PCR Y PCR MLTIPLEX

OBJETIVO:Analizar y comprender la tcnica de PCR as como

los parmetros que la afectan, ciclo, ventajas y desventajas
de la misma.
Princip
al
Herra
mient
a
Diagn
stica

Kary
Mullis

P
C
R

Gran valor

Microbiologa
Clnica

Versatili
dad

Sensibilidad
Rapidez
Especificidad
Prevencin/Tratamiento

Genotipificacin
Adaptili
dad

Aplicabi
lidad

Anlisis de enf genticas y oncolgicas

Amplificacin y modificacin fragmentos ADN
Anlisis especmenes ambientales
Marcadores genticos (A.F, P.P, E.E.G)

Variantes del
mtodo

Estandarizar

Optimizar

Amplificar simultneamente
diferentes secuencias diana

PCR
multiple
x

Influenciada:
-Mezcla rxn
-Rgimen de ciclaje
-ADN polimerasa

Planificar

Optimizar
protocolos
Especificid
ad

Rendimien
to

Fidelidad

Eficiencia

PARMETROS QUE INFLUYEN EN LA PCR

IONES
SOLUCIN TAMPN
DESOXIRRIBONUCLETIDOS
DIVALENTES Y
Por lo general incluye Tris-HCl,
MONOVALENTE
Rango ptimo: [ ] entre 0.5 y
KCl, MgCl.
Rango ptimo: [ ] 0.2 a 1mM.
S.
2.5mM.
Adyuvantes ms empleados:
[dNTPs] Disminuye la
actividad de la enzima.
[dNTPs] Afectan
especificidad y fidelidad

[Mg] Tiende a producir

amplificaciones inespecficas.
[Mg] Bajo rendimiento.
Ion monovalente: K

Dimetilsulfxido (DMSO):
estructuras 2 del ADN.
Tween 20
Tritn X-100

PARMETROS QUE INFLUYEN EN LA PCR

PRIMERS

18 a 22
nucletidos. (4075% GC).
Rango ptimo: [ ]
0.1 a 0.5M.
Primers
productos
inespecficos.
Primers Bajo
rendimiento

ADN
POLIMERASA
Temperatura
ptima: 70-72C
Calidad
suficiente que
evite prdidas
en las
caractersticas.

ADN
TEMPLADO
Cantidades
variables a
utilizar.
Puede utilizarse
ADNc

AGUA
Se requiere que
sea
desionizada,
libre de sales.
Libre de DNAsas
y RNAsas.

CICLO DE PCR

Desnaturalizaci
n

Separacin de las
cadenas de ADN.
Inicio de la sntesis
de la nueva cadena.
94C

Alineamien
to

30 a 40 veces

Unin del primer a la

cadena ADN, por
complementariedad
de bases. Entre 40 y
70C

Extensi
n
Proceso en el cual se
van a amplificar los
nucletidos para ir
alargando la cadena.

Ultimo alargamiento por 5 min. a 72C.

PCR multiplex
Anlisis simultneo
Marcadores mltiples
Usos: deleciones,
polimorfismos

VENTAJAS

DESVENTAJA
S

Anlisis
varios genes

Limitado
pares de
primers

Eficiente

Optimizacin

Velocidad

Validacin

AMPLIFICACIONES PREFERENCIALES DE
PCRm
DERIVA

SELECCIN

Fluctuaciones
Fluctuaciones en
en la
la interaccin
interaccin de
de
los
los reactivos
reactivos durante
durante el
el ciclaje.
ciclaje.

Propiedades
Propiedades inherentes
inherentes al
al blanco
blanco
favorecen
favorecen amplificaciones
amplificaciones
especificas.
especificas.

Bajas
Bajas concentraciones
concentraciones de
de ADN
ADN
molde.
molde.
Concentraciones
Concentraciones iniciales
iniciales muy
muy
bajas
del
amplificado.
bajas del amplificado.

Primers
Primers
Contenido
Contenido GC
GC
Eficiencia
Eficiencia del
del diseo
diseo
Numero
Numero de
de pares
pares empleados
empleados por
por
reaccin.
reaccin.

Rampas
Rampas trmicas
trmicas desiguales.
desiguales.

Proceso inevitable.

Abordaje racional en diseo y

seleccin.

Consideraciones generales para la

aplicacin de mPCR
Seleccin: Segn el origen de la muestra
Evaluada utilizando diluciones seriadas
Uso de controles

CONCLUSIONES
La mPCR ha revolucionado la microbiologa humana , por su confiabilidad
y acertado uso como alternativa diagnostica para algunos de los
principales patgenos causales de enfermedades en humanos.
La mPCR posibilita la deteccin de infecciones insipientes as como de
infecciones asintomticas, puede detectar infecciones o transmisiones
congnitas por hemoparsitos y de esta manera ampliar el conocimiento
y entendimiento sobre la dinmica de infecciones mixtas, lo que nos lleva
a un mejor control y profilaxis.

 Su rentabilidad se extiende desde la deteccin de microorganismos

independientes de cultivo, sospecha de carga parasitaria muy baja,
pruebas diagnosticas muy rpidas , deteccin de parasitemias mixtas o
tipificacin de cepas virulentas.
En ocasiones es necesario realizar modificaciones a la metodologa de la
mPCR con el fin de incrementar su uso y aplicacin.
La mPCR ha sido crucial por la reemergencia de algunas enfermedades, lo
que hace necesario el diseo de nuevas herramientas de diagnostico que
sean sensibles, rpidas y especificas

REFERENCIAS
PCR y PCR-Mltiple: parmetros crticos y protocolo de estandarizacin ,
Ana Maria Bolivar, , Agustina Rojas, Pablo Garcia-Lugo, Mrida Venezuela,
2013
James D, Scmidt A, Wall E, Green M & Masri A (2003) Reliable detection
and identification of genetically modified maize, soybean and canola by
multiplex PCR analysis. J. Agric. Food Chem. 51: 5829-34.
Mndez-lvarez S & Prez-Roth E (2004) La PCR mltiple en microbiologa
clnica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 22: 183-92.
Ecologa molecular, Luis Eguiarte, Valeria Souza, Xitlali Aguirre, Mxico,
2007, 1 Edicin, Captulo 17