54 Tcnicas de Biologa Molecular

2 parte de tres

Libro
Fundamentos y Tcnicas de Anlisis
Hematolgicos y Citolgicos
Ed. Paraninfo: Pg. 473

IES Miguel de Cervantes. Murcia

Ciclo Laboratorio de Diagnstico Clnico
Fundamentos y Tcnicas de Anlisis Hematolgicos

Jos ngel Pina Alburquerque

Amplificacin de cidos nucleicos in vitro.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

PCR:
Polymerase Chain Reaction.
Tcnica de biologa
molecular desarrollada
en 1985 por Kary Mullis.
Su objetivo es obtener in
vitro un gran nmero de
copias (millones) de un
fragmento de ADN concreto,
partiendo de una muestra
mnima (ADN molde).

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

En 1993, Mullis gan el premio Nobel de Qumica por su trabajo sobre la PCR.
http://www.dnalc.org/view/15138-Naming-PCR.html
http://www.dnalc.org/view/15139-Finding-DNA-to-copy-Kary-Mullis.html

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Utilidad: Tras la amplificacin (y a
veces en combinacin con tcnicas
de secuenciacin) se utiliza para:
Identificar virus o bacterias
patgenos.
Identificar enfermedades genti
cas.
Medicina forense (Identificar
personas o cadveres).
Pruebas de paternidad
Investigacin cientfica.

Recuerda:
Replicacin del ADN
En sentido 5' 3'
Hebra adelantada (leading strand )
Hebra retrasada (lagging strand ) y
formacin de los fragmentos de
OkazaKi ( 2 Kb)
http://es.wikipedia.org/wiki/Sintesis_de_ADN
http://www.youtube.com/watch?v=-EGKrYd
QEHQ

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PCR: Reactivos
ADN molde (diana o
template):
Desoxinucletidos
(dNTP).
Oligonucletidos
(Cebadores o primers).
ADN Polimerasa.
Tampn: Con MgCl2 y
pH 8,4.

PCR: Reactivos
ADN molde
(diana):
DNA bicatenario:
Se necesita su
extraccin previa a
partir de la
muestra biolgica.

PCR: Reactivos
Desoxinucletidos (dNTP):
dATP, dTTP, dCTP, dGTP

PCR: Reactivos
Oligonucletidos (cebadores o primers):
Son cadenas breves de nucletidos (20 - 30) capaces de
reconocer una secuencia complementaria del ADN diana
y unirse ella por hibridacin.
Se necesitan dos cebadores por PCR: Uno para cada
cadena del ADN.
Delimitan los extremos del fragmento a replicar.
Tienen una Tm (Melting Temperature) caracterstica.

Tm es la temperatura a la
que la mitad de las
cadenas de ADN estn en
forma de doble cadena y
la otra mitad como simple
cadena.

PCR: Reactivos
Oligonucletidos (cebadores o primers):

PCR: Reactivos

ADN Polimerasa

Enzima que elonga un cebador (primer) fijado en el

extremo 3 de una cadena molde ADN.
Aade desoxinucletidos al extremo 3 del cebador y en
direccin 5 del ADN molde.
(DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi

5
3
5
3

3
5
3
5

PCR: Reactivos

ADN Polimerasa

Se utilizan ADN polimerasas termoestables, extradas de

microorganismos adaptados a vivir a altas temperaturas.
Thermus aquaticus (Taq
polimerasa)
Pyrococcus furiosus (Pfu)
Thermococcus litoralis
(Vent)
Thermus termophilus (Tth)
A veces se emplean mezclas de polimerasas rpidas (Taq)
con otras capaces de hacer correccin de errores (Pfu, Vent).

PCR
La reaccin es muy
sencilla:
Necesita cantidades de
ADN muy pequeas como
diana.
Un tubo de ensayo (tubo
eppendorf)
Los reactivos mencionados
(dNTPs, polimerasa)
Pequeas cadena de
nucletidos que actan
como cebadores
(primers).

Una fuente de calor:

El termociclador

Proceso de la PCR:
Consiste en una serie de cambios de temperatura

La molcula de ADN que va a copiarse se calienta a 94C para que

se desnaturalice y se separen las dos hebras.
Despus se someten a cambios de temperatura que se repiten 25 40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee un mnimo de
tres etapas:
1. DESNATURALIZACIN A 94C: Permite la separacin de las
dos cadenas de cidos nucleicos formados en el ciclo anterior.
2. ALINEAMIENTO (annealing) A 50-60 C: Permite la
hibridacin de los cebadores al ADN molde (la temperatura
depende de la Tm de los oligos).
3. POLIMERIZACIN A 68 - 72 C : La Taq-polimerasa trabaja a
72C, con una velocidad de 1000 bases por minuto).
Vuelve al punto 1 (unos 25 a 40 ciclos).

Tras una polimerizacin final, el ADN formado se mantiene en fro

(4C)

Ejemplo de programa de PCR

PCR

http://www.dnalc.org/view/15924-Making-many-copies-of-DNA.html

http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-chain-reaction-PCR3D-animation-with-no-audio.html

Deteccin del ADN amplificado (amplicones)

Electroforesis en gel:
Gel de agarosa
Gel de poliacrilamida

Hibridacin con sondas.

Secuenciacin.

PCR cuantitativa
(o PCR en tiempo real)
qPCR, Q-PCR (quantitative
polymerase chain reaction)
o PCR en tiempo real
(real time PCR)
Variante de la PCR
utilizada para amplificar y
simultneamente
cuantificar de forma
absoluta el ADN en el
mismo vial cerrado, sin
necesidad de ninguna
accin posterior.
Ver en: http://external.elsevier.es/espacioformacion/eimc/temas/m2t12.pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1360278/pdf/0060-04.pdf

PCR cuantitativa
(o PCR en tiempo real)
Se incorporan fluorocromos:
La emisin de fluorescencia
producida en la reaccin es
proporcional a la cantidad de
ADN formado.

Se usa un termociclador con

sensores:
Miden la fluorescencia
despus de cada ciclo de
amplificacin, tras excitar el
fluorocromo a la longitud de
onda apropiada.

Dos tipos de fluorocromos:

Ciclo umbral (Ct, de threshold cycle):
Ciclo en el que se empieza a detectar un
aumento de fluorescencia significativo
respecto a la seal base.

Agentes intercalantes.
Sondas especficas marcadas
con fluorocromos.

Una variante de la PCR:

PCR tras transcripcin inversa (RT-PCR)

RT-PCR: Reverse
Transcriptase PCR
Una hebra de ARN es
retrotranscrita en cADN
usando una transcriptasa
inversa, y el resultado, se
amplifica en una PCR
tradicional.
(RT-PCR no debe ser
confundido con la PCR en
tiempo real)
Tambin existe RT-PCR cuantitativa (RT-PCR en
tiempo real o RT-Q-PCR): Permite cuantificar carga viral
en virus ARN.

PCR Multiplex
PCR en la cual se
amplifica ms de una
secuencia en una
misma reaccin.
Emplea dos o ms
pares de cebadores en
nico tubo con el fin de
amplificar al mismo
tiempo mltiples
segmentos de ADN
Permite detectar
microsatlites y SNPs

Tcnicas de Biologa Molecular

Fin de la 2 parte de tres
Contina en:
Tcnicas de Biologa Molecular:
3 parte de tres