Obtencin de biomasa y exopolisacridos de

Humphreya coffeata en cultivo sumergido

Investigan:
Sara Gallego Giraldo
Gisell Garca Giraldo

Asesora:
Luz Deisy Marn Palacio
Grupo de Investigacin en Procesos Ambientales y
Biotecnolgicos

Contenido
1. Introduccin
1.1. Antecedentes
2. Diseo Metodolgico
3. Resultados y Discusiones
3.1 Cintica de crecimiento celular
3.2 Produccin de exopolisacridos (EPS)
3.3 Escalamiento del proceso
4. Conclusiones
5. Recomendaciones
6. Bibliografa

Introduccin

Fuente: FAO (2008)

Del
Del total
total de
de especies
especies de
de hongos
hongos menos
menos de
de un
un 10%
10% son
son conocidos.
conocidos. Muy
Muy
pocos
han
sido
estudiados
desde
el
punto
de
vista
comercial,
y
menos
de
pocos han sido estudiados desde el punto de vista comercial, y menos de 25
25
especies
especies son
son aceptados
aceptados como
como alimento
alimento (Tang
(Tang et
et al.,
al., 2007)
2007)..

Phylum Basidiomycota
Representado por ms de 30.000 especies.
Productores de una amplia gama de metabolitos
biolgicamente activos con actividad antitumoral e
inmunolgica, hasta agentes antimicrobianos, antifngicos,
antivirales, citostticos, enzimas, reguladores de crecimiento
y aromas (Brizuela et al., 1998).

Gnero Ganoderma
Usados en la medicina tradicional China (Zhong y Tang, 2004).
Los compuestos qumicos con mayores propiedades
bioactivas son los triterpenoides y polisacridos (Berovi et al.,
2003).

Polisacridos: pertenecen al grupo de los -Glucanos, con

enlaces -(1,3) en la cadena principal y puntos de
ramificacin -(1,6) (Tang et al., 2007).

Ganoderma
lucidum lucidum
Ganoderma
Crece en latitudes clidas del planeta, ms en los climas
subtropicales que en los templados (Santaf y Zuluaga, 2007).
Cultivo en sustratos slidos, medio lquido estacionario o
cultivo sumergido.
Resultados promisorios para tratamiento del cncer y otras
enfermedades como hepatitis, bronquitis crnica e
www.google.com/imageneshipertensin (Xu et al., 2008).

Humphreya coffeata
Clasificacin
cientfica
Reino
Filo
Clase
Orden
Familia
Gnero
Especie

Fungi
Basidiomycota
Basidiomycetes
Ganodermatales
Ganodermataceae
Humphreya
coffeata

(Cybernome, 2008)

Hongo nativo
Ubicacin: Tierra Alta (Crdoba)
Similaridad taxonmica con G.
lucidum
Reportes:
www.google.com/imagenes

1. Clasificacin taxonmica
2. Investigacin Porras et al
(2009)

Cultivo del cuerpo

fructfero
Tiempo:
Tiempo: 3-5
3-5 meses
meses

Elevada
Elevada mano
mano de
de
obra
obra

Dificultad
Dificultad en
en el
el
control
control de
de
www.google.com/imagenes

calidad
calidad

Temperatura
Temperatura
Agitacin
Agitacin
Aireacin
Aireacin
Oxgeno disuelto
disuelto
Oxgeno
Tamao yy edad
edad del
del
Tamao
inculo
inculo

Cultivo sumergido

Composicin

Composicin
medio
medio

Tiempo: 2-3
2-3 semanas
semanas
Tiempo:
Poca mano
mano de
de obra
obra
Poca

del
del

Calidad del
del sustrato
sustrato
Calidad

Condiciones
Condiciones
controladas
controladas
Proceso eficiente
eficiente
Proceso

pH
pH

Aditivos
Aditivos
Hincapi et al (2005)

Entre
otros

Parmetro

Reologa
Reologa

Cultivo
Cultivo
sumergido
sumergido
de
de hongos
hongos

Dependencia/E
fecto
Concentracin
Concentracin
celular
celular
Cambios
Cambios
morfolgicos
morfolgicos
Produccin de
de EPS
EPS
Produccin

Agitacin
Agitacin

Transferencia M&E
M&E
Transferencia

Aireacin
Aireacin

Oxgeno disuelto
disuelto
Oxgeno
Geometra equipo
equipo
Geometra

Transferencia
Transferencia
de oxgeno
oxgeno
de

Escalamient
Escalamient
o
o de
de
bioprocesos
bioprocesos

Composicin
Composicin
medio
medio
Clulas
Clulas

Consecuenc
ias
Limitacin
de
--Limitacin
de
O2
O2
Eliminacin del
del
--Eliminacin
CO2 -Mezclado
-Mezclado
CO2
cultivo
cultivo
Fuerza de
de
Fuerza
cizallamiento
cizallamiento
Absorcin de
de
Absorcin
nutrientes
nutrientes

Crecimiento yy
Crecimiento
produccin de
de
produccin
metabolitos
metabolitos

Criterio
Criterio
cultivos
cultivos
aerobios
aerobios

Kla
Kla

Antecedentes
Autor

Microorgani
smo

Escala

Sustrato

Condicion
es cultivo

Resultados

Porras et al.
(2009)

Humphreya
coffeata

Erlenmeye
rs

Lactosa (50
g/L)

120 rpm
30 C
pH inicial 4.5

Biomasa: 15.5
g/L
EPS: 6.9 g/L

Fang y Zhong
(2002)

Ganoderma
lucidum

Erlenmeye
rs

Glucosa (50
g/L)

120 rpm
30 C
pH inicial 5.5

Biomasa: 16.7
g/L
EPS: 0.85 g/L

STR 5 L

Glucosa (30
g/L)

166 rpm
1.66 vvm
25 C
pH inicial 5.5

Biomasa: 16. 8
g/L
EPS: 5.26 g/L

Lactosa (30
g/L)

100 rpm
0.5 1.5 vvm
30 C
pH inicial 5.5

Biomasa: 12 g/L
( 1.5 vvm)
EPS: 10 g/L
(0.5 vvm)

Glucosa (30
g/L)

50 400 rpm
2 vvm
28 C
pH 6.0

Biomasa: 21.06
g/L
(300 rpm)
EPS: 2.33 g/L
(150 rpm)

Lactosa (35
g/L)

200 rpm
0.22 3.5 vvm
30 C
pH inicial 5.5

Lee et al.
(2004)

Babitskaya et
al. (2005)

Xu et al.
(2006)

Tang y Zhong
(2003)

Grifola frondosa

Ganoderma
lucidum

Paecilomyces
tenuipes

Ganoderma
lucidum

STR 10 L

STR 3 L

STR 3.5 L

Biomasa: 15.62
g/L (Kla 78.2 h-1)
EPS: 0.92 g/L
(Kla 96 h-1)

Objetivos
GENERAL:
OBJETIVOOBJETIVO
GENERAL:
Evaluar el efecto de la aireacin y velocidad de agitacin en
Evaluar ella produccin
efecto
de yla
aireacin
y velocidad
de biomasa
exopolisacridos
de un cultivo
de Humphreya coffeata en un biorreactor de 2 L, con el fin
de agitacin
en
la produccin
de
biomasa y
de realizar
el escalamiento
del bioproceso desde el
nivel de
laboratorio a escala piloto.
exopolisacridos de un cultivo de Humphreya
coffeata
en un
biorreactor
dede
2 L,Humphreya
con el fin
1.
Evaluar
crecimiento
1. Evaluar
el crecimientoel
de Humphreya
coffeata con
variacin en el flujo de aire y velocidad de agitacin
de
realizar
elvariacin
escalamiento
coffeata
con
en el del
flujobioproceso
de aire y
mediante la medicin
de biomasa
por peso seco
desde el nivel
de laboratorio
a escala
piloto.
velocidad
de agitacin
mediante
la medicin
2. Evaluar el efecto de la aireacin y velocidad de
2.biomasa
Evaluarpor
el peso
efecto
la aireacin
y
agitacin
en de
la produccin
de exopolisacridos
de
seco.
determinando la concentracin de carbohidratos totales.
velocidad de agitacin
en la produccin de
3.
Escalar el bioproceso
a planta piloto,
exopolisacridos
determinando
la
3.
Escalar el bioproceso a planta piloto, teniendo
como
criterio el coeficiente volumtrico de transferencia de
teniendo
como
criterio el totales.
coeficiente
concentracin
de carbohidratos
masa
K a.
volumtrico de transferencia de masa KLa.
L

Diseo metodolgico
Inculo

Activacin en
PDA

H. coffeata

Discos de agar

7Diseo
das, 30 C de
Diseo
de

Experime
nto No.
1
2

Yxs

mx

1.8 L Medio

Agitacin
(rpm)

Aireacin
(vvm)

100

0.5

100
DNS

1.5

Biomasa:
Biomasa: Peso
Peso seco
seco

Azcares
Azcares reductores:
reductores:
DNS

EPS:
Fenol-cido
EPS:200
Fenol-cido

0.5

sulfrico
sulfrico
200

1.5

Protena
total:
Determinacin
del
Protena
total: Lowry
Lowry 1.0
Determinacin
del Kla
Kla
150

Parmetros
Parmetros
cinticos
cinticos
Px

experimentos
experimentos

50 mL
medio
7 das
30 C
140 rpm

Gompertz
Sigmoide

Temperatura:
30 C
pH inicial: 4.5

Exp
No.

Agitaci
n
(rpm)

Aireaci
n
(vvm)

100

0.5

100

1.5

200

0.5

200

1.5

150

1.0

Resultados
Cintica de crecimiento celular

14.71g/L

14.65 g/L

7.23g/L
5.46 g/L

El microorganismo durante su
crecimiento se adhera a las
7.69 g/L
partes del biorreactor. Inclusive
a
partir
del
da
4
de
fermentacin no era posible
visualizar a travs de la mirilla
del equipo
Da 1

Da 3

(a) 100 rpm, (b) 200 rpm, (c) 150 rpm

Da 6

Da 9

Da 10

Produccin total
Productividad
de de
biomasa
biomasa
(Px)

86%

245%

b
b

Agitacin
(rpm)
Agitacin
100
(rpm)

Aireacin
(vvm)
Aireacin
0.5
(vvm)

38 %

100
100
100
200
200

0.5
1.5
1.5
0.5
0.5

292 %

200

1.5
1.5

150
150

1.0
1.0

b
112%69 %

a
b

Xfinal (g/L)
Px 22.49
(g/Ld)

1.25
2.249
28.12
0.45
2.812
20.93
2.093
2.12
28.90
2.890
0.42
2.763
27.63
0.75

Productividad de biomasa (Px)

Medias
Medias yy 95.0
95.0 Porcentajes
Porcentajes Intervalos
Intervalos LSD
LSD

Medias
Medias yy 95.0
95.0 Porcentajes
Porcentajes Intervalos
Intervalos LSD
LSD
3.3
3.3
69 %

3.1
3.1
2.7
2.7

38 %

2.5
2.5
2.3
2.3
2.1
2.1

P-value
0.7365

100
100

150
150

Agitacin
Agitacin

200
200

292 %

Px
Px

Px
Px

2.9
2.9

33
Agitacin
2.8
2.8(rpm)

Aireacin
(vvm)

Px (g/Ld)

2.6
2.6

100

0.5

2.249

2.4
2.4

100

1.5

2.812

2.2
2.2

200

0.5

2.093 P-value

22

200
150

0.5
0.5

11.5
1

Aireacin
Aireacin
1.0

1.5
1.5

2.890
2.763

0.0023

Modelacin de la cintica de crecimiento

Experimental

Gompertz

Sigmoide

Gomper
Gomper
tz
tz

Sigmoi
Sigmoi
de
de

Sigmoi
Sigmoi
de
de

Error estndar
estndar
Error
-1

0.413 d-1

0.307 d-1

0.240 d

100
rpm -0.5
-1.5
100
150 rpm
200
-1.0 vvm

Sigmoi
Sigmoi
de
de

Sigmoi
Sigmoi
de
de
Sigmoi
Sigmoi
de
de

0.277 d-1

Parmet
ro

Gompert
z

Sigmoid
e

0,2907
20,56
21,27
14,73
1,032

0,2503
0,6052
2,228
5,537
4,623

0,3307
b
17,82
28,46
19,27
1,481
Sigmoi 0,5918
cSigmoi
10,34
18,11
13,26
2,477
de
de
Iteracio
12
13
8
nes

0,4439
11,08
8,648
1,377
3,88

0.269 d-1

0,3623
1,182
2,934
2,582
1,08
9
6
8

329%

Estas diferencias sugieren que

11.4%

227%

H.

coffeata

presenta

un

crecimiento ms lento respecto

a lo que puede alcanzar G.
lucidum,

las

condiciones

trabajadas
Otros parmetros
parmetros
Otros

Agitaci
Variable
n (rpm)

100
200

150

X (g)
S (g)
Yxs (g/g)
X (g)
S (g)
Yxs (g/g)
X (g)
S (g)
Yxs (g/g)

Aireacin
(vvm)
0.5

1.5

41.58
44.03
0.944
38.51
49.98
0.771

52.08
58.96
0.883
53.08
60.78
0.873

1.0
51.08
54.64
0.935

En
general,
el
rendimiento
observado
de
sustrato
en
biomasa (Yxs) es similar en todas
las condiciones de fermentacin.
Para el ensayo que se obtuvo la
mayor cantidad de biomasa total,
el consumo de sustrato fue
superior respecto a las dems
condiciones, reflejado en el valor
de S.

Produccin dede
Productividad
exopolisacridos
EPS (Pexo)
(EPS)
Agitaci
n (rpm)
100

Aireaci
n (vvm)
0.5

100

1.5
290%

200

0.5

200

1.5

150

1.0

EPSmx
(g/L)
-1.053
0.151
538%
0.292
0.292
0.234
0.192
0.338
0.288

Tiemp
o (d)
--

Agitacin
(rpm)

Aireacin
(vvm)

268%

100

0.5

407%

100

1.5

10
362%

9
7
8

Pexo
(g/Ld)
--

0.1053
555%

200

0.5

200

1.5

0.0334

150

1.0

0.0423

0.0324

Productividad de EPS (Pexo)

Medias
Medias yy 95.0
95.0 Porcentajes
Porcentajes Intervalos
Intervalos LSD
LSD

Medias
Medias yy 95.0
95.0 Porcentajes
Porcentajes Intervalos
Intervalos LSD
LSD

0.13
0.13

0.13
0.13

Agitacin

290%

538%

0.01
0.01
-0.02
-0.02

100
100

150
150

Agitacin
Agitacin

200
200

362%

P-value
0.8629

Pexo
Pexo

Pexo
Pexo

0.07
0.07
0.04
0.04

Aireacin
(vvm)

Pexo
(g/Ld)

100

0.5

--

100

1.5

0.1053

200

0.5

0.0324P-value

0.1
0.1(rpm)

0.1
0.1

0.07
0.07
0.04
0.04
0.01
0.01
-0.02
-0.02

200
150

0.5
0.5

11
1.5

Aireacin
Aireacin
1.0

0.2806

1.5
1.5

0.0334
0.0423

Escalamiento
Parmetr Laboratori
o
o
V (m3)
D (m)
Di (m)
ni (rpm)
vvm
Q (m3/s )
vs (m/s)

2x10-3
0.124
0.045
200
1.5
5x10-5
4.42x10-3

Piloto

Otros autores

50x10-3
0.35
0.13
88
0.66
5.5x10-4
5.69x10-3

30 x10-3
0.306
0.102
7.5x10-4
6.6x10-3

40x10-3
0.332
0.124
0.902
6.4x10-4
7.4x10-3

Resultados del proceso de

escalamiento
Parmetro
2L
50 L
KLa (s-1)
0.0067
0.0067

Mxima
de
P/V (kW/m3produccin
)
0.029
biomasa
NiDi (rpm*s)
0.15
200
rpm 1.5
vvm
P (W)
0.0586
Rei

6500.64

KLa mtodo dinmico:

0.0016 s-1

0.021

1.37 veces

0.20

1.3 veces

1.0679

18 veces

24480

Rgimen turbulento

Valor muy bajo,

posibles
deficiencias en el
mezclado.
Posible
causa:
Equipo base para
escalado con bajo
Kla.

Recomendacin:
otro
criterio
escalamiento.
Puerta y Zapata
(2006)

de

Conclusiones
La
La produccin
produccin de
de biomasa
biomasa aa partir
partir de
de una
una cepa
cepa de
de H.
H. coffeata
coffeata se
se favoreci
favoreci por
por el
el incremento
incremento
de
de la
la aireacin,
aireacin, presentndose
presentndose diferencias
diferencias significativas
significativas entre
entre los
los niveles
niveles trabajados.
trabajados. La
La
combinacin
combinacin de
de aireacin
aireacin yy agitacin
agitacin que
que arroj
arroj el
el mximo
mximo valor
valor de
de biomasa
biomasa celular
celular fue
fue 1.5
1.5
vvm
vvm yy 200
200 rpm;
rpm; con
con una
una produccin
produccin total
total de
de 28.90
28.90
0.42
0.42 g/L.
g/L. As
As mismo,
mismo, la
la mxima
mxima
productividad
productividad de
de biomasa
biomasa se
se obtuvo
obtuvo bajo
bajo estas
estas condiciones
condiciones con
con un
un valor
valor de
de 2.89
2.89
0.042
0.042 g/Ld.
g/Ld.
La
La cintica
cintica de
de crecimiento
crecimiento fue
fue ajustada
ajustada satisfactoriamente
satisfactoriamente al
al modelo
modelo cintico
cintico Sigmoide
Sigmoide para
para
todos
todos los
los ensayos,
ensayos, excepto
excepto para
para la
la fermentacin
fermentacin aa 1.5
1.5 vvm
vvm yy 100
100 rpm,
rpm, para
para la
la cual
cual la
la ecuacin
ecuacin
de
de Gompertz
Gompertz obtuvo
obtuvo un
un mejor
mejor ajuste.
ajuste. Bajo
Bajo dichas
dichas condiciones
condiciones se
se obtuvo
obtuvo la
la mxima
mxima velocidad
velocidad
de
de crecimiento
crecimiento con
con un
un valor
valor de
de 0.413
0.413 d-1.
d-1.
La
La variacin
variacin de
de la
la velocidad
velocidad de
de agitacin
agitacin yy tasa
tasa de
de aireacin
aireacin no
no present
present diferencias
diferencias
significativas
significativas para
para la
la obtencin
obtencin de
de exopolisacridos
exopolisacridos (EPS).
(EPS). La
La produccin
produccin mxima
mxima fue
fue de
de 1.053
1.053

0.151
0.151 g/L,
g/L, aa una
una velocidad
velocidad de
de 100
100 rpm
rpm yy aireacin
aireacin de
de 1.5
1.5 vvm.
vvm. Igualmente
Igualmente bajo
bajo estas
estas
condiciones
condiciones se
se obtuvo
obtuvo la
la mxima
mxima productividad
productividad con
con un
un valor
valor de
de 0.105
0.105 g/Ld.
g/Ld.
El
El escalado
escalado de
de un
un volumen
volumen de
de 22 LL aa 50
50 LL aa partir
partir de
de condiciones
condiciones predeterminadas
predeterminadas que
que
favorecieron
favorecieron la
la produccin
produccin de
de biomasa
biomasa (200
(200 rpm
rpm 1.5
1.5 vvm)
vvm) yy utilizando
utilizando como
como criterio
criterio el
el KKLLa,
a,
arroj
arroj que
que la
la P/V
P/V disminuira
disminuira 1.37
1.37 veces,
veces, la
la PP aumentara
aumentara 18
18 veces
veces yy la
la nni i disminuira
disminuira 2.3
2.3 veces.
veces.
Adems,
Adems, por
por el
el valor
valor arrojado
arrojado para
para el
el nmero
nmero de
de Reynolds
Reynolds se
se pudo
pudo determinar
determinar que
que el
el sistema
sistema
se
se encontrara
encontrara en
en rgimen
rgimen turbulento.
turbulento.

Recomendaciones
Evaluar la produccin de biomasa y EPS a partir de H. coffeata en un
biorreactor de diferente configuracin ya sea con cambios en la ubicacin
y forma de los bafles o combinacin de impulsores para la agitacin. Esto
con el fin de evitar o disminuir la adhesin del microorganismo a las partes
del equipo lo que dificulta la cuantificacin del producto de inters.
Evaluar el efecto de la presencia de impulsores que desarrollan un flujo
axial en un cultivo de H. coffeata, como es el caso de la turbina de paletas
con un ngulo de 45 recomendada por diversos autores para mejorar la
transferencia de oxgeno en fermentaciones miceliales viscosas.
Evaluar la produccin de EPS en diferentes clases de biorreactores como
son el Airlift y las columnas de burbujeo que carecen de partes mecnicas
para la agitacin, lo que puede evitar la adhesin del microorganismo al
mismo y mejorar la expresin de los metabolitos en el medio de cultivo.
Determinar el consumo de oxgeno de H. coffeata en el biorreactor bajo las
condiciones trabajadas.

Recomendaciones
Realizar controles de otras variables en el cultivo de H. coffeata tales como
pH, que influyen en la produccin de los metabolitos de inters.
Disear un sistema para la toma de muestra que permita obtener datos
representativos en la cuantificacin de biomasa.
Evaluar la produccin de otros metabolitos de inters tales como cidos
ganodericos (GA) e intrapolisacridos (IPS).

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