Eukaryotic DNA

replication origins:
many choices for
appropriate answers

Abstract
En cada divisin celular en
humanos, 30.000-50.000
orgenes de replicacin son
activados, y sigue sin estar
claro como ellos son
seleccionados y reconocidos
por factores de replicacin.
Los organismos
multicelulares requieren
mecanismos de replicacin
mas complejo que los
unicelulares.

Abstract
Hay distintos factores epigeneticos que influyen en la
expresin de estos.
La similitud de los mecanismos de replicacin entre las
bacterias y organismos complejos es aun debatido.
Los organismos multicelulares requieren mecanismos de
replicacin mas complejos para adaptarse a un genoma
amplio.
Un ejemplo de esto son las diferencias entre la replicacin
del DNA entre la Escherichia Coli y el genoma Humano.

Ensamblaje del complejo de

replicacin
El proceso de fijacin consta de tres pasos:
1) Reconocimiento de orgenes
2) Ensamblaje de un pre-RC durante la fase G1
3) Activacin del pre-RC
)Este procesos es controlado por diversas protenas.
)El principal factor de unin es el ORC.

Complejo pre-replicacin
(preRC)

MCM 27

AR
S

ORC

CDT1

CDC6

Ensamblaje del complejo de

replicacin
Una secuencia de replicacin autnoma (ARS) contiene el
origen de replicacin en el levadura genoma.
S. cerevisiae y D. melanogaster presentan similitudes entre
ORC y la DnaA de la E. coli.
ORC y DnaA son de la familia AAA+.
Los dems factores de replicacin dependen de ORC para sus
uniones en los orgenes de replicacin
No esta claro el como los orgenes de replicacin son
seleccionados en organismos eucariticos multicelulares

Ensamblaje del complejo de

replicacin
Se reconoce en S. cerevisiae una secuencia conceso formada por 12 pb
(ACS).
En metazoos y S.pombe no se ha encontrado una secuencia consenso,
sin embargo los orgenes de replicacin suelen presentar una riqueza en
AT.
Complejo de reconocimiento del origen (ORC): Complejo proteico
hexamerico (ORC 1-6)
ORC1: En metazoos es la principal unidad de seleccin del origen
ORC2: En S. cerevisiae posee un dominio AT-Hook putativo.
ORC4: En S. pombe posee un dominio AT-Hook

Caractersticas de los orgenes

de replicacin del DNA
Orgenes en el genoma de la
levadura
De los 12.000 sitios ACS en genoma de S.
cerevisiae slo 400 son funcionales.
S. cerevisiae confirmaron que el elemento ACS
era esencial.
La especificidad de secuencia es esencial, pero
no es el nico determinante de la seleccin
del origen , incluyendo la transcripcin y/o el
estatus de la cromatina

Caractersticas de los orgenes

de replicacin del DNA
En S. pombe, elementos ARS que permiten la
replicacin autnoma , no comparten una
secuencia consenso como en S. cerevisiae.
Los orgenes son caracterizados por islas ricas
en AT, pueden reemplazar regiones importantes
de elementos ARS en S. pombe
Su principal caracterstica es la presencia de
islas ricas en AT que pueden ser blanco de la
subunidad Orc4 de S. pombe, la cual contiene
un dominio AT-hook no encontrado en protenas
ORC de otras especies

Caractersticas de los orgenes

de replicacin del DNA
Orgenes de Metazoos
En organismos multicelulares, ensayos sobre la actividad de
ARS fueron infructuosos y fue difcil identificar
caractersticas comunes de los orgenes de replicacin.
Adems, solo una pequea fraccin de preRCs
ensamblado es activada en cada ciclo celular, y, por lo
tanto, se espera que los sitios de unin ORC superen en nmero
a los sitios activos de iniciacin.
Datos recientes en D. melanogaster muestran que slo el
30% de los sitios de unin ORC estn asociados con orgenes de
replicacin temprana

Caractersticas de los orgenes

de replicacin del DNA
Dos-tercios de los sitios de unin ORC
estn en regiones promotoras, y no
existe una especificidad de secuencia clara,
pero si fueron encontrados con
localizacin preferencial en cromatina
abierta y sitios cargamento de cohesina.
En los huevos de Xenopus laevis La
iniciacin ocurre en cualquier sitio, con
cierta preferencia por las secuencias
ricas en AT, pero esto no aumenta la
eficiencia total de la replicacin.

Caractersticas de los orgenes

de replicacin del DNA
Embriones prematuros en X. laevis y D.
melanogaster. Durante su desarrollo
temprano, la transcripcin est
apagada y los orgenes de replicacin
estn fijados al azar en cortos intervalos
regulares. Una transicin desde el azar
a replicacin del ADN sitio-especfica
ocurre cuando la transcripcin
comienza ms tarde en el desarrollo,
y, en clulas somticas, los orgenes
estn localizados en sitios especficos en
los cromosomas, aunque ninguna
secuencia consenso es discernible.

Caractersticas de los orgenes

de replicacin del DNA
CpG pueden ser una seal de orgenes
de replicacin o de promotores
asociados a transcripcin, aunque
algunos orgenes de replicacin conocidos
no tienen estrictamente islas CpG, tales
como esas en el loci de -globina y
dihidrofolato reductasa (DHFR)
La metilacin de la isla CpG regulara
la sincronizacin de replicacin de
manera que orgenes en islas CpG no
metiladas se replicaran ms temprano que
los que se encuentren en islas CpG
metiladas.

Caractersticas de los orgenes

de replicacin del DNA
En conclusin, las islas CpG y las
extensiones ricas en AT parecen
caracterizar los orgenes de
replicacin del DNA de metazoos,
pero ninguna secuencia consenso ha sido
revelada an.
Una razn podra ser que los
orgenes de los metazoos son
modulares y son identificados y
regulados por combinaciones definidas
de elementos de secuencia, similarmente
a promotores de transcripcin

Caractersticas de los orgenes

de replicacin del DNA
Es posible por lo tanto que los metazoos tengan diferentes clases
de orgenes de replicacin que usan diferentes mdulos
reconocidos por diferentes subconjuntos de protenas.
Genomas eucariotas superiores estn empaquetados en
cromosomas que contienen regiones de secuencias no codificadas
ms largas que los genomas de levadura. Las regiones
heterocromticas pueden tambin requerir factores
especficos para ser reconocidas y abiertas. Por tanto, una
secuencia consenso universal de origen puede no ser compatible
con la estructura del genoma y la plasticidad de expresin de
organismos multicelulares.

Orgenes de replicacin: Una

opcin mltiple
Clases diferentes de orgenes
Durante la fase G1 del ciclo celular, helicasas MCM inactivas son cargadas
en los preRC. La activacin de preRC es regulada en dos niveles.
Primero, los orgenes zona activados en diferentes momentos a lo largo
de la fase S y son clasificados como orgenes activados temprano,
medio o tarde.
Segundo, solo una fraccin de los orgenes potenciales es usada en
cada ciclo celular, mientras que otros son despertados y usados slo en
condiciones que afectan la fase S, tales como dao de DNA o cambios
en las condiciones de crecimiento.

Orgenes de replicacin: Una

opcin mltiple
Segn su uso, los orgenes de replicacin del DNA pueden caer en tres
clases: flexible, durmiente (o inactivo) y constitutivo
Los orgenes constitutivos, los cuales son una minora de los
orgenes eucariotas, son usados todo el tiempo en cualquier ciclo
celular o tipo de clula.
Los orgenes flexibles son orgenes potenciales que pueden ser
usados estocsticamente en diferentes clulas y explican el bajo uso
de origen visto en clulas eucariotas.
Si algunos orgenes son eliminados, otros cercanos comienzan a
hacerse ms activos o ms eficientes, reflejando una amplia
seleccin de orgenes.

Orgenes de replicacin: Una

opcin mltiple
La flexibilidad puede perderse de
dos maneras.
Primera, aumentando el uso del
origen en casos de condiciones de
crecimiento precarias o dao en el
DNA.
Segunda, disminuyendo el surtido
de orgenes en dominios
especficos en clulas
comprometidas en programas
especficos de diferenciacin

Orgenes de replicacin: Una

opcin mltiple
Los orgenes inactivos o durmientes son orgenes
potenciales que nunca son usados en el ciclo celular en
condiciones normales, pero que pueden ser despertados en
programas celulares especficos o en condiciones de estrs.
Anlisis en cromatina mostraron que 70-90% de los orgenes
activos fueron los mismos durante dos ciclos celulares
consecutivos, sugiriendo que hay una memoria para la
seleccin de orgenes en una clula dada

Orgenes de replicacin: Una

opcin mltiple
Por qu hay tantos orgenes potenciales de replicacin?
Primero, los orgenes flexibles pueden ser orgenes abortivos que
en la activacin fallaron al alargarse.
Segundo, la eficiencia del encendimiento del origen de replicacin
del DNA puede ser regulada por un factor limitante, o factores, que
no est presente en una cantidad suficiente para ser reclutado a
todos los orgenes.
Tercero, varios orgenes potenciales pueden proveen una opcin
para activar el origen ms conveniente en un contexto de cromatina
dada, el cual puede variar en diferentes clulas o tejidos.

Orgenes de replicacin: Una

opcin mltiple
Un enlace con el ciclo celular y sus puntos de
control
Una serie de elegantes experimentos mostraron que durante G1 hay
un punto especfico el punto de la decisin del origen (ODP) en el
cual son seleccionados los orgenes de replicacincon el ciclo celular y
sus puntos de control.
La seleccin del origen parece ser relativamente independiente
de la sincronizacin de replicacin, la cual es definida en el ciclo
celular antes de la seleccin del origen. Adems, la sincronizacin de
replicacin parece ser determinada a nivel de clusters de orgenes o ms
an dominios de replicacin ms largos en vez de orgenes individuales.

Orgenes de replicacin: Una

opcin mltiple
Los orgenes inactivos podran ser orgenes de repuesto que rescatan la rplica cuando la
progresin de la horquilla es perturbada durante el estrs de la replicacin.
Generalmente, los inhibidores de dao al DNA o sntesis de DNA activan el punto de control
de la fase S, el cual previene el encendimiento de orgenes tardos, permitiendo reparar el
DNA antes de que la fase S contine progresando. En condiciones de reducida concentracin
de precursor de nucletido, orgenes tardos son inhibidos por la accin del punto de control,
mientras que los orgenes durmientes son activados. Similarmente, una ruptura de la doble
hebra de DNA realza el uso de orgenes proximales a la ruptura.
Por lo tanto, la respuesta del punto de control a condiciones precarias de crecimiento
previene la progresin de la fase S, pero tambin podra incrementar el uso de orgenes
flexibles o activar orgenes durmientes para rescatar dominios mal replicados.
Esto sugiere que el exceso de orgenes potenciales en G1 representa un salvavidas eficiente
en contra de problemas posibles en la fase S. Los orgenes de repuesto deben ser puestos
en stand-by antes de la fase S porque durante la fase S, la formacin de nuevos preRC (por
reaccin licensing) no es posible en orden para evitar estrictamente la re-replicacin.

Orgenes de replicacin: Una

opcin mltiple
Los ATR se activan por el estancamiento de la horquilla de
replicacin, y otras dos kinasas checkpoint CHK1 (o CHEK1)
and CHK2 (o CHEK2) son blancos que estn involucrados en la
inhibicin del origen tardo de la replicacin. El estrs replicativo
activa los ATR, causando la fosforilacin de CHK1, la inhibicin
del origen tardo de la replicacin y la estabilizacin de
bifurcaciones de replicacin estancadas.

Orgenes de replicacin: Una

opcin mltiple
El movimiento de las horquillas de replicacin tambin puede ser
obstaculizado por constricciones fisiolgicas del genoma.
Primero, algunas secuencias de ADN pueden ser ms difciles de duplicar
que otras.
Segundo, factores asociados a cromatina, elementos aislantes y estructuras
nucleares especficas pueden enlentecer u obstaculizar una horquilla de
replicacin sin estrs replicativo.
De hecho, en X.laevis, el tratamiento con cafena, un inhibidor del
checkpoint ATM y ATR, ralentiza las bifurcaciones de replicacin y aumenta
el nmero de orgenes. Similarmente, en clulas empobrecidas de CHK1, la
velocidad de las horquillas de replicacin est disminuida y ms orgenes
son activados.

Orgenes de replicacin: Una

opcin mltiple
Por qu se inhiben los orgenes tardos y por qu el uso de orgenes tempranos
aumenta luego del estrs replicativo?
El primero es un camino general ATR-dependiente que inhibe el comienzo tardo y
limita el uso de orgenes en clusters de orgenes tempranos, y la actividad del cual
est aumentada por dao en el ADN.
El segundo camino es especialmente inducido durante el estrs replicativo y anula la
inhibicin por ATR de orgenes inactivos. Entonces, cuando los ATR son inhibidos por cafena,
tanto los orgenes tardos como los inactivos son activados. Cuando los niveles de ATR
aumentan por estrs replicativo, se suprimen los orgenes tardos, mientras que el uso de
orgenes tempranos aumenta al anular el efecto inhibitorio de los ATR en orgenes
tempranos.
Tambin es posible que en algunas regiones, participe un mecanismo pasivo, en que al
ralentizar una bifurcacin de replicacin se da tiempo para que un origen potencial se active
antes de que la bifurcacin pase a travs de ste.

Caractersticas epigenticas y
organizacin nuclear
Dentro de los variados factores
que regulan la seleccin del
origen de replicacin es posible
distinguir dos primordiales:
1) Estructura local de la
cromatina
2) Epigentica

Regulacin por la Estructura de

la cromatina
Para que un origen de replicacin sea eficiente la cromatina
debe estar relativamente abierta.
Sin embargo en S. cerevisiae se ha observado que la presencia
de un solo nucleosoma en la secuencia ACS bloquea su
respectivo origen.
Las secuencias de origen son suficientes para mantener un
origen libre de nucleosoma; sin embargo, ORC se requiere para
la colocacin precisa de los nucleosomas que flanquean el
origen.22
As el ordenamiento de la cromatina parece crucial para la
seleccin y funcin de los origenes

Regulacin por la Estructura de

la cromatina
Estudio en S.
cerevisiae: mostro que
hay relacin Entre
cromatina abierta y
orgenes mas activos.
Acetilaciones (HATs):
Asociado a aumento de
Replicacin
Acetilaciones en H3 y H4
realza la sntesis de DNA
en plsmidos

Regulacin por la Estructura de

la cromatina
Descubrimiento inesperado: relacin ORC-heterocromatina
Se observ que en S. cerevisiae y en Eucariontes ORC interactua con elementos
silenciadores Sir(1 y 3) y HP1 respectivamente involucrndose procesos de
silenciamiento independiente de su rol en la replicacin.
Tres posibles explicaciones
1. HP1 acta junto a ORC para favorecer el ensamblaje de preRC a la
heterocromatina.
2. Que HP1 participe en el ensamblaje de preRC tanto en Hetero como en
Eucromatina.
3. En S. pombe, Swi6 (homologo de HP1) activa orgenes de replicacin en
heterocromatina al permitir el ensamblaje de Sld3. (Recluta Kinasa DDK y
Cdc7).

Organizacin de los orgenes de

replicacin en el ncleo
La replicacin toma lugar en
estructuras discretas, formadas por
hasta 1000 focos de replicacin por
ncleo
10-100 replicones por foco Dominio
de replicacin
Los focos de replicacin forman loops
(bucles) de cromatina que estn
anclados a una estructura matriz.
Se postula que los replicones de cada
foco son activados
sincronizadamente.

Distribution of BLM induced-H2AX foci revealed by immunolabelling (Cy3; red) in early (top) or late (bottom) Sphase CHO9 nuclei. Replicating patterns were obtained by EdU incorporation and chemical detection (azideAlexa Fluor 488; green). Nuclei were counterstained with DAPI (blue). Early S (a-c) and late S replicating nuclei
are shown. Panels (a, d) and (d, e) contain DAPI/H2AX/EdU and H2AX/EdU merged images, respectively. Panels
(c) and (f) illustrate binary masks of red (H2AX) and green (EdU) channels overlaying the respective DAPI image

Organizacin de los orgenes de

replicacin en el ncleo
Estudios en X. laevis sugieren que los preRC ya estn ensamblados
en focos nucleares realizados antes de que inicie la sntesis de DNA
(Replication Protein A detected before S phase initiation).
Propuesta cuestionada por falta de una tctina que detecte al preRC
antes del inicio de la sntesis de DNA.
Cohesina Estudios apuntan nuevas funciones de ORC, el cual
recluta cohesina para dar estructura al cromosoma en la fase S y la
fusin entre cromtidas hermanas.
El mecanismo de seleccin de clusters de replicacin es
independiente del mecanismo para seleccionar orgenes individuales?

Organizacin de los orgenes de

replicacin en el ncleo
Mecanismos de interferencia de
origen puede inhibir la activacin
de orgenes adyacentes.
Este mecanismo escoge un
origen flexible, sin embargo no a
clusters ni dominios ya que no
son flexibles. Pero elementos de
control ubicados distantes al
cluster o en el dominio podran
controlar la activacin de un
cluster completo.

Organizacin de los orgenes de

replicacin en el ncleo
Mecanismo
Checkpoint:
es capaz de
activar
orgenes de
replicacin
inhibidos en
caso de algn
tipo de falla
en el proceso.

Organizacin de los orgenes de

replicacin en el ncleo
Dominios de replicacin
200kb 2 megabases en mamferos (ms cortos en D. melanogaster
y S. pombe)
No presentan una distribucin global uniforme entre cromosomas.
Sin embargo los dominios tempranos y tardos estn intercalados.
Dominios tempranos: ricos en orgenes
Dominios tardos: pobres en orgenes
Estudios sugieren que la localizacin de estos dominios en el ncleo
puede guardar relacin con la sincronizacin de su replicacin.

Regulacin por RNAs no

codificantes
RNAs Y: ha sido propuesto a estar implicado en el inicio de la
replicacin en vertebrados, aunque hasta el momento no se ha
detectado ninguna interaccin con protenas de replicacin.
Unin ORC-ARN 26S en T. thermophilaamplificacin del DNA.
Virus Epstein-Barr: requiere una interaccin RNAdependiente con un antgeno nuclear especifico (EBNA1) para
lograr reclutar a ORC para la replicacin del origen.
Sin embargo no existe evidencia suficiente para determinar su
funcin como reguladores.

Transcripcin y orgenes de la
replicacin del DNA
El tipo de regulacin depende de la interaccin que se lleve a cabo entre la
transcripcin y la replicacin de un gen dado.
En genomas virales se ha visto que la protena de inicio de replicacin puede
activar tanto la transcripcin como la replicacin.

Seleccin de origen de replicacin en metazoos

Primero: Orgenes de replicacin activos tempranamente asociados a genes
transcritos activamente y Orgenes tardos asociados a regiones no
transcritas.
Segundo: La transcripcin en un gen silencia los orgenes de replicacin
dentro del gen o reduce la zona de iniciacin. Si la transcripcin ocurre cuando
el origen del gen se activa puede resultar afectado.

Transcripcin y orgenes de la
replicacin del DNA
Tercero: La presencia de un promotor de transcripcin puede
ayudar a la seleccin de un origen activo. Ya que:
1. En la regin promotora la cromatina es asequible.
2. Existe una relacin entre protenas de iniciacin de la
replicacin y factores de transcripcin.
Relacin entre
replicacin y
transcripcin en
D.M

Factor de
replicacin

Factor de
transcripci
n

Inconsistencia

D. Melanogaster

ORC

RNA pol II

No hay relacin entre

preRC y factores de
transcripcin.

D. Melanogaster

Elementos de
control de
amplificacin del

MYB, E2F1 y
RB

Relaciones tales no hay

descritas para orgenes
estndar.

Desarrollo, transcripcin y
orgenes de replicacin
Las aun discutidas relaciones establecidas entre replicacin y
transcripcin puede revelar un vnculo de influencia en la
diferenciacin e identidad celular.
Embriones de X. leavis y D. melanogaster se encontr que:
1.
2.

Transcripcin apagadaactivacin de orgenes a intervalos

ms cercanos (10-20kb)/ Embriones de desarrollo temprano
Transcripcin activaactivacin de orgenes sitio-especficos (a
intervalos mayores)/ Embriones de desarrollo tardo

Vnculo entre bucles de cromatina y tamao del replicn

Desarrollo, transcripcin y
orgenes de replicacin
Anlisis en clulas madres humanas y clulas germinales en
desarrollo de ratn evidencian que el vnculo replicacin-desarrollo
est ms establecido a nivel de sincronizacin de la replicacin.
Se observaron cambios en la sincronizacin de replicacin durante
la diferenciacin celular.

Relacin entre
replicacin y
diferenciacin
celular

Factor

Funcin en
replicacin

Funcin en desarrollo (o
diferenciacin)

D. Melanogaster

Proteina
Latheo
Geminin
(GMNN)

Interaccin con
ORC
Desactivacin del
preRC

Diferenciacin neural
Diferenciacin neural relacionada
con el control transcripcional de
genes Hox y de la remodelacin
de la cromatina.

A. thaliana

Gem

Interacta con
CDT1

Involucrada en patrn de
epidermis de la raz

Perspectivas
Solo una porcin de los orgenes de replicacin participan en cada ciclo celular y su uso
es altamente flexible.
Dicha flexibilidad posiblemente se trata de un mecanismo de adaptacin a condiciones
ambientales, a errores en la maquinaria de replicacin, condiciones de crecimiento, etc.
Los orgenes son probablemente multi-modulares y su uso podra depender de la
combinacin de mdulos y de la concentracin y afinidad de las protenas que los unen.
Esto explicara la dificultad para hallar un patrn comn a los orgenes de replicacin.
La flexibilidad no es totalmente azarosa, ms bien responde a un conjunto de
condiciones de activacin e inhibicin de orgenes de replicacin.
Procesos checkpoint, mecanismos de transcripcin, ARNs no codificantes, entre otros,
podran participar en la regulacin de orgenes sin embargo son insuficientes para
establecer o predecir exactamente los mecanismos regulatorios especficos.

Perspectivas
El uso flexible de orgenes en clulas somticas y el uso extremo de orgenes en embriones
transcripcionalmente inactivos, sugiere fuertemente que no se requiere un posicionamiento
estricto de los orgenes en el genoma de metazoos para una sntesis regulada.
La presencia de promotores de la transcripcin no parece ser un determinante general para los
orgenes, y viceversa, mas bien especfico. Posiblemente una estructura cromosomal diferente
regule a ambos.
Las caractersticas de la cromatina siguiere no ser concluyente para la regulacin de orgenes
de replicacin.
Podra discutirse que las reglas de la fase S se establecen de hecho durante la formacin de
cromosomas mitticos en el ciclo celular anterior.
I.

La mitosis podra ser un importante primer paso para re-establecer el cdigo de origen
de una clula.

II.

Durante G1 se activen los orgenes de replicacin y adaptados para el programa de la

expresin gnica.

Perspectivas
La posibilidad de que organismos multicelulares reprogramen
sus orgenes en cada ciclo celular podra contribuir a organizar
cromosomas para diferentes programas de transcripcin en
diferentes linajes de clulas durante el desarrollo y la
diferenciacin.
Los orgenes de replicacin del DNA podran ser mucho ms
que slo sitios de entrada para fbricas de replicacin; podran
ser elementos regulatorios esenciales que organizan el
genoma de acuerdo al destino de la clula.

Bibliografa
Eaton, M. L., Galani, K., Kang, S., Bell, S. P. & MacAlpine, D. M. Conserved
nucleosome positioning defines replication origins. Genes Dev. 24, 748753
(2010).