ADI pathway

ADI:Arginine deiminase
OTC: Ornitine transcarbamoyltransferase
CK:Carbamate kinase

ADI pathway

Produzione dellacido piruvico: la glicolisi

I DESTINI DELLACIDO PIRUVICO

1. Transaminazione ad alanina: metabolismo proteico
2. Ingresso in cicli metabolici comuni a glicidi e lipidi
mediante reazione piruvato deidrogenasica, con
formazione di AcetilCoA che entra nel TCA o nella
biosintesi dei lipidi
3. Fermentazioni (in condizioni di anaerobiosi o parziale
anossia negli organismi pluricellulari)

FERMENTAZIONI
FERMENTAZIONE LATTICA

FERMENTAZIONE ALCOLICA

FERMENTAZIONE ALCOLICA

ALCOOL DEIDROGENASI
- E la prima ossidoreduttasi ad essere stata scoperta
ed ha come sigla 1.1.1.1.
-Questo enzima in forma tetramerica nei lieviti, dove
esistono due isoforme:ADH1 ed ADH2.
Nei pluricellulari esiste soltanto lisoforma ADH2 che
un dimero.
-Utilizza lo zinco come cofattore metallico
-Utilizza NAD+ e NADH come coenzimi.

ALCOOL DEIDROGENASI

ADH2

ADH1

Se c abbondanza di NADH la reazione spostata

verso destra.
In condizioni in cui il NADH scarseggia, interviene lisoforma
enzimatica nota come ADH2 che nel lievito un isoenzima
mitocondriale e sposta lequilibrio della reazione verso
sinistra. In questo caso il destino dellacetaldeide di essere
ulteriormente ossidata ad acido acetico, sempre attraverso
una ossidoreduttasi NAD/NADH dipendente, con ulteriore

Laccoppiata ADH2+Ald DH, non serve solo ai lieviti in caso di

scarsit di coenzimi piridinici ridotti, ma anche a proteggere
le cellule in caso di eccessiva produzione di etanolo (tossico).
In particolare i lieviti non Saccharomyces cerevisiae sono
meno alcol tolleranti. Lacetato pu venire convogliato nel
ciclo dellacido gliossilico e andare ad alimentare la
gluconeogenesi.
Nel corso dellevoluzione le specie animali hanno conservato
lisoforma ADH2, enzima (non necessariamente mitocondriale)
ossidativo che serve a proteggere dagli effetti tossici
dellalcol.
Lisoforma ADH1 invece presente soltanto in lieviti e
batteri.

Questi enzimi, oltre alletanolo, riconoscono come substrati

con minore affinit, anche alcoli ramificati, aromatici ed
insaturi:
Alcol isoamilico

Alcol cinnamico

Alcol allilico

Applicazioni della fermentazione alcolica

1. Panificazione
2. Produzione di etanolo:
A. Combustibile, carburante e solventi
B. Vinificazione
C. Birrificazione

1.Panificazione

Questa reazione viene utilizzata nei processi di lievitazione

(pane ,dolci) perch lanidride carbonica (CO2) che si sviluppa
fa rigonfiare la pasta. (amidi:glucosio:piruvato:acetaldeide)

2. Produzione di Etanolo:
A.combustibile,carburante,solvente
Combustibili fossili

CO2

Effetto serra

Neurotossico
Pb

1 mg/die

Inibizione sintesi Hb
Sostituzione Ca++ ossa

Benzine verdi

Aumento del 33%-40% di

HAro e COA
+ Potenza (> Compressione)

Motori a Etanolo

Eccedenze agricole
Riciclo scarti caseari

1. Trasformazione delle materie prime in glucoso:

utilizzo di microrganismi esprimenti amilasi, cellulasi e
disaccaridasi
2. Acidificazione per arrivare al pH ottimale per i lieviti:
utilizzo di Lactobacillus delbrueckii
3. Rimozione etanolo (tossico oltre gli 87 g/l) con solventi
non polari, a catena lunga, insaturi e ramificati
4. Recupero delletanolo per distillazione
Ecologicamente il processo perfetto: si restituisce
allambiente con la decarbossilazione del piruvato la stessa
CO2 che stata catturata lanno precedente dal vegetale
per la sua fotosintesi. (ECCEDENZE AGRICOLE)

Con SCARTI CASEARI si intende il siero di latte, il residuo

che resta dopo la precipitazione delle caseine

Siero di latte

Lattosio
Lattoglobuline
Lattoalbumine
Vitamine
Sali

Il lattosio pu essere recuperato e convertito in etanolo,

utilizzando lieviti del genere Kluyveromyces che possiedono i
geni per permeasi e -galattosidasi.
Il limite di questi lieviti la > sensibilit alletanolo 43-65g/l
Questo problema aggirabile in due modi:
1. Utilizzo di siero di latte intero invece di lattosio, per via
delleffetto protettivo che proteine e lipidi hanno sulla
tossicit delletanolo per le membrane;
2. Utilizzo di ceppi di Saccharomyces cerevisiae
ingegnerizzati con i geni per permeasi e -galattosidasi

Questultima operazione si pu fare anche con i batteri:

Zymomonas mobilis

ADH

Escherichia coli
-galattosidasi
Entrambi i batteri con il gene mancante possono effettuare
fermentazione alcolica da lattosio.
Oltre ad ingegnerizzare i microorganismi, possibile
ingegnerizzare gli enzimi.
LADH uno Zn enzima: sostituendo lo Zn con altri cationi
si pu ottenere un miglioramento della catalisi:
Cu

inadatto simmetria di legame

Fe

inadatto troppo sensibile allox

Co

adatto:

Kcat
range pH

2. Produzione di Etanolo:
B. Bevande alcoliche
Gli aromi variano sia a causa del diverso substrato di
partenza (cereali, canna da zucchero, uva, mele, mirtilli
etc) che contiene substrati diversi (metaboliti di vie
accessorie quali le fermentazioni collaterali) sia a causa
delle condizioni di fermentazione (tempo e temperatura)
che dei microrganismi impiegati (lieviti, funghi autoctoni,
batteri aggiunti per la malolattica)

La VINIFICAZIONE una fermentazione alcolica complessa

su cui influiscono molteplici variabili.

VINIFICAZIONE
Luva viene schiacciata per produrre il mosto, molto acido,
contenente dal 10 al 25% di zucchero (glucoso e fruttoso).
Il mosto sempre bianco, sia che provenga da uve bianche
sia da uve rosse: i vini rossi sono ottenuti dalla
fermentazione in presenza delle bucce (letanolo estrae i
pigmenti dalle bucce).

La fermentazione alcolica avviene in pochi giorni: a volte

necessario raffreddare la miscela di fermentazione per
impedire aumenti di temperatura che possono alterare il
vino o uccidere i lieviti.
I vini nuovi devono poi essere
chiarificati, stabilizzati e
invecchiati.

VINIFICAZIONE
Fermentazione inoculata: Utilizzo di ceppi starter di
Saccharomyces cerevisiae commerciali.
Fermentazione spontanea: fermentazione condotta dai
ceppi di Saccharomyces cerevisiae naturalmente presenti
negli acini.
STARTER: Microrganismi singoli o miscele di pi ceppi
microbici, in grado di guidare i processi fermentativi,
portando a prodotti finiti aventi le caratteristiche
organolettiche desiderate

Classificazione degli starter

Le colture starter possono essere classificate sulla base di diversi criteri:
- complessit della composizione (colture miste, composte da molte specie o ceppi
in miscele indefinite; colture a composizione definita, composte da un numero
limitato di specie o ceppi in rapporti noti e definiti);
- substrato utilizzato per la riproduzione (latte, siero, mosto, etc.);
- riproduzione in condizioni artigianali o presso istituzioni specializzate;
- temperatura ottimale di crescita (mesofile, termofile);
- presenza di ceppi aromatizzanti/funzioni (starter primari, colture aggiuntive o
secondarie, probiotici);
- modo in cui vengono conservate e distribuite (liquide, congelate, liofilizzate,
concentrate).
Nel caso dellindustria enologica:
-Lieviti in pasta
-Lieviti secchi attivi (LSA)

21

Linee guida di selezione

settore enologico

22

Fermentazioni spontanee vs inoculate

FERMENTAZIONE
NATURALE

FERMENTAZIONE
INOCULATA

Complessit organolettica
data dal contributo di
popolazioni autoctone
In grado di rispettare e
contribuire a tratti specifici
artigianali e locali

Facile controllo della

fermentazione
Qualit costante negli anni
Processo che arriva a fine
fermentazione

Difficolt di controllo
Materie prime di ottima
qualit
E necessaria la selezione
della materia prima

Appiattimento dei profili

organolettici
Purezza e rispetto delle
norme di legge per gli starters
Performance

Una possibile soluzione lisolamento e la selezione di

microrganismi autoctoni da utilizzare come colture starter
23

Il processo di selezione
Isolamento
microrganismi selvaggi
Identificazione

Caratterizzazione

Scelta ceppi

Caratterizzazione
fermentativa su scala
laboratorio/pilota

STARTER
24

Fermentazioni addizionali (vini particolari)

Vini spumanti: seconda fermentazione alcolica sotto pressione a spese
di zucchero aggiunto (la CO2 prodotta, carbonata il vino). Si utilizzano
qualit di lieviti che agglutinano facilmente e quindi sono facilmente
rimossi dopo la fermentazione.
Sherry: vini del tipo prodotto a Jerez (Spagna). Arricchiti in alcol fino
al 15% ed esposti allaria in modo che si sviluppi una densa patina
superficiale di certi lieviti che impartiscono al vino il tipico sapore di
sherry.
Vini della zona di Sauternes (Francia): le uve sono naturalmente
infettate da un fungo Botrytis cinerea. Questo causa perdita di acqua
dagli acini (aumenta il contenuto in zuccheri), la distruzione dellacido
malico (ridotta acidit)e altri cambiamenti favorevoli su colore e
sapore. Mosto dolcissimo fermentato da lieviti glucofili (fermentano
il glucoso ma lasciano intatto il fruttosio, pi dolce). Sono vini dolci da
dessert.

Fermentazione malolattica

Tipica dei batteri lattici (LAB):

Pediococcus;
Oenococcus;
Lactobacillus;
Leuconostoc;
Lactococcus

Utilizzata per ridurre lacidit e migliorare laroma dei vini

rossi (in prevalenza)
Pu essere spontanea (LAB naturalmente presenti nei
mosti) o indotta (dopo la fermentazione alcolica) mediante
inoculo di batteri starter (ceppi selezionati di LAB)
COOH
HO

CH2
COOH

CO2

COOH
HO

C
CH3

Fermentazione malolattica

La fermentazione malolattica utilizzata dai

microorganismi responsabili per la produzione di energia
metabolica (Forza Proton Motrice, o PMF) grazie alla
presenza di sistemi di trasporto di membrana
(uniporto/antiporto)
Oenococcus
oeni
(principale
responsabile
della
fermentazione
malolattica nel vino): molto acidofilo
e il pHint solitamente intorno a 5.86.3. A questo pH lacido malico si trova
per lo pi in forma HmalLactococcus lactis meno acidofilo
(pHopt>6).
Lacido
malico

completamente dissociato a Mal2-

BIRRIFICAZIONE

E un processo pi controllabile che prevede diverse

fasi:
1. GERMINAZIONE
Si parte da ORZO (Ordeum sativum) oppure (meno tradizionale) da
ORZO + MAIS o ORZO + RISO.
Le cariossidi vengono fatte germinare al fine di produrre AMILASI
(o DIASTASI) che trasformano AMIDO in MALTOSIO.
Si mettono in H2O (strati di 15 cm) a 20C per circa 10 giorni.
Quando la piumetta raggiunge i 2/3 della cariosside il processo viene
bloccato perch vi il massimo di produzione di amilasi.

2. ESSICCAMENTO
Le cariossidi germinate vengono fatte asciugare con
trattamenti a 35C 45C. A questo punto si
stabilisce se si vogliono ottenere birre chiare o scure

3. TOSTATURA
80C per 10 h
Birre chiare
103C per 36 h
Birre scure
Qui si eliminano le piumette
4. AMMOSTATURA
Lorzo senza piumette e tostato, viene frantumato ma
non macinato troppo fine per evitare intorbidimento del
mosto.
Lorzo frantumato (trebbie) viene messo in H2O sterile
che non deve essere n troppo dura, n troppo acida, in
recipienti di Cu.
4a METODO PER INFUSIONE (Francia, Inghilterra)
Le cariossidi frantumate e tostate vengono messe in
H2O calda tra 35 e 65C. Si ottiene idrolisi amidomaltosio.

4b

METODO PER DECOZIONE (Austria, Belgio, Germania)

Le cariossidi frantumate e tostate vengono messe in H2O fredda che

viene poi riscaldata a 35-45C. Una parte viene prelevata e portata ad
ebollizione in un secondo recipiente e rimessa nel primo contenitore. Pi
volte si ripete, pi il mosto diventa denso.

5. LUPPOLIZZAZIONE
E unusanza relativamente recente: sino al 1600 le birre non erano
luppolizzate e quindi non erano amare.

Si aggiungono infiorescenze femminili di luppolo 200600g/hl per 3 scopi:

A. Chiarificazione e illimpidimento del mosto: i tannini del luppolo

coagulano e fanno precipitare gli albuminoidi, sostanze proteiche
dellorzo
B. Azione antisettica: umulene, lupulene. La birra avendo un pH
finale attorno a 6 meno acida del vino e si pu facilmente
inquinare
C. Azione aromatizzante: gli olii essenziali del luppolo geraniolo e
linanolo danno sapore amaro.

6. COTTURA
Prima della fermentazione il mosto viene cotto a 100C per
uccidere contaminanti ed eliminare definitivamente le amilasi.
7.

FERMENTAZIONE ALCOLICA

La gradazione alcolica viene definita in gradi saccarimetrici

= quantit di zucchero fermentabile presente in 100 ml di
mosto.
In pratica:
1 Alcoolico = 3 saccharium
Birre normali: 11sacch. 4 alc.
Birre speciali: 13sacch. 4,5 alc.
Birre doppio malto: 18sacch. 5-6 alc.
Birre speciali doppio malto: 27sacch. 9% alc.

7a Il mosto dopo cottura a 100C viene raffreddato

diversamente a seconda che si vogliano ottenere:
Birre alte
Max 10 alc

Birre basse
5 alc

10-20C
2- 8C

Il pH neutro e va abbassato per renderlo

favorevole ai lieviti che sono acidofili (pH = 5),
utilizzando lacido tartarico o il Lactobacillus
delbrueckii
7b

In un secondo fermentatore si preparano i lieviti da

inoculare nel mosto: produzione di biomassa in
aerobiosi (respirazione)

Esistono lieviti alti (inoculo minore) e lieviti bassi

(inoculo maggiore)
t = 3gg 7gg
Lieviti alti

T = 20
Fermentazione tumultuosa
t = 15 gg

Lieviti bassi

T = 10
Fermentazione non tumultuosa

8.

MATURAZIONE

Avvengono fermentazioni secondarie:

Bire blanche = F. alcolica + F. lattica
Birre alte inglesi = F.alcolica + F. con produzione eteri
Durante la maturazione si fanno travasi per 2 ragioni:
A. Eliminare i corpi dei lieviti morti autolisi
NH2
B. Aerare per consentire ai lieviti di utilizzare zuccheri
residui,facendo aumentare gradazione e conservabilit.
Durata e temperatura di maturazione
Birre alte

8% alc.

15 gg

7C

Birre basse

4% alc.

5 mesi

2C

9.

PASTEURIZZAZIONE

Dato il pH facilmente inquinabile. Si possono usare

anche zymocine ossia lieviti killer che possiedono nel loro
citoplasma, uno speciale RNA detto RNA killer.
Si tratta di RNA virale che permette al lievito di
produrre una tossina ad azione antibiotica verso altre
specie di lieviti (non la propria). Questo RNA un
mycovirus latente che effettua nel lievito una funzione
analoga alla connessione fagica (tossina eritrogenica dello
streptococco
scarlattina. No fago no scarlattina).
La tossina buca la parete dei lieviti contaminanti
facendo perdere ioni, macromolecole, ATP
morte.
Si aggiunge infine acido ascorbico 0,003% come antiossidante