Pasos a seguir para su uso.

1.

Conectar el microscopio a la corriente elctrica.

2.

Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina

completamente.(Si se recogio correctamente ya debe estar en esas condiciones).

3.

Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.

4.

Encender la fuente de luz con la intensidad mnima y se va aumentando poco a poco.

5.

Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10

aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias.

Pasos a seguir para su uso.

6. Para realizar el enfoque:

Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el

tornillo macromtrico( Mirando directamente y no a travs del ocular, se
corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin y daar ambos).

Mirando, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la

preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la
muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino.

7.

Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y

suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el
enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen,
es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin
desde el paso 5.

Pasos a seguir para su uso.

8. Empleo del objetivo de inmersin:

Bajar totalmente la platina.

Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz

que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar
el aceite.

Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio

camino entre ste y el de 40x.

Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz.

Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo
de inmersin.

Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que

la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota
ascendiera y se adosara a la lente.

Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo

entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor
que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

Pasos a seguir para su uso.

Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya

no se puede volver a usar el objetivo.

Finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se

coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. Se puede
retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el
objetivo de inmersin en posicin de observacin.

Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel

especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est
perfectamente limpio.

Apagar el equipo y desconectarlo de la corriente.

5.0 Parmetros pticos.

Aumento

Poder de resolucin

Lmite de resolucin

Nmero de campo

Profundidad de campo

Contraste

5.1 Aumento

Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el

aumento del ocular.

40 x

10 x

400x

5.2 Poder de resolucin

Es la capacidad del instrumento para dar imgenes distintas

de puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto.

Depende de: la long. de onda () y de la apertura numrica

(AN).

0.61

AN
Es la capacidad de reunin de la luz
de objetivo, tambin se encuentra
grabada en la manga del lente.

5.3 Lmite de resolucin

Es la distancia mnima que debe existir entre dos puntos

para que puedan ser discriminados como tales.

El Lmite de Resolucin es la inversa del Poder de Resolucin, de

manera que cuanto mayor sea ste, menor ser el Lmite de
Resolucin.

Lmite de
Resolucin

1
Poder de
Resolucin

5.4 Nmero de campo

Es el dimetro de la imagen observada a travs del ocular,

expresado en milmetros.

5.5 Profundidad de campo

Espesor de la preparacin enfocada en cualquier momento.

5.6 Contraste
Diferencia de absorcin de luz entre el objeto y el medio
Puede aumentarse con las tinciones.

6.0 Mantenimiento del microscopio

1.
2.

El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran daarlo .
( Guardado en estuche, campana y otros).
Las partes mecnicas deben limpiarse con un pao suave.( Humedecer el pao con Xilol si se ha
trabajado con aceite de inmersin).

3.

La limpieza de las partes pticas requiere precauciones especiales.

4.

Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los dedos.
Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado hasta
el tope; el condensador debe estar en su posicin ms baja, para evitar que tropiece con alguno de
los objetivos .
Guardar en lugares secos, para evitar que la humedad favorezca la formacin de hongos.
No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver
y condensador).
El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin
para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el
tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular.
Mantener seca y limpia la platina del microscopio

5.

6.
7.
8.

9.

7.0 Conclusiones
El Microscopio es: un instrumento que se utilizan para obtener una imagen
aumentada de objetos minsculos o detalles muy pequeos de los mismos.
El microscopio simple o lente de aumento es el ms sencillo de todos y consiste
en realidad en una lupa que agranda la imagen del objeto observado.
Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio.
Cada lente hace converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas,
llamada objetivo, se sita cerca del objeto que se quiere estudiar.
La imagen es observada por la segunda lente, llamada ocular, que acta
sencillamente como una lupa.
Zacharias y Hans Janssen construyeron en los aos 1590's el primer
microscopio registrado.
En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrnico a
base de lentes electrostticas.
Los virus, y los objetos ms pequeos, como las macromolculas solamente
pueden verse a travs del microscopio elctronico.